Name: confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells
Uploaded: 2022-03-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells at JoVE.com

We danken de NINDS Intramurale Onderzoeksprogramma's (ZIA NS003009-13 en ZIA NS003105-08) voor het ondersteunen van dit werk.

OPMERKING: De procedure voor het gebruik van dieren volgde de NIH-richtlijnen en werd goedgekeurd door de NIH Animal Care and Use Committee.
1. Boviene chromaffine celcultuur
<ol><li>Bereid Locke's oplossing (tabel 1) en autoclaafgereedschappen 1 dag vóór de chromaffinecelkweek.</li>
	<li>Verkrijg runderbijnieren uit een lokaal slachthuis op de cultuurdag en houd ze ondergedompeld in ijskoude Locke's oplossing voordat ze worden gedissectie. OPMERKING: B...

<ol>
	<li>Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pores+and+their+control+of+neurotransmitter+and+hormone+release.">Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release.</a> Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).</li><li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion.">Viral membrane fusion.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).</li><li>Zhao, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemi-fused+structure+mediates+and+controls+fusion+and+fission+in+live+cells.">Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells.</a> Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).</li><li>Klyachko, V. A., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitance+steps+and+fusion+pores+of+small+and+large-dense-core+vesicles+in+nerve+terminals.">Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals.</a> Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).</li><li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Chiang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-fusion+structural+changes+and+their+roles+in+exocytosis+and+endocytosis+of+dense-core+vesicles.">Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles.</a> Nature Communications. 5, 3356 (2014).</li><li>Sharma, S., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fusion+pore,+60+years+after+the+first+cartoon.">The fusion pore, 60 years after the first cartoon.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).</li><li>Jorgacevski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+tuning+of+vesicle+merger+and+fusion+pore+properties.">Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).</li><li>Rituper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+cholesterol+controls+exocytotic+fusion+pore.">Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore.</a> Cell Calcium. 101, 102503 (2021).</li><li>Gucek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+negative+SNARE+peptides+stabilize+the+fusion+pore+in+a+narrow,+release-unproductive+state.">Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).</li><li>Grabner, C. P., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+synaptic+vesicles+mediate+stimulated+exocytosis+from+cochlear+inner+hair+cells.">Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).</li><li>Wen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+provides+membrane+tension+to+merge+fusing+vesicles+into+the+plasma+membrane.">Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane.</a> Nature Communications. 7, 12604 (2016).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Membrane+Pore+in+Live+Cells+Reveals+a+Dynamic-Pore+Theory+Governing+Fusion+and+Endocytosis.">Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis.</a> Cell. 173 (4), 934-945 (2018).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+Shrinking+and+Enlargement+Play+Opposing+Roles+in+the+Release+of+Exocytotic+Contents.">Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents.</a> Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).</li><li>Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+sequential+compound+fusion+and+kiss-and-run+in+live+excitable+cells.">Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+control+of+kiss-and-run+and+vesicular+reuse+probed+with+single+nanoparticles.">The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles.</a> Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+features+between+chromaffin+and+neural+progenitor+cells.">Common features between chromaffin and neural progenitor cells.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).</li><li>Bornstein, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromaffin+cells:+the+peripheral+brain.">Chromaffin cells: the peripheral brain.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).</li><li>Park, Y., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+plasticity+of+small+synaptic+vesicle+(SSV)+and+large+dense-core+vesicle+(LDCV)+exocytosis.">Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis.</a> Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).</li><li>Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+Chromaffin+Cells:+Culture+and+Fluorescence+Assay+for+Secretion.">Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion.</a> Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+Omega-profile+closure+and+kiss-and-run+mediate+endocytosis+and+diverse+endocytic+modes+in+neuroendocrine+chromaffin+cells.">Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells.</a> Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).</li><li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells.">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).</li><li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Tension+Inhibits+Rapid+and+Slow+Endocytosis+in+Secretory+Cells.">Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells.</a> Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).</li><li>Revelo, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+probe+for+super-resolution+imaging+of+membranes+elucidates+trafficking+pathways.">A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways.</a> Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).</li><li>Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX-box+protein,+prenylation+process+and+carcinogenesis.">CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis.</a> American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+vesicles+from+frog+neuromuscular+junctions+by+prolonged+tetanic+stimulation.">Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation.</a> Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).</li><li>Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MINFLUX+nanometer-scale+3D+imaging+and+microsecond-range+tracking+on+a+common+fluorescence+microscope.">MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope.</a> Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).</li></ol>

Een confocale microscopische beeldvormingsmethode wordt beschreven om de dynamiek van fusieporie en zenderafgifte te detecteren, evenals drie fusiemodi, close-fusion, stay-fusion en shrink-fusion in bovine adrenal chromaffin cells 4,24. Een elektrofysiologische methode om de cel te depolariseren en daarbij exo- en endocytose op te roepen wordt beschreven. Systematische confocale beeldverwerking biedt informatie over verschillende vormen van poriegedrag voor fusie...

Membraanfusie bemiddelt veel biologische functies, waaronder synaptische transmissie, bloedglucosehomeostase, immuunrespons en virale entry 1,2,3. Exocytose, waarbij blaasjesfusie op het plasmamembraan betrokken is, geeft neurotransmitters en hormonen vrij om veel belangrijke functies te bereiken, zoals neuronale netwerkactiviteiten. Fusie opent een porie om vesiculaire inhoud vrij te maken, waarna de porie kan sluiten om het fuserende blaasje op te halen, dat kiss-and-run 1,4 wordt genoemd. Zowel onomkeerbare als omkeerbare fusieporieopening kan worden gemeten met celgebonden capaciteitsregistraties in combinatie met fusieporiegeleidingsopnamen van enkelvoudige blaasjesfusie.
Dit wordt vaak geïnterpreteerd als een weerspiegeling van volledige collapsfusie, waarbij de fusie wordt verwijd tot het afvlakken van het fuserende blaasje, en kiss-and-run, waarbij fusieporieopening en -sluiting betrokken zijn, respectievelijk 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Recente confocale en gestimuleerde emissiedepletie (STED) beeldvormingsstudies in chromaffinecellen hebben direct waargenomen dat fusieporieopening en -sluiting (kiss-and-run, ook wel close-fusion genoemd), fusieporieopening die lange tijd een Ω-vorm met een open porie handhaaft, genaamd stay-fusion, en krimpen van het fuserende blaasje totdat het volledig samensmelt met het plasmamembraan, dat volledige fusie vervangt voor het samenvoegen van fuserende blaasjes met het plasmamembraan4, 8,14,15,16,17.
In neuronen zijn het openen en sluiten van fusieporiën gedetecteerd met beeldvorming die de afgifte laat zien van quantum dots die vooraf zijn geladen in blaasjes die groter zijn dan de fusieporie en met fusieporiegeleidingsmetingen aan het afgiftevlak van zenuwterminals 5,18,19. Bijnierchromaffinecellen worden veel gebruikt als model voor de studie van exo- en endocytose20,21. Hoewel chromaffinecellen grote blaasjes met dichte kern bevatten, terwijl synapsen kleine synaptische blaasjes bevatten, zijn de exocytose- en endocytose-eiwitten in chromaffinecellen en synapsen vrij analoog 10,11,12,20,21,22,23.
Hier wordt een methode beschreven om deze drie fusiemodi te meten met behulp van een confocale beeldvormingsmethode in combinatie met elektrofysiologie in boviene bijnierchromaffinecellen (figuur 1). Deze methode omvat het laden van fluorescerende valse neurotransmitters (FFN511) in blaasjes om exocytose te detecteren; toevoeging van Atto 655 (A655) in de badoplossing om het door fusie gegenereerde Ω-vormige profiel te vullen, en etikettering van het plasmamembraan met het PH-domein van fosfolipase C δ (PH), dat bindt aan PtdIns(4,5)P2 op het plasmamembraan 8,15,24. Fusieporiëndynamiek kan worden gedetecteerd door veranderingen in verschillende fluorescerende intensiteiten. Hoewel beschreven voor chromaffinecellen, kan het principe van deze hier beschreven methode op grote schaal worden toegepast op veel secretoire cellen ver buiten chromaffinecellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td>ATP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto 655</td>
			<td>ATTO-TEC GmbH</td>
			<td>AD 655-21</td>
			<td>Atto dye to label bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Nucleofector for Primary Neurons</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VSPI-1003</td>
			<td>Electroporation transfection buffer along with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boroscilicate capillary glass pipette</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0795</td>
			<td>Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride 2 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-130-721</td>
			<td>Reagent for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>Material for filtering chromaffin cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>232041</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.1214E+10</td>
			<td>Enzyme for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-14-Laminin</td>
			<td>GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11885092</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Nucleofector</td>
			<td>Amaxa Biosystems</td>
			<td>Nucleofector II</td>
			<td>Transfect plasmids into cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFN511</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120331</td>
			<td>Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td>GTP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>WaveMetrics</td>
			<td>Igor pro</td>
			<td>Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Confocal software for imaging data collection and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Confocal microscope for imaging data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49449-100G</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Lock-in</td>
			<td>Software for capacitance recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride 1 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3120</td>
			<td>Counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mNG(mNeonGreen)</td>
			<td>Allele Biotechnology</td>
			<td>ABP-FP-MNEONSB</td>
			<td>Template for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh filtering screen 100 micron</td>
			<td>EIKO filtering co</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>Material for filtering medulla suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp EPC-10</td>
			<td>Heka</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td>Amplifier for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH-EGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #51407</td>
			<td>Backbone for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Make pipettes for patch-clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5404-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse software</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Pulse</td>
			<td>Software for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1943/QR-40LP</td>
			<td>coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution, bath solution and internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hot plate</td>
			<td>Barnsted/Thermolyne</td>
			<td>type 10100</td>
			<td>Heater for pipette coating with wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 30 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302832</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2265-100G</td>
			<td>TEA for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9253-5G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid</td>
			<td>Leica</td>
			<td>195371-10-9</td>
			<td>Leica confocal mounting oil</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells

Dynamische fusieporieopening en -sluiting bemiddelen exocytose en endocytose en bepalen hun kinetiek. Hier wordt in detail gedemonstreerd hoe confocale microscopie werd gebruikt in combinatie met patch-clamp-opname om drie fusiemodi in primaire cultuur bovine adrenal chromaffine cellen te detecteren. De drie fusiemodi omvatten 1) close-fusion (ook wel kiss-and-run genoemd), waarbij fusieporieopening en -sluiting betrokken is, 2) stay-fusion, waarbij fusieporie wordt geopend en de geopende porie wordt gehandhaafd, en 3) krimpfusie, waarbij het fusie-gegenereerde Ω-vormige profiel krimpt totdat het volledig samensmelt bij het plasmamembraan.
Om deze fusiemodi te detecteren, werd het plasmamembraan gelabeld door mNeonGreen te overexpresseren dat verbonden is met het PH-domein van fosfolipase C δ (PH-mNG), dat bindt aan fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat (PtdIns(4,5)P2) in de cytosolgerichte folder van het plasmamembraan; blaasjes werden geladen met de fluorescerende valse neurotransmitter FFN511 om vesiculaire inhoudsafgifte te detecteren; en Atto 655 werd opgenomen in de badoplossing om fusieporiënsluiting te detecteren. Deze drie fluorescerende sondes werden gelijktijdig in beeld gebracht met ~ 20-90 ms per frame in levende chromaffinecellen om fusieporieopening, inhoudsafgifte, fusieporiesluiting en veranderingen in de grootte van blaasjes te detecteren. De analysemethode wordt beschreven om drie fusiemodi van deze fluorescentiemetingen te onderscheiden. De hier beschreven methode kan in principe van toepassing zijn op veel secretoire cellen buiten chromaffinecellen.

Volgens de experimentele procedures in figuur 1 en figuur 2 werden chromaffinecellen uit runderbijnieren getransfecteerd met PH-mNG om het plasmamembraan te labelen; A655 werd toegevoegd aan de badoplossing om fusieporiënsluiting te detecteren; en fluorescerende valse neurotransmitter FFN511 werd geladen in blaasjes voor detectie van afgifte. Vervolgens werd XY-plane confocale timelapse beeldvorming van FFN511, PH-mNG en A655 elke 20-90 ms aan de celbodem uitge...

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells at JoVE.com

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

Dit protocol beschrijft een confocale beeldvormingstechniek om drie fusiemodi in boviene bijnierchromaffinecellen te detecteren. Deze fusiemodi omvatten 1) close-fusion (ook wel kiss-and-run genoemd), waarbij fusieporiën worden geopend en gesloten, 2) stay-fusion, waarbij fusieporie wordt geopend en de geopende porie wordt gehandhaafd, en 3) krimpfusie, waarbij gesmolten blaasjeskrimp betrokken zijn.

Confocale microscopie om drie modi van fusieporiëndynamiek in bijnierchromaffinecellen te meten

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...

Membraanfusie bemiddelt veel biologische functies. Dit protocol beschrijft een methode om fusieporiënopening en transmitter release dynamiek te detecteren en drie fusiemodi te onderscheiden; close fusion, stay fusion en shrink fusion. De combinatie van confocale microscoop en de patch-clamp-opname vergemakkelijkt de visualisatie van het openen en sluiten van fusieporiën en de bepaling van hun kinetiek.Hoewel beschreven voor chromaffinecellen, kan het principe van de hier beschreven methode op grote schaal worden toegepast op veel secretoire cellen ver buiten chromaffinecellen. Succesvolle implementatie van deze methode hangt af van verschillende algemene stappen, zoals het genereren van gezonde primaire chromaffinecelkweek, voldoende plasmidetransfectie-efficiëntie en een hoog elektrofysiologisch opnamesuccespercentage. Kies drie intacte klieren zonder snijwonden of bloedingen op het oppervlak en verwijder het vetweefsel met een schaar.Was de klieren door perfusie met Locke's oplossing totdat er geen bloed uitkomt. Injecteer voor de spijsvertering de enzymoplossing door de bijnierader met behulp van een spuit van 30 millimeter die is bevestigd met een filter van 0,22 micrometer totdat de klier begint op te zwellen. Laat de klieren vervolgens 10 minuten op 37 graden Celsius staan.Injecteer opnieuw en laat de klieren nog 10 minuten op 37 graden Celsius staan. Snijd na de spijsvertering de klier in de lengterichting van de bijnierader naar het andere uiteinde met een schaar om de klier te ontvouwen. Isoleer het witte medulla door het in stukjes uit te tweeten in een petrischaaltje van 10 centimeter met de oplossing van Locke.Knip en gehakt de medulla met een schaar. Filtreer de medulla suspensie met een nylon gaas van 80 tot 100 micrometer in een bekerglas. Breng het filtraat over in een conische buis van 50 milliliter en centreer gedurende drie minuten bij 48 x g kamertemperatuur met een vertraging van drie.Verwijder na centrifugatie het supernatant en resuspenseer de celpellet met locke's oplossing door pipetteren. Filtreer de celsuspensie met een zeef van 80 tot 100 micrometer en centreer bij 48 x g kamertemperatuur gedurende drie minuten met vertraging drie. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet met 30 milliliter kweekmedium.Bepaal het celnummer met behulp van een hemocytometertelkamer. Breng 2. 800.000 cellen over in een buis van 15 milliliter. Pelleteer de cellen door centrifugeren bij 48 x g gedurende twee minuten met de vertraging van drie.Voeg 100 microliter transsectiebuffer toe die door de fabrikant is verstrekt aan de celpellet. En voeg dan twee microgram PH-mNG plasmide toe. Meng de suspensie voorzichtig door de oplossing op en neer te pompen en breng het mengsel onmiddellijk over in een elektroporatiecuvet.Breng de cuvette onmiddellijk over naar de elektroporator, selecteer het 005-programma in de schermlijst en druk op Enter om elektroporatie uit te voeren. Voeg na elektroporatie onmiddellijk 1,8 milliliter medium toe aan de cuvette en meng voorzichtig met een micropipette uitgerust met een steriele punt. Voeg 300 microliter van de suspensie van de geëlektropoeerde cellen toe aan de afdekslip in elke schotel met in totaal vijf tot zes schotels voor één elektroporatiereactie.Breng de gerechten voorzichtig over naar een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius met 9% koolstofdioxide gedurende 30 minuten en voeg na 30 minuten voorzichtig twee milliliter voorgewarmd medium toe aan elk gerecht. Bereid patchpipetten van borosilicaatglascapillairen door ze te trekken met een pipettrekker, hun uiteinden te bedekken met vloeibare was en ze te polijsten met een microforge. Schakel de patchklem opnameversterker in en start de software.Stel de juiste calciumstroom- en capaciteitsregistratieparameters van de software in. Stel een opnameprotocol in van in totaal 60 seconden waarbij de stimulatie begint bij 10 seconden. Stel de houdpotentiaal voor spanningsklemregistratie in op 80 millivolt.Stel een depolarisatie van één seconde in van min 80 millivolt naar 10 millivolt als de stimulans om calciuminstroom en capaciteitssprong te induceren. Schakel het confocale microscoopsysteem in en stel de juiste parameters in de software in. Schakel de lasers in, waaronder 458 nanometer, 514 nanometer en 633 nanometer en stel het emissieverzamelingsbereik voor elke laser in volgens elke fluorescentiesonde.Kies een gerecht met een goede celtoestand en de juiste expressie en voeg twee microliter fluorescentie valse neurotransmitter FFN511 toe aan het medium in het gerecht. Zet het gerecht 20 minuten terug in de couveuse. Bereid na het laden van FFN511 de opnamekamer voor en voeg twee microliter fluorescentiekleurstof A655 toe aan 50 microliter badoplossing.Breng de afdeksel van de schaal met een pincet over in de opnamekamer en voeg onmiddellijk de A655 met badoplossing toe. Plaats een druppel olie op het 100X olie-onderdompelingsdoel. Monteer de kamer in de microscoop en gebruik de instelknop om de olie gewoon contact te laten maken met de onderkant van de afdekslip.Breng de cellen in beeld en gebruik bright field en confocale beeldvorming om een geschikte cel met mNG-expressie te vinden. Zoom in op de geselecteerde cel en centreer deze in het gezichtsveld, waardoor lege gebieden worden geminimaliseerd. Stel parameters in voor XY-vlak confocale beeldvorming op een vast Z-vlak van FFN511, PH-mNG en A665 met een geminimaliseerd tijdsinterval.Pas de scherpstelling aan de onderkant van de cel aan met een fijnstelknop. Pas het excitatielaservermogen in de software aan om een instelling te vinden om de beste signaal-ruisverhouding te krijgen en significante fluorescentiebleking te voorkomen. Voeg negen microliter interne oplossing toe aan een patchpipet en bevestig de pipet aan de houder van de patchklemversterkertrap.Breng een kleine hoeveelheid positieve druk aan met een spuit en beweeg de pipetpunt om de badoplossing aan te raken met een micromanipulator. Zorg ervoor dat de versterker laat zien dat de pipetweerstand ongeveer tussen de twee en vier megaohms ligt met een spanningspulstest. Druk op LJ/Auto om de vloeistofverbinding te annuleren.Verplaats de pipet naar de geselecteerde cel met een micromanipulator. Als u een celgebonden modus wilt vormen, verplaatst u de pipetpunt om de cel aan te raken. Verander het houdvermogen van nul naar min 80 millivolt terwijl u zachte onderdruk uitoefent met een spuit.Zodra de weerstand een gigaohm passeert, wacht u ongeveer 30 seconden totdat de configuratie is gestabiliseerd. Druk op C-fast/Auto om de snelle capaciteit te compenseren. Om een groothandelsmodus te vormen, past u korte maar krachtige onderdrukpulsen toe met de spuit totdat het membraan scheurt.Druk op C- slow/Auto om de trage capaciteit te compenseren. Pas de beeldfocus iets aan om scherp te stellen op de onderkant van de cel. Start de confocale timelapse imaging en patch clamp opname gelijktijdig door op de Start knoppen te klikken met twee verschillende software applicaties.Zorg er na het opnemen voor dat de gegevens zijn opgeslagen. Verander het houdpotentieel terug naar nul millivolts. Haal de pipet uit de badoplossing en gooi deze weg.Open de RAW-beeldbewerkingsbestanden met een fabrikant of meegeleverde software. Ga naar Proces, klik op ProcessTools en gebruik de tools om voortschrijdende gemiddelde bestanden te genereren voor elke timelapse-afbeelding. Sla deze bestanden op.Ga onder kwantificeren naar Tools en klik op stackprofielknoppen om tijdpunten voor en na stimulatie te controleren en fluorescentieveranderingen in elk kanaal te identificeren. Klik op de knop Ellips tekenen om regio's te omcirkelen die interessant zijn voor fusiegebeurtenissen. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en klik op SLA's op om op te slaan.Klik op Projecten openen om het RAW-bestand te zoeken. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en klik op ROIs laden om het ROI-bestand in het ONBEWERKTE afbeeldingsbestand te laden om de fluorescentie-intensiteiten te meten. Ga naar Tools en klik op Sorteer-ROI's in de software en plot de sporen voor alle drie de kanalen van elke ROI.Klik op Rapporteren om de ROI-gegevens, inclusief digitale gegevens en beeldtraceringen voor elke ROI, op te slaan in een bestandsmap. De registratie van de hele celpleisterklem en het aanbrengen van een depolarisatie van één seconde van 80 tot 10 millivolts werd uitgevoerd om exo- en endocytose op te roepen. De toegepaste depolarisatie veroorzaakte een inwaartse calciumstroom, een capaciteitssprong, wat duidt op exocytose, en een capaciteitsverval na de sprong, wat wijst op endocytose.Met timelapse-beeldvorming aan de celbodem werden fusiegebeurtenissen geïnduceerd door het depolarisatieprotocol van één seconde aangegeven als FFN-afname als gevolg van FFN511-afgifte, vergezeld van FPH- en A655-spotfluorescentietoename, die PH-mNG- en A655-diffusie van het plasmamembraan en de badoplossing in het fuserende blaasje weerspiegelt. De figuur presenteert nauwe fusie geïdentificeerd als F655 dimming, terwijl FPH met een vertraging aanhield of verviel. De figuur vertegenwoordigt de fusie van het verblijf gedetecteerd door de aanwezigheid van zowel PH-mNG- als A655-vlekken.De figuur vertegenwoordigt krimpfusie gedetecteerd als parallel FPH- en F655-verval, vergezeld van een parallelle verkleining van de PH-mNG-spot en de A655-spot Succesvolle opname vereist het genereren van de hele celconfiguratie met patch-clamp en beeldvorming aan de celbodem met de juiste fluorescerende intensiteit voor elk kanaal. De combinatie van elektrofysiologie en superresolutiemicroscopie die hier wordt beschreven, is een waardevol hulpmiddel voor het meten van fusieporiëndynamica en neurocircuits.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Een eenvoudige manier om Ethanol Gevoeligheid meten in Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging van zintuig voorloper cellen in Intact Drosophila Poppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

Drie-dimensionale confocale analyse van microglia / macrofagen Markers van Polarisatie in Experimentele Hersenletsel

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Methoden voor-Cell bevestigd Capaciteitsmetingen in Muis bijnier Chromaffinecellen Cell

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

TIRFM en pH-gevoelige GFP-sondes naar Neurotransmitter Vesicle Dynamics Evalueer in SH-SY5Y Neuroblastoom Cellen: cell imaging en data-analyse

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocol voor drie-dimensionale confocale Morfometrische Analyse van Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

SNARE-gemedieerde Fusie van Single proteoliposomen met Tethered Ondersteund dubbellagen in een microfluïdische Flow Cell gecontroleerd door gepolariseerde TIRF Microscopie

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Assay voor het meten van nucleocytoplasmisch transport in realtime binnen motor neuronachtige NSC-34 cellen

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Three-dimensional Navigation-guided, Prone, Single-position, Lateral Lumbar Interbody Fusion Technique

Driedimensionale navigatiegeleide, liggende, single-position, laterale lumbale interbody fusion techniek

Lateral interbody fusion provides a significant biomechanical advantage over the traditional transforaminal lumbar interbody fusion due to the large ...