Name: confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells
Uploaded: 2022-03-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells at JoVE.com

Nous remercions les programmes de recherche intra-muros du NINDS (ZIA NS003009-13 et ZIA NS003105-08) d’avoir soutenu ce travail.

REMARQUE: La procédure d’utilisation des animaux a suivi les directives des NIH et a été approuvée par le nih Animal Care and Use Committee.
1. Culture de cellules chromaffines bovines
<ol><li>Préparer la solution de Locke (Tableau 1) et les outils d’autoclave 1 jour avant la culture de cellules chromaffines.</li>
	<li>Obtenez des glandes surrénales bovines d’un abattoir local le jour de la culture et gardez-les immergées dans la solution glacé...

<ol>
	<li>Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pores+and+their+control+of+neurotransmitter+and+hormone+release.">Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release.</a> Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).</li><li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion.">Viral membrane fusion.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).</li><li>Zhao, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemi-fused+structure+mediates+and+controls+fusion+and+fission+in+live+cells.">Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells.</a> Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).</li><li>Klyachko, V. A., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitance+steps+and+fusion+pores+of+small+and+large-dense-core+vesicles+in+nerve+terminals.">Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals.</a> Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).</li><li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Chiang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-fusion+structural+changes+and+their+roles+in+exocytosis+and+endocytosis+of+dense-core+vesicles.">Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles.</a> Nature Communications. 5, 3356 (2014).</li><li>Sharma, S., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fusion+pore,+60+years+after+the+first+cartoon.">The fusion pore, 60 years after the first cartoon.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).</li><li>Jorgacevski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+tuning+of+vesicle+merger+and+fusion+pore+properties.">Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).</li><li>Rituper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+cholesterol+controls+exocytotic+fusion+pore.">Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore.</a> Cell Calcium. 101, 102503 (2021).</li><li>Gucek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+negative+SNARE+peptides+stabilize+the+fusion+pore+in+a+narrow,+release-unproductive+state.">Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).</li><li>Grabner, C. P., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+synaptic+vesicles+mediate+stimulated+exocytosis+from+cochlear+inner+hair+cells.">Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).</li><li>Wen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+provides+membrane+tension+to+merge+fusing+vesicles+into+the+plasma+membrane.">Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane.</a> Nature Communications. 7, 12604 (2016).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Membrane+Pore+in+Live+Cells+Reveals+a+Dynamic-Pore+Theory+Governing+Fusion+and+Endocytosis.">Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis.</a> Cell. 173 (4), 934-945 (2018).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+Shrinking+and+Enlargement+Play+Opposing+Roles+in+the+Release+of+Exocytotic+Contents.">Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents.</a> Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).</li><li>Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+sequential+compound+fusion+and+kiss-and-run+in+live+excitable+cells.">Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+control+of+kiss-and-run+and+vesicular+reuse+probed+with+single+nanoparticles.">The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles.</a> Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+features+between+chromaffin+and+neural+progenitor+cells.">Common features between chromaffin and neural progenitor cells.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).</li><li>Bornstein, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromaffin+cells:+the+peripheral+brain.">Chromaffin cells: the peripheral brain.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).</li><li>Park, Y., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+plasticity+of+small+synaptic+vesicle+(SSV)+and+large+dense-core+vesicle+(LDCV)+exocytosis.">Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis.</a> Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).</li><li>Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+Chromaffin+Cells:+Culture+and+Fluorescence+Assay+for+Secretion.">Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion.</a> Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+Omega-profile+closure+and+kiss-and-run+mediate+endocytosis+and+diverse+endocytic+modes+in+neuroendocrine+chromaffin+cells.">Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells.</a> Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).</li><li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells.">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).</li><li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Tension+Inhibits+Rapid+and+Slow+Endocytosis+in+Secretory+Cells.">Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells.</a> Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).</li><li>Revelo, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+probe+for+super-resolution+imaging+of+membranes+elucidates+trafficking+pathways.">A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways.</a> Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).</li><li>Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX-box+protein,+prenylation+process+and+carcinogenesis.">CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis.</a> American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+vesicles+from+frog+neuromuscular+junctions+by+prolonged+tetanic+stimulation.">Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation.</a> Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).</li><li>Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MINFLUX+nanometer-scale+3D+imaging+and+microsecond-range+tracking+on+a+common+fluorescence+microscope.">MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope.</a> Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).</li></ol>

Une méthode d’imagerie microscopique confocale est décrite pour détecter la dynamique des pores de fusion et de la libération du transmetteur, ainsi que trois modes de fusion, la fusion rapprochée, la fusion de séjour et la fusion rétractable dans les cellules chromaffines surrénales bovines 4,24. Une méthode électrophysiologique pour dépolariser la cellule et ainsi évoquer l’exo- et l’endocytose est décrite. Le traitement systématique des ima...

La fusion membranaire médie de nombreuses fonctions biologiques, y compris la transmission synaptique, l’homéostasie de la glycémie, la réponse immunitaire et l’entrée virale 1,2,3. L’exocytose, impliquant la fusion des vésicules au niveau de la membrane plasmique, libère des neurotransmetteurs et des hormones pour atteindre de nombreuses fonctions importantes, telles que les activités du réseau neuronal. La fusion ouvre un pore pour libérer le contenu vésiculeux, après quoi le pore peut se fermer pour récupérer la vésicule de fusion, appelée baiser et courir 1,4. L’ouverture irréversible et réversible des pores de fusion peut être mesurée avec des enregistrements de capacité attachés à des cellules combinés à des enregistrements de conductance des pores de fusion de fusion de vésicules uniques.
Ceci est souvent interprété comme reflétant la fusion d’effondrement complet, impliquant la dilatation de la fusion jusqu’à l’aplatissement de la vésicule de fusion, et le baiser et le run, impliquant l’ouverture et la fermeture des pores de fusion, respectivement 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Des études récentes d’imagerie par épuisement des émissions confocales et stimulées (STED) dans des cellules chromaffines ont directement observé l’ouverture et la fermeture des pores de fusion (kiss-and-run, également appelée fusion fermée), l’ouverture des pores de fusion qui maintient une forme de Ω avec un pore ouvert pendant une longue période, appelée stay-fusion, et le rétrécissement de la vésicule de fusion jusqu’à ce qu’elle fusionne complètement avec la membrane plasmique, ce qui remplace la fusion à effondrement complet pour fusionner les vésicules de fusion avec la membrane plasmique4, 8,14,15,16,17.
Dans les neurones, l’ouverture et la fermeture des pores de fusion ont été détectées par imagerie montrant la libération de points quantiques préchargés dans des vésicules plus grandes que le pore de fusion et avec des mesures de conductance des pores de fusion à la face de libération des terminaisons nerveuses 5,18,19. Les cellules chromaffines surrénales sont largement utilisées comme modèle pour l’étude de l’exo- et de l’endocytose20,21. Bien que les cellules chromaffines contiennent de grandes vésicules à noyau dense, tandis que les synapses contiennent de petites vésicules synaptiques, les protéines d’exocytose et d’endocytose dans les cellules chromaffines et les synapses sont assez analogues 10,11,12,20,21,22,23.
Ici, une méthode est décrite pour mesurer ces trois modes de fusion à l’aide d’une méthode d’imagerie confocale combinée à l’électrophysiologie dans les cellules chromaffines surrénales bovines (Figure 1). Cette méthode consiste à charger de faux neurotransmetteurs fluorescents (FFN511) dans des vésicules pour détecter l’exocytose; ajout d’Atto 655 (A655) dans la solution de bain pour remplir le profil en forme de Ω généré par fusion, et marquage de la membrane plasmique avec le domaine PH de la phospholipase C δ (PH), qui se lie à PtdIns(4,5)P2 à la membrane plasmique 8,15,24. La dynamique des pores de fusion peut être détectée par des changements dans différentes intensités fluorescentes. Bien que décrit pour les cellules chromaffines, le principe de cette méthode décrit ici peut être largement appliqué à de nombreuses cellules sécrétoires bien au-delà des cellules chromaffines.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td>ATP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto 655</td>
			<td>ATTO-TEC GmbH</td>
			<td>AD 655-21</td>
			<td>Atto dye to label bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Nucleofector for Primary Neurons</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VSPI-1003</td>
			<td>Electroporation transfection buffer along with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boroscilicate capillary glass pipette</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0795</td>
			<td>Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride 2 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-130-721</td>
			<td>Reagent for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>Material for filtering chromaffin cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>232041</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.1214E+10</td>
			<td>Enzyme for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-14-Laminin</td>
			<td>GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11885092</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Nucleofector</td>
			<td>Amaxa Biosystems</td>
			<td>Nucleofector II</td>
			<td>Transfect plasmids into cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFN511</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120331</td>
			<td>Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td>GTP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>WaveMetrics</td>
			<td>Igor pro</td>
			<td>Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Confocal software for imaging data collection and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Confocal microscope for imaging data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49449-100G</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Lock-in</td>
			<td>Software for capacitance recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride 1 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3120</td>
			<td>Counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mNG(mNeonGreen)</td>
			<td>Allele Biotechnology</td>
			<td>ABP-FP-MNEONSB</td>
			<td>Template for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh filtering screen 100 micron</td>
			<td>EIKO filtering co</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>Material for filtering medulla suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp EPC-10</td>
			<td>Heka</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td>Amplifier for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH-EGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #51407</td>
			<td>Backbone for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Make pipettes for patch-clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5404-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse software</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Pulse</td>
			<td>Software for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1943/QR-40LP</td>
			<td>coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution, bath solution and internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hot plate</td>
			<td>Barnsted/Thermolyne</td>
			<td>type 10100</td>
			<td>Heater for pipette coating with wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 30 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302832</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2265-100G</td>
			<td>TEA for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9253-5G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid</td>
			<td>Leica</td>
			<td>195371-10-9</td>
			<td>Leica confocal mounting oil</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells

L’ouverture et la fermeture dynamiques des pores de fusion médient l’exocytose et l’endocytose et déterminent leur cinétique. Ici, il est démontré en détail comment la microscopie confocale a été utilisée en combinaison avec l’enregistrement patch-clamp pour détecter trois modes de fusion dans les cellules chromaffines surrénales bovines en culture primaire. Les trois modes de fusion comprennent 1) la fusion étroite (également appelée kiss-and-run), impliquant l’ouverture et la fermeture des pores de fusion, 2) la stay-fusion, impliquant l’ouverture des pores de fusion et le maintien du pore ouvert, et 3) la shrink-fusion, impliquant le retrait du profil en forme de Ω généré par la fusion jusqu’à ce qu’il fusionne complètement au niveau de la membrane plasmique.
Pour détecter ces modes de fusion, la membrane plasmique a été marquée en surexprimant mNeonGreen attaché au domaine PH de la phospholipase C δ (PH-mNG), qui se lie au phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) au niveau de la feuillet face au cytosol de la membrane plasmique; les vésicules ont été chargées avec le faux neurotransmetteur fluorescent FFN511 pour détecter la libération de contenu vésiculeux; et Atto 655 a été inclus dans la solution de bain pour détecter la fermeture des pores de fusion. Ces trois sondes fluorescentes ont été imagées simultanément à environ 20-90 ms par image dans des cellules chromaffines vivantes pour détecter l’ouverture des pores de fusion, la libération de contenu, la fermeture des pores de fusion et les changements de taille des vésicules de fusion. La méthode d’analyse est décrite pour distinguer trois modes de fusion de ces mesures de fluorescence. La méthode décrite ici peut, en principe, s’appliquer à de nombreuses cellules sécrétoires au-delà des cellules chromaffines.

À la suite des procédures expérimentales illustrées aux figures 1 et 2, les cellules chromaffines des glandes surrénales bovines ont été transfectées avec du PH-mNG pour marquer la membrane plasmique; L’A655 a été ajouté à la solution de bain pour détecter la fermeture des pores de fusion; et le faux neurotransmetteur fluorescent FFN511 a été chargé dans les vésicules pour la détection de la libération. Ensuite, l’imagerie du timelapse con...

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Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

Ce protocole décrit une technique d’imagerie confocale permettant de détecter trois modes de fusion dans les cellules chromaffines surrénales bovines. Ces modes de fusion comprennent 1) la fusion étroite (également appelée kiss-and-run), impliquant l’ouverture et la fermeture des pores de fusion, 2) la stay-fusion, impliquant l’ouverture des pores de fusion et le maintien du pore ouvert, et 3) la shrink-fusion, impliquant un rétrécissement des vésicules fusionnées.

Microscopie confocale pour mesurer trois modes de dynamique des pores de fusion dans les cellules chromaffines surrénales

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...

La fusion membranaire médie de nombreuses fonctions biologiques. Ce protocole décrit une méthode pour détecter l’ouverture des pores de fusion et la dynamique de libération du transmetteur et distinguer trois modes de fusion: fusion fermée, fusion de séjour et fusion rétrécie. La combinaison du microscope confocal et de l’enregistrement patch-clamp facilite la visualisation de l’ouverture et de la fermeture des pores de fusion et la détermination de leur cinétique.Bien que décrit pour les cellules chromaffines, le principe de la méthode décrite ici peut être largement appliqué à de nombreuses cellules sécrétoires bien au-delà des cellules chromaffines. La mise en œuvre réussie de cette méthode dépend de plusieurs étapes générales, telles que la génération d’une culture de cellules chromaffines primaires saines, une efficacité de transfection suffisante des plasmides et un taux de réussite élevé de l’enregistrement électrophysiologique. Choisissez trois glandes intactes sans coupures ni saignements à la surface et retirez le tissu adipeux avec des ciseaux.Lavez les glandes par perfusion avec la solution de Locke jusqu’à ce qu’aucun sang ne sorte. Pour la digestion, injectez la solution enzymatique à travers la veine surrénale à l’aide d’une seringue de 30 millimètres attachée avec un filtre de 0,22 micromètre jusqu’à ce que la glande commence à gonfler. Ensuite, laissez les glandes à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.Injectez à nouveau et laissez les glandes à 37 degrés Celsius pendant encore 10 minutes. Après la digestion, coupez la glande longitudinalement de la veine surrénale à l’autre extrémité avec des ciseaux pour déplier la glande. Isolez la médulla blanche en la pressant en morceaux dans une boîte de Petri de 10 centimètres contenant la solution de Locke.Couper et hacher la moelle avec des ciseaux. Filtrer la suspension médullaire avec un maillage en nylon de 80 à 100 micromètres dans un bécher. Transférer le filtrat dans un tube conique de 50 millilitres et centrifuger à 48 x g température ambiante pendant trois minutes avec une décélération de trois.Après centrifugation, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule avec la solution de Locke par pipetage. Filtrer la suspension cellulaire avec une crépine de 80 à 100 micromètres et centrifuger à 48 x g température ambiante pendant trois minutes avec décélération trois. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec 30 millilitres de milieu de culture.Déterminez le nombre de cellules à l’aide d’une chambre de comptage hémocytométrique. Transférer 2 800 000 cellules dans un tube de 15 millilitres. Abattez les cellules par centrifugation à 48 x g pendant deux minutes avec la décélération de trois.Ajouter 100 microlitres de tampon de transsection fournis par le fabricant à la pastille de cellule. Et puis ajoutez deux microgrammes de plasmide PH-mNG. Mélanger doucement la suspension en canalisant la solution de haut en bas et transférer le mélange dans une cuvette d’électroporation sans délai.Transférez immédiatement la cuvette dans l’électroporateur, sélectionnez le programme 005 dans la liste des écrans et appuyez sur Entrée pour effectuer l’électroporation. Après électroporation, ajouter immédiatement 1,8 millilitre de milieu à la cuvette et mélanger doucement avec une micropipette équipée d’une pointe stérile. Ajouter 300 microlitres de la suspension des cellules électroporées sur le couvercle dans chaque plat en plaquant cinq à six plats au total pour une réaction d’électroporation.Transférer soigneusement les plats dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 9% de dioxyde de carbone pendant 30 minutes et ajouter doucement deux millilitres de milieu préavertissé à chaque plat après 30 minutes. Préparez des pipettes de patch à partir de capillaires en verre borosilicate en les tirant avec un extracteur de pipette, en enrobant leurs pointes de cire liquide et en les polissant avec une microforge. Allumez l’amplificateur d’enregistrement à pince de patch et démarrez le logiciel.Définissez les paramètres d’enregistrement du courant de calcium et de la capacité appropriés du logiciel. Définissez un protocole d’enregistrement d’une durée totale de 60 secondes où la stimulation commence à 10 secondes. Réglez le potentiel de maintien pour l’enregistrement de la pince de tension à 80 millivolts.Définissez une dépolarisation d’une seconde de moins 80 millivolts à 10 millivolts comme stimulus pour induire l’afflux de calcium et le saut de capacité. Allumez le système de microscope confocal et définissez les paramètres appropriés dans le logiciel. Allumez les lasers, y compris 458 nanomètres, 514 nanomètres et 633 nanomètres et définissez la plage de collecte des émissions pour chaque laser en fonction de chaque sonde de fluorescence.Choisissez un plat avec un bon état cellulaire et une expression correcte et ajoutez deux microlitres de faux neurotransmetteur de fluorescence FFN511 dans le milieu dans le plat. Remettez le plat dans l’incubateur pendant 20 minutes. Après avoir chargé FFN511, préparez la chambre d’enregistrement et ajoutez deux microlitres de colorant de fluorescence A655 dans 50 microlitres de solution de bain.Transférez le couvercle du plat dans la chambre d’enregistrement avec une pince à épiler et ajoutez immédiatement la solution de bain contenant de l’A655. Placez une goutte d’huile sur l’objectif d’immersion dans l’huile 100X. Montez la chambre dans le microscope et utilisez le bouton de réglage pour que l’huile entre simplement en contact avec le fond du couvercle.Mettez les cellules au point et utilisez l’imagerie en champ lumineux et confocale pour trouver une cellule appropriée avec une expression mNG. Effectuez un zoom avant sur la cellule sélectionnée et centrez-la dans le champ de vision, en minimisant les zones vides. Définissez les paramètres de l’imagerie confocale du plan XY sur un plan Z fixe de FFN511, PH-mNG et A665 avec un intervalle de temps réduit.Réglez la mise au point au bas de la cellule à l’aide d’un bouton de réglage fin. Ajustez la puissance du laser d’excitation dans le logiciel pour trouver un réglage permettant d’obtenir le meilleur rapport signal/bruit et d’éviter un blanchiment important par fluorescence. Ajouter neuf microlitres de solution interne dans une pipette de patch et fixer la pipette au support de l’étage d’amplification de la pince de patch.Appliquez une petite pression positive avec une seringue et déplacez l’embout de la pipette pour toucher la solution de bain avec un micromanipulateur. Assurez-vous que l’amplificateur montre que la résistance de la pipette est approximativement comprise entre deux et quatre mégaohms avec un test d’impulsion de tension. Appuyez sur LJ/Auto pour annuler la jonction liquide.Déplacez la pipette vers la cellule sélectionnée à l’aide d’un micromanipulateur. Pour former un mode attaché à une cellule, déplacez l’embout de la pipette pour toucher la cellule. Changez le potentiel de maintien de zéro à moins 80 millivolts tout en appliquant une légère pression négative avec une seringue.Une fois que la résistance dépasse un gigaohm, attendez environ 30 secondes pour que la configuration se stabilise. Appuyez sur C-fast/Auto pour compenser la capacité rapide. Pour former un mode de vente en gros, appliquez des impulsions courtes mais puissantes de pression négative avec la seringue jusqu’à ce que la membrane se rompe.Appuyez sur C-slow/Auto pour compenser la capacité lente. Ajustez légèrement la mise au point de l’imagerie pour faire la mise au point sur le fond de la cellule. Démarrez simultanément l’imagerie en accéléré confocale et l’enregistrement de la pince de patch en cliquant sur les boutons Démarrer avec deux applications logicielles différentes.Après l’enregistrement, assurez-vous que les données sont enregistrées. Modifiez le potentiel de retenue à zéro millivolts. Retirez la pipette de la solution de bain et jetez-la.Ouvrez les fichiers d’imagerie bruts auprès de n’importe quel fabricant ou logiciel fourni. Allez dans Processus, cliquez sur ProcessTools et utilisez les outils pour générer des fichiers de moyenne mobile pour chaque image en accéléré. Enregistrez ces fichiers.Sous Quantifier, allez dans Outils et cliquez sur les boutons Profil de pile pour vérifier les points de temps avant et après la stimulation et identifier les changements de fluorescence dans chaque canal. Cliquez sur le bouton Dessiner l’ellipse pour encercler les régions d’intérêt pour les événements de fusion. Faites un clic droit sur l’image et cliquez sur Enregistrer les rois pour enregistrer.Cliquez sur Ouvrir les projets pour localiser le fichier brut. Faites un clic droit sur l’image et cliquez sur Charger les retours sur investissement pour charger le fichier ROI dans le fichier d’imagerie brut afin de mesurer les intensités de fluorescence. Allez dans Outils et cliquez sur Trier les rois dans le logiciel et tracez les traces pour les trois canaux de chaque retour sur investissement.Cliquez sur Rapport pour enregistrer les données de retour sur investissement, y compris les données numériques et les traces d’imagerie pour chaque retour sur investissement dans un dossier de fichiers. L’enregistrement et l’application d’une dépolarisation d’une seconde de 80 à 10 millivolts ont été effectués pour évoquer l’exo et l’endocytose. La dépolarisation appliquée a induit un courant de calcium vers l’intérieur, un saut de capacité, indiquant une exocytose, et une désintégration de la capacité après le saut, indiquant une endocytose.Avec l’imagerie en accéléré au fond de la cellule, les événements de fusion induits par le protocole de dépolarisation d’une seconde ont été indiqués comme une diminution du FFN reflétant la libération de FFN511, accompagnée d’une augmentation de la fluorescence des points FPH et A655, reflétant la diffusion du PH-mNG et de l’A655 de la membrane plasmique et de la solution de bain dans la vésicule de fusion. La figure présente une fusion étroite identifiée comme une gradation F655, tandis que FPH s’est maintenu ou s’est décomposé avec un retard. La figure représente la fusion de séjour détectée par la présence de taches PH-mNG et A655.La figure représente la fusion rétractable détectée comme une désintégration parallèle FPH et F655 accompagnée d’une réduction parallèle de la taille du spot PH-mNG et du spot A655 L’enregistrement réussi nécessite de générer toute la configuration de la cellule avec patch-clamp et imagerie au fond de la cellule avec une intensité fluorescente appropriée pour chaque canal. La combinaison de l’électrophysiologie et de la microscopie à super résolution décrite ici est un outil précieux pour mesurer la dynamique des pores de fusion et les neurocircuits.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Une façon simple de mesurer la sensibilité d&#39;éthanol dans les mouches

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Recherche

Neurosciences

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

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Imagerie des cellules vivantes des cellules sensorielles de précurseurs d&#39;organes en Intact Drosophile Les chrysalides

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

Trois dimensions d&#39;analyse confocale de marqueurs microglies / macrophages de polarisation dans Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Les méthodes de mesures de capacité cellulaires attaché à la souris surrénales chromaffines cellule

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

La jonction neuromusculaire: Synapse mesurer la taille, fragmentation et les changements dans Synaptic Protein densité en utilisant microscopie de fluorescence confocale

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

TIRFM et GFP-sondes sensibles au pH pour l&#39;évaluation des vésicules de neurotransmetteur Dynamics dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome: imagerie cellulaire et analyse des données

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocole pour tridimensionnelle confocale Analyse morphométrique des astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

Fusion SNARE-médiée de Single protéoliposomes avec bicouches supportées Tethered dans une cellule microfluidique débit contrôlé par Polarized FRBR Microscopie

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Essai pour mesurer le transport des nucléocytoplasmes en temps réel dans les cellules NSC-34 de type Neuron moteur

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Three-dimensional Navigation-guided, Prone, Single-position, Lateral Lumbar Interbody Fusion Technique

Technique de fusion intercorporelle lombaire latérale guidée par navigation tridimensionnelle, couchée, couchée,

Lateral interbody fusion provides a significant biomechanical advantage over the traditional transforaminal lumbar interbody fusion due to the large ...