Name: confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells
Uploaded: 2022-03-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells at JoVE.com

Wir danken den NINDS Intramural Research Programs (ZIA NS003009-13 und ZIA NS003105-08) für die Unterstützung dieser Arbeit.

HINWEIS: Das Tierverwendungsverfahren entsprach den NIH-Richtlinien und wurde vom NIH Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Rinderchromaffin-Zellkultur
<ol><li>Bereiten Sie Lockes Lösung (Tabelle 1) und Autoklavwerkzeuge 1 Tag vor der Chromaffin-Zellkultur vor.</li>
	<li>Erhalten Sie am Kulturtag Rindernebennieren von einem lokalen Schlachthof und halten Sie sie vor der Dissektion in eiskalte Locke-Lösung getaucht. HINWEIS: Nebennieren sind von 21...

<ol>
	<li>Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pores+and+their+control+of+neurotransmitter+and+hormone+release.">Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release.</a> Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).</li><li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion.">Viral membrane fusion.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).</li><li>Zhao, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemi-fused+structure+mediates+and+controls+fusion+and+fission+in+live+cells.">Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells.</a> Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).</li><li>Klyachko, V. A., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitance+steps+and+fusion+pores+of+small+and+large-dense-core+vesicles+in+nerve+terminals.">Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals.</a> Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).</li><li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Chiang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-fusion+structural+changes+and+their+roles+in+exocytosis+and+endocytosis+of+dense-core+vesicles.">Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles.</a> Nature Communications. 5, 3356 (2014).</li><li>Sharma, S., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fusion+pore,+60+years+after+the+first+cartoon.">The fusion pore, 60 years after the first cartoon.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).</li><li>Jorgacevski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+tuning+of+vesicle+merger+and+fusion+pore+properties.">Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).</li><li>Rituper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+cholesterol+controls+exocytotic+fusion+pore.">Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore.</a> Cell Calcium. 101, 102503 (2021).</li><li>Gucek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+negative+SNARE+peptides+stabilize+the+fusion+pore+in+a+narrow,+release-unproductive+state.">Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).</li><li>Grabner, C. P., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+synaptic+vesicles+mediate+stimulated+exocytosis+from+cochlear+inner+hair+cells.">Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).</li><li>Wen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+provides+membrane+tension+to+merge+fusing+vesicles+into+the+plasma+membrane.">Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane.</a> Nature Communications. 7, 12604 (2016).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Membrane+Pore+in+Live+Cells+Reveals+a+Dynamic-Pore+Theory+Governing+Fusion+and+Endocytosis.">Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis.</a> Cell. 173 (4), 934-945 (2018).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+Shrinking+and+Enlargement+Play+Opposing+Roles+in+the+Release+of+Exocytotic+Contents.">Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents.</a> Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).</li><li>Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+sequential+compound+fusion+and+kiss-and-run+in+live+excitable+cells.">Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+control+of+kiss-and-run+and+vesicular+reuse+probed+with+single+nanoparticles.">The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles.</a> Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+features+between+chromaffin+and+neural+progenitor+cells.">Common features between chromaffin and neural progenitor cells.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).</li><li>Bornstein, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromaffin+cells:+the+peripheral+brain.">Chromaffin cells: the peripheral brain.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).</li><li>Park, Y., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+plasticity+of+small+synaptic+vesicle+(SSV)+and+large+dense-core+vesicle+(LDCV)+exocytosis.">Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis.</a> Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).</li><li>Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+Chromaffin+Cells:+Culture+and+Fluorescence+Assay+for+Secretion.">Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion.</a> Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+Omega-profile+closure+and+kiss-and-run+mediate+endocytosis+and+diverse+endocytic+modes+in+neuroendocrine+chromaffin+cells.">Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells.</a> Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).</li><li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells.">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).</li><li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Tension+Inhibits+Rapid+and+Slow+Endocytosis+in+Secretory+Cells.">Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells.</a> Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).</li><li>Revelo, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+probe+for+super-resolution+imaging+of+membranes+elucidates+trafficking+pathways.">A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways.</a> Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).</li><li>Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX-box+protein,+prenylation+process+and+carcinogenesis.">CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis.</a> American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+vesicles+from+frog+neuromuscular+junctions+by+prolonged+tetanic+stimulation.">Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation.</a> Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).</li><li>Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MINFLUX+nanometer-scale+3D+imaging+and+microsecond-range+tracking+on+a+common+fluorescence+microscope.">MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope.</a> Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).</li></ol>

Ein konfokales mikroskopisches Bildgebungsverfahren wird beschrieben, um die Dynamik der Fusionsporen- und Transmitterfreisetzung sowie drei Fusionsmodi, Close-Fusion, Stay-Fusion und Shrink-Fusion in bovinen Nebennieren-Chromaffin-Zellenzu erkennen 4,24. Es wird eine elektrophysiologische Methode beschrieben, um die Zelle zu depolarisieren und dadurch Exo- und Endozytose hervorzurufen. Die systematische konfokale Bildverarbeitung liefert Informationen über vers...

Die Membranfusion vermittelt viele biologische Funktionen, einschließlich synaptischer Übertragung, Blutzuckerhomöostase, Immunantwort und viralem Eintritt 1,2,3. Exozytose, bei der die Vesikelfusion an der Plasmamembran stattfindet, setzt Neurotransmitter und Hormone frei, um viele wichtige Funktionen wie neuronale Netzwerkaktivitäten zu erreichen. Fusion öffnet eine Pore, um vesikulären Inhalt freizusetzen, wonach sich die Pore schließen kann, um das fusionierende Vesikel zu erhalten, das als Kiss-and-Run 1,4 bezeichnet wird. Sowohl irreversible als auch reversible Fusionsporenöffnung können mit zellgebundenen Kapazitätsaufzeichnungen in Kombination mit Fusionsporenleitfähigkeitsaufzeichnungen der Einzelvesikelfusion gemessen werden.
Dies wird oft so interpretiert, dass es die vollständige Kollapsfusion widerspiegelt, bei der die Fusion bis zur Abflachung des Schmelzvesikels dilatiert wird, und Kiss-and-Run, bei dem die Fusionsporen geöffnet und geschlossen werden, bzw. 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Jüngste konfokale und stimulierte Emissionsdepletionsstudien (STED) in chromaffinen Zellen beobachteten direkt die Öffnung und den Verschluss der Fusionsporen (Kiss-and-Run, auch Close-Fusion genannt), die Fusionsporenöffnung, die lange Zeit eine Ω-Form mit einer offenen Pore beibehält, die als Stay-Fusion bezeichnet wird, und das Schrumpfen des Fusionsvesikels, bis es vollständig mit der Plasmamembran verschmilzt, die die vollständige Kollapsfusion für die Verschmelzung von Fusionsvesikeln mit der Plasmamembran4 ersetzt. 8,14,15,16,17.
In Neuronen wurde die Öffnung und der Verschluss der Fusionsporen mit Bildgebung nachgewiesen, die die Freisetzung von Quantenpunkten zeigt, die in Vesikeln vorgeladen sind, die größer als die Fusionspore sind, und mit Fusionsporenleitfähigkeitsmessungen an der Freisetzungsfläche von Nerventerminals 5,18,19. Nebennierenchromaffinzellen werden häufig als Modell für die Untersuchung von Exo- und Endozytoseverwendet 20,21. Obwohl Chromaffinzellen große Vesikel mit dichtem Kern enthalten, während Synapsen kleine synaptische Vesikel enthalten, sind die Exozytose- und Endozytoseproteine in chromaffinen Zellen und Synapsen ziemlich analog 10,11,12,20,21,22,23.
Hier wird ein Verfahren beschrieben, um diese drei Fusionsmodi mit einem konfokalen Bildgebungsverfahren in Kombination mit Elektrophysiologie in Rindernebennieren-Chromaffinzellen zu messen (Abbildung 1). Diese Methode beinhaltet das Laden von fluoreszierenden falschen Neurotransmittern (FFN511) in Vesikel, um Exozytose zu erkennen; Zugabe von Atto 655 (A655) in der Badlösung, um das fusionserzeugte Ω-Form-Profil zu füllen, und Markierung der Plasmamembran mit der PH-Domäne der Phospholipase C δ (PH), die an PtdIns(4,5)P2 an der Plasmamembran 8,15,24 bindet. Die Dynamik der Fusionsporen kann durch Änderungen verschiedener Fluoreszenzintensitäten nachgewiesen werden. Obwohl für Chromaffinzellen beschrieben, kann das hier beschriebene Prinzip dieser Methode weit über Chromaffinzellen hinaus auf viele sekretorische Zellen angewendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td>ATP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto 655</td>
			<td>ATTO-TEC GmbH</td>
			<td>AD 655-21</td>
			<td>Atto dye to label bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Nucleofector for Primary Neurons</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VSPI-1003</td>
			<td>Electroporation transfection buffer along with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boroscilicate capillary glass pipette</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0795</td>
			<td>Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride 2 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-130-721</td>
			<td>Reagent for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>Material for filtering chromaffin cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>232041</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.1214E+10</td>
			<td>Enzyme for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-14-Laminin</td>
			<td>GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11885092</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Nucleofector</td>
			<td>Amaxa Biosystems</td>
			<td>Nucleofector II</td>
			<td>Transfect plasmids into cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFN511</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120331</td>
			<td>Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td>GTP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>WaveMetrics</td>
			<td>Igor pro</td>
			<td>Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Confocal software for imaging data collection and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Confocal microscope for imaging data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49449-100G</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Lock-in</td>
			<td>Software for capacitance recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride 1 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3120</td>
			<td>Counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mNG(mNeonGreen)</td>
			<td>Allele Biotechnology</td>
			<td>ABP-FP-MNEONSB</td>
			<td>Template for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh filtering screen 100 micron</td>
			<td>EIKO filtering co</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>Material for filtering medulla suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp EPC-10</td>
			<td>Heka</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td>Amplifier for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH-EGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #51407</td>
			<td>Backbone for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Make pipettes for patch-clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5404-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse software</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Pulse</td>
			<td>Software for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1943/QR-40LP</td>
			<td>coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution, bath solution and internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hot plate</td>
			<td>Barnsted/Thermolyne</td>
			<td>type 10100</td>
			<td>Heater for pipette coating with wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 30 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302832</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2265-100G</td>
			<td>TEA for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9253-5G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid</td>
			<td>Leica</td>
			<td>195371-10-9</td>
			<td>Leica confocal mounting oil</td>
		</tr>
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</table>

confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells

Dynamische Fusionsporenöffnung und -verschluss vermitteln Exozytose und Endozytose und bestimmen deren Kinetik. Hier wird detailliert demonstriert, wie die konfokale Mikroskopie in Kombination mit der Patch-Clamp-Aufzeichnung eingesetzt wurde, um drei Fusionsmodi in Primärkultur-Rindernebennieren-Chromaffinzellen nachzuweisen. Die drei Fusionsmodi umfassen 1) Close-Fusion (auch Kiss-and-Run genannt) mit Fusionsporenöffnung und -verschluss, 2) Stay-Fusion, bei der die Fusionspore geöffnet und die geöffnete Pore erhalten bleibt, und 3) Shrink-Fusion, bei der das fusionserzeugte Ω-Form-Profil geschrumpft wird, bis es vollständig an der Plasmamembran verschmilzt.
Um diese Fusionsmodi nachzuweisen, wurde die Plasmamembran durch Überexpression von mNeonGreen markiert, das mit der PH-Domäne der Phospholipase C δ (PH-mNG) verbunden ist, die an Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PtdIns(4,5)P2) an der Zytosol-zugewandten Packungsbeilage der Plasmamembran bindet; Vesikel wurden mit dem fluoreszierenden falschen Neurotransmitter FFN511 beladen, um die Freisetzung von vesikulärem Inhalt nachzuweisen; und Atto 655 wurde in die Badlösung aufgenommen, um einen Fusionsporenverschluss zu erkennen. Diese drei fluoreszierenden Sonden wurden gleichzeitig mit ~ 20-90 ms pro Bild in lebenden Chromaffinzellen abgebildet, um die Öffnung der Fusionsporen, die Freisetzung von Inhalten, den Fusionsporenverschluss und die Änderung der Fusionsvesikelgröße zu erkennen. Die Analysemethode wird beschrieben, um drei Fusionsmodi von diesen Fluoreszenzmessungen zu unterscheiden. Das hier beschriebene Verfahren kann prinzipiell auf viele sekretorische Zellen jenseits von Chromaffinzellen angewendet werden.

Nach den in Abbildung 1 und Abbildung 2 gezeigten experimentellen Verfahren wurden chromaffine Zellen aus den Nebennieren der Rinder mit PH-mNG transfiziert, um die Plasmamembran zu markieren; A655 wurde der Badlösung hinzugefügt, um einen Fusionsporenverschluss zu erkennen; und der fluoreszierende falsche Neurotransmitter FFN511 wurde in Vesikel geladen, um die Freisetzung nachzuweisen. Als nächstes wurde die konfokale Zeitrafferbildgebung der XY-Ebene von F...

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Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

Dieses Protokoll beschreibt ein konfokales Bildgebungsverfahren zum Nachweis von drei Fusionsmodi in rindischen Nebennierenchromaffinzellen. Diese Fusionsmodi umfassen 1) Close-Fusion (auch Kiss-and-Run genannt), bei der sich die Fusionspore öffnet und schließt, 2) Stay-Fusion, bei der die Fusionspore geöffnet und die geöffnete Pore erhalten bleibt, und 3) Shrink-Fusion, einschließlich der Schrumpfung der fusionierten Vesikel.

Konfokale Mikroskopie zur Messung von drei Modi der Fusionsporendynamik in Nebennierenchromaffinzellen

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...

Die Membranfusion vermittelt viele biologische Funktionen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erkennung der Fusionsporenöffnung und der Transmitterfreisetzungsdynamik und zur Unterscheidung von drei Fusionsmodi: Close Fusion, Stay Fusion und Shrink Fusion. Die Kombination aus konfokalem Mikroskop und der Patch-Clamp-Aufzeichnung erleichtert die Visualisierung der Öffnung und des Verschlusses der Fusionsporen und die Bestimmung ihrer Kinetik.Obwohl für Chromaffinzellen beschrieben, kann das Prinzip der hier beschriebenen Methode weit über Chromaffinzellen hinaus auf viele sekretorische Zellen angewendet werden. Die erfolgreiche Implementierung dieser Methode hängt von mehreren allgemeinen Schritten ab, wie der Erzeugung einer gesunden primären Chromaffinzellkultur, einer ausreichenden Plasmidtransfektionseffizienz und einer hohen elektrophysiologischen Aufzeichnungserfolgsrate. Wählen Sie drei intakte Drüsen ohne Schnitte oder Blutungen an der Oberfläche und entfernen Sie das Fettgewebe mit einer Schere.Waschen Sie die Drüsen durch Durchblutung mit Lockes Lösung, bis kein Blut mehr herauskommt. Zur Verdauung injizieren Sie die Enzymlösung durch die Nebennierenvene mit einer 30-Millimeter-Spritze, die mit einem 0,22-Mikrometer-Filter befestigt ist, bis die Drüse anschwillt. Dann lassen Sie die Drüsen bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten.Erneut injizieren und die Drüsen bei 37 Grad Celsius für weitere 10 Minuten stehen lassen. Nach der Verdauung schneiden Sie die Drüse längs von der Nebennierenvene bis zum anderen Ende mit einer Schere, um die Drüse zu entfalten. Isolieren Sie das weiße Mark, indem Sie es in Stücke zu einer 10 Zentimeter großen Petrischale mit Lockes Lösung herauspressen.Schneiden und zerkleinern Sie die Medulla mit einer Schere. Filtern Sie die Medulla-Suspension mit einem 80 bis 100 Mikrometer langen Nylonnetz in ein Becherglas. Das Filtrat in ein 50 Milliliter konisches Röhrchen geben und bei 48 x g Raumtemperatur drei Minuten lang mit einer Verzögerung von drei Minuten zentrifugieren.Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet mit Lockes Lösung durch Pipettieren. Filtern Sie die Zellsuspension mit einem 80 bis 100 Mikrometer langen Sieb und zentrifugieren Sie bei 48 x g Raumtemperatur für drei Minuten mit Verzögerung drei. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet mit 30 Millilitern Kulturmedium.Bestimmen Sie die Zellzahl mit einer Hämozytometer-Zählkammer. Übertragen Sie 2.800.000 Zellen in ein 15-Milliliter-Rohr. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 48 x g für zwei Minuten mit der Verzögerung von drei.Fügen Sie dem Zellpellet 100 Mikroliter Transsektionspuffer hinzu, der vom Hersteller zur Verfügung gestellt wird. Und dann fügen Sie zwei Mikrogramm PH-mNG-Plasmid hinzu. Mischen Sie die Suspension vorsichtig, indem Sie die Lösung auf und ab leiten und die Mischung unverzüglich in eine Elektroporationsküvette überführen.Übertragen Sie die Küvette sofort auf den Elektroporator, wählen Sie das Programm 005 in der Bildschirmliste aus und drücken Sie die Eingabetaste, um die Elektroporation durchzuführen. Nach der Elektroporation sofort 1,8 Milliliter Medium in die Küvette geben und vorsichtig mit einer Mikropipette mischen, die mit einer sterilen Spitze ausgestattet ist. Fügen Sie 300 Mikroliter der Suspension der elektropolierten Zellen auf den Deckzettel in jeder Schalenbeschichtung von insgesamt fünf bis sechs Schalen für eine Elektroporationsreaktion hinzu.Gießen Sie das Geschirr vorsichtig für 30 Minuten in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 9% Kohlendioxid und geben Sie nach 30 Minuten vorsichtig zwei Milliliter vorgewärmtes Medium zu jedem Gericht. Bereiten Sie Patchpipetten aus Borosilikatglaskapillaren vor, indem Sie sie mit einem Pipettenzieher ziehen, ihre Spitzen mit flüssigem Wachs beschichten und mit einer Mikroschmiede polieren. Schalten Sie den Patch-Clamp-Aufnahmeverstärker ein und starten Sie die Software.Stellen Sie die entsprechenden Kalziumstrom- und Kapazitätsaufzeichnungsparameter der Software ein. Legen Sie ein Aufzeichnungsprotokoll von insgesamt 60 Sekunden Dauer fest, bei dem die Stimulation bei 10 Sekunden beginnt. Stellen Sie das Haltepotential für die Spannungsklemmenaufzeichnung auf 80 Millivolt ein.Stellen Sie eine einsekündige Depolarisation von minus 80 Millivolt auf 10 Millivolt als Stimulus ein, um den Kalziumeinstrom und den Kapazitätssprung zu induzieren. Schalten Sie das konfokale Mikroskopsystem ein und stellen Sie die entsprechenden Parameter in der Software ein. Schalten Sie die Laser ein, einschließlich 458 Nanometer, 514 Nanometer und 633 Nanometer, und legen Sie den Emissionssammelbereich für jeden Laser entsprechend jeder Fluoreszenzsonde fest.Wählen Sie eine Schale mit gutem Zellzustand und richtiger Expression und fügen Sie zwei Mikroliter Fluoreszenz-falschen Neurotransmitter FFN511 in das Medium in der Schale hinzu. Stellen Sie das Gericht für 20 Minuten zurück in den Inkubator. Nach dem Laden von FFN511 bereiten Sie die Aufzeichnungskammer vor und geben Sie zwei Mikroliter Fluoreszenzfarbstoff A655 in 50 Mikroliter Badelösung.Den Deckbecher von der Schale mit einer Pinzette in die Aufnahmekammer geben und sofort die A655 enthaltende Badelösung hinzufügen. Legen Sie einen Tropfen Öl auf das 100X Öl-Tauchobjektiv. Montieren Sie die Kammer im Mikroskop und verwenden Sie den Einstellknopf, damit das Öl einfach den Boden des Deckglases berührt.Bringen Sie die Zellen in den Fokus und verwenden Sie hellfeld- und konfokale Bildgebung, um eine geeignete Zelle mit mNG-Expression zu finden. Vergrößern Sie die ausgewählte Zelle und zentrieren Sie sie im Sichtfeld, wodurch leere Bereiche minimiert werden. Legen Sie Parameter für die konfokale Bildgebung der XY-Ebene an einer festen Z-Ebene von FFN511, PH-mNG und A665 mit einem minimierten Zeitintervall fest.Richten Sie den Fokus mit einem Feineinstellungsknopf auf die Unterseite der Zelle ein. Stellen Sie die Anregungslaserleistung in der Software ein, um eine Einstellung zu finden, um das beste Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten und eine signifikante Fluoreszenzbleiche zu vermeiden. Fügen Sie neun Mikroliter interne Lösung in eine Patch-Pipette hinzu und befestigen Sie die Pipette an der Halterung der Patch-Clamp-Verstärkerstufe.Wenden Sie mit einer Spritze eine kleine Menge Überdruck an und bewegen Sie die Pipettenspitze, um die Badelösung mit einem Mikromanipulator zu berühren. Stellen Sie sicher, dass der Verstärker anzeigt, dass der Pipettenwiderstand ungefähr zwischen zwei und vier Megaohm liegt, mit einem Spannungsimpulstest. Drücken Sie LJ/Auto, um die Flüssigkeitsverbindung abzubrechen.Bewegen Sie die Pipette mit einem Mikromanipulator in Richtung der ausgewählten Zelle. Um einen Zellanfügemodus zu bilden, bewegen Sie die Pipettenspitze, um die Zelle zu berühren. Ändern Sie das Haltepotenzial von null auf minus 80 Millivolt, während Sie mit einer Spritze einen sanften Unterdruck ausüben.Sobald der Widerstand ein Gigaohm überschritten hat, warten Sie etwa 30 Sekunden, bis sich die Konfiguration stabilisiert hat. Drücken Sie C-fast/Auto, um die schnelle Kapazität zu kompensieren. Um einen Großhandelsmodus zu bilden, wenden Sie kurze, aber starke Unterdruckimpulse mit der Spritze an, bis die Membran reißt.Drücken Sie C-slow/Auto, um die langsame Kapazität zu kompensieren. Passen Sie den Bildgebungsfokus leicht an, um sich auf den Zellboden zu konzentrieren. Starten Sie die konfokale Zeitrafferbildgebung und die Patch-Clamp-Aufzeichnung gleichzeitig, indem Sie mit zwei verschiedenen Softwareanwendungen auf die Schaltfläche Start klicken.Stellen Sie nach der Aufzeichnung sicher, dass die Daten gespeichert sind. Ändern Sie das Haltepotenzial wieder auf null Millivolt. Bewegen Sie die Pipette aus der Badelösung und entsorgen Sie sie.Öffnen Sie die Raw-Imaging-Dateien bei einem beliebigen Hersteller oder einer mitgelieferten Software. Gehen Sie zu Prozess, klicken Sie auf ProcessTools und verwenden Sie die Tools, um gleitende Durchschnittsdateien für jedes Zeitrafferbild zu generieren. Speichern Sie diese Dateien.Gehen Sie unter Quantifizieren zu Tools und klicken Sie auf die Schaltflächen Stack Profile, um die Zeitpunkte vor und nach der Stimulation zu überprüfen und Fluoreszenzänderungen in jedem Kanal zu identifizieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ellipse zeichnen, um Bereiche zu kreisen, die für Fusionsereignisse von Interesse sind. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und klicken Sie auf ROIs speichern, um zu speichern.Klicken Sie auf Projekte öffnen, um die Rohdatei zu suchen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und klicken Sie auf ROIs laden, um die ROI-Datei in die Rohbilddatei zu laden und die Fluoreszenzintensitäten zu messen. Gehen Sie zu Tools und klicken Sie in der Software auf ROIs sortieren und zeichnen Sie die Spuren für alle drei Kanäle jedes ROI.Klicken Sie auf Bericht, um die ROI-Daten, einschließlich digitaler Daten und Imaging-Traces für jeden ROI, in einem Dateiordner zu speichern. Die Ganzzellen-Patch-Clamp-Aufzeichnung und Anwendung einer einsekündigen Depolarisation von 80 bis 10 Millivolt wurde durchgeführt, um Exo und Endozytose hervorzurufen. Die angewandte Depolarisation induzierte einen nach innen gerichteten Kalziumstrom, einen Kapazitätssprung, der auf eine Exozytose hinweist, und einen Kapazitätsabfall nach dem Sprung, was auf eine Endozytose hinweist.Mit Zeitraffer-Bildgebung am Zellboden wurden Fusionsereignisse, die durch das einsekündige Depolarisationsprotokoll induziert wurden, als FFN-Abnahme angezeigt, die die FFN511-Freisetzung widerspiegelt, begleitet von FPH- und A655-Spotfluoreszenzzunahme, die die PH-mNG- und A655-Diffusion von der Plasmamembran und der Badelösung in das Schmelzvesikel widerspiegelt. Die Abbildung zeigt eine enge Fusion, die als F655-Dimmung identifiziert wurde, während FPH mit einer Verzögerung anhielt oder zerfiel. Die Abbildung stellt die Stay-Fusion dar, die durch das Vorhandensein von PH-mNG- und A655-Spots erkannt wurde.Die Abbildung stellt die Schrumpffusion dar, die als paralleler FPH- und F655-Zerfall erkannt wurde, begleitet von einer parallelen Größenreduktion des PH-mNG-Spots und des A655-Spots. Die hier beschriebene Kombination aus Elektrophysiologie und Superauflösungsmikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Messung der Fusionsporendynamik und der Neuroschaltkreise.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Ein einfacher Weg zu Ethanol Empfindlichkeit in Flies Measure

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Forschung

Neurowissenschaften

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

Dreidimensionale konfokale Analyse der Mikroglia / Makrophagen-Marker der Polarisation in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Methoden für die Cell-Attached-Kapazitätsmessungen in Maus-chromaffinen Nebennierenzell

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Der neuromuskulären Synapse: Mess Synapse Größe, Fragmentierung und Veränderungen der synaptischen Protein Dichte Mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Assay zur Messung des nukleozytoplasmatischen Transports in Echtzeit in motorischen Neuronen-ähnlichen NSC-34-Zellen

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Three-dimensional Navigation-guided, Prone, Single-position, Lateral Lumbar Interbody Fusion Technique

Dreidimensionale navigationsgesteuerte, anfällige, einschichtige, laterale lumbale Interbody Fusion Technique

Lateral interbody fusion provides a significant biomechanical advantage over the traditional transforaminal lumbar interbody fusion due to the large ...