Name: confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells
Uploaded: 2022-03-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells at JoVE.com

אנו מודים לתוכניות המחקר התוך-גופיות של NINDS (ZIA NS003009-13 ו- ZIA NS003105-08) על התמיכה בעבודה זו.

הערה: הליך השימוש בבעלי חיים פעל בהתאם להנחיות NIH ואושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של NIH.
1. תרבית תאי כרומפין בקר
<ol><li>הכינו את התמיסה של לוק (טבלה 1) ואת כלי האוטוקלבה האוטומטית יום אחד לפני תרבית תאי הכרומפין.</li>
	<li>השיגו בלוטות יותרת הכליה של בק...

<ol>
	<li>Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pores+and+their+control+of+neurotransmitter+and+hormone+release.">Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release.</a> Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).</li><li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion.">Viral membrane fusion.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).</li><li>Zhao, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemi-fused+structure+mediates+and+controls+fusion+and+fission+in+live+cells.">Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells.</a> Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).</li><li>Klyachko, V. A., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitance+steps+and+fusion+pores+of+small+and+large-dense-core+vesicles+in+nerve+terminals.">Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals.</a> Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).</li><li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Chiang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-fusion+structural+changes+and+their+roles+in+exocytosis+and+endocytosis+of+dense-core+vesicles.">Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles.</a> Nature Communications. 5, 3356 (2014).</li><li>Sharma, S., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fusion+pore,+60+years+after+the+first+cartoon.">The fusion pore, 60 years after the first cartoon.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).</li><li>Jorgacevski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+tuning+of+vesicle+merger+and+fusion+pore+properties.">Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).</li><li>Rituper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+cholesterol+controls+exocytotic+fusion+pore.">Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore.</a> Cell Calcium. 101, 102503 (2021).</li><li>Gucek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+negative+SNARE+peptides+stabilize+the+fusion+pore+in+a+narrow,+release-unproductive+state.">Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).</li><li>Grabner, C. P., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+synaptic+vesicles+mediate+stimulated+exocytosis+from+cochlear+inner+hair+cells.">Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).</li><li>Wen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+provides+membrane+tension+to+merge+fusing+vesicles+into+the+plasma+membrane.">Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane.</a> Nature Communications. 7, 12604 (2016).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Membrane+Pore+in+Live+Cells+Reveals+a+Dynamic-Pore+Theory+Governing+Fusion+and+Endocytosis.">Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis.</a> Cell. 173 (4), 934-945 (2018).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+Shrinking+and+Enlargement+Play+Opposing+Roles+in+the+Release+of+Exocytotic+Contents.">Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents.</a> Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).</li><li>Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+sequential+compound+fusion+and+kiss-and-run+in+live+excitable+cells.">Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+control+of+kiss-and-run+and+vesicular+reuse+probed+with+single+nanoparticles.">The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles.</a> Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+features+between+chromaffin+and+neural+progenitor+cells.">Common features between chromaffin and neural progenitor cells.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).</li><li>Bornstein, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromaffin+cells:+the+peripheral+brain.">Chromaffin cells: the peripheral brain.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).</li><li>Park, Y., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+plasticity+of+small+synaptic+vesicle+(SSV)+and+large+dense-core+vesicle+(LDCV)+exocytosis.">Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis.</a> Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).</li><li>Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+Chromaffin+Cells:+Culture+and+Fluorescence+Assay+for+Secretion.">Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion.</a> Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+Omega-profile+closure+and+kiss-and-run+mediate+endocytosis+and+diverse+endocytic+modes+in+neuroendocrine+chromaffin+cells.">Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells.</a> Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).</li><li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells.">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).</li><li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Tension+Inhibits+Rapid+and+Slow+Endocytosis+in+Secretory+Cells.">Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells.</a> Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).</li><li>Revelo, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+probe+for+super-resolution+imaging+of+membranes+elucidates+trafficking+pathways.">A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways.</a> Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).</li><li>Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX-box+protein,+prenylation+process+and+carcinogenesis.">CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis.</a> American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+vesicles+from+frog+neuromuscular+junctions+by+prolonged+tetanic+stimulation.">Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation.</a> Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).</li><li>Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MINFLUX+nanometer-scale+3D+imaging+and+microsecond-range+tracking+on+a+common+fluorescence+microscope.">MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope.</a> Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).</li></ol>

שיטת הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית מתוארת כדי לזהות את הדינמיקה של נקבוביות היתוך ושחרור משדרים, כמו גם שלושה מצבי היתוך, היתוך קרוב, היתוך שהייה ואיחוי התכווצות בתאי כרומפין יותרת הכליה בקר 4,24. מתוארת שיטה אלקטרופיזיולוגית לדה-פולריזציה של התא ובכך לעורר א?...

היתוך ממברנה מתווך תפקודים ביולוגיים רבים, כולל העברה סינפטית, הומאוסטזיס של גלוקוז בדם, תגובה חיסונית וכניסה ויראלית 1,2,3. אקסוציטוזה, הכוללת איחוי שלפוחית בקרום הפלזמה, משחררת נוירוטרנסמיטורים והורמונים כדי להשיג פונקציות חשובות רבות, כגון פעילויות רשת עצבית. היתוך פותח נקבובית לשחרור תכולת השלפוחית, ולאחר מכן הנקבובית עשויה להיסגר כדי לאחזר את שלפוחית ההתמזגות, המכונה נשיקה והפעלה 1,4. ניתן למדוד גם את פתיחת נקבוביות ההיתוך הבלתי הפיכה וגם את פתיחת נקבוביות ההיתוך ההפוכה באמצעות הקלטות קיבוליות המחוברות לתאים בשילוב עם הקלטות מוליכות נקבוביות היתוך של נקבוביות היתוך שלפוחית בודדת.
זה מתפרש לעתים קרובות כמשקף היתוך של קריסה מלאה, הכולל התרחבות של ההיתוך עד שיטוח של שלפוחית ההתמזגות, ונשיקה וריצה, הכוללת פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, בהתאמה 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . מחקרי הדמיה אחרונים של דלדול פליטה קונפוקלית ומעוררת (STED) בתאי כרומפין צפו ישירות בפתיחת נקבוביות היתוך וסגירתן (נשיקה וריצה, הנקראת גם היתוך קרוב), פתיחת נקבוביות היתוך השומרת על צורת Ω עם נקבובית פתוחה במשך זמן רב, המכונה היתוך שהייה, וכיווץ שלפוחית ההתמזגות עד להשלמת התמזגותה עם קרום הפלזמה, המחליף היתוך קריסה מלאה למיזוג שלפוחית התמזגות עם קרום הפלזמה4, 8,14,15,16,17.
בתאי עצב, פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך זוהו עם הדמיה המציגה שחרור של נקודות קוונטיות הטעונות מראש בשלפוחיות גדולות יותר מנקבוביות ההיתוך ועם מדידות מוליכות נקבוביות היתוך בפני שחרור של מסופי עצבים 5,18,19. תאי כרומפין יותרת הכליה נמצאים בשימוש נרחב כמודל לחקר אקסו ואנדוציטוזה20,21. אף על פי שתאי כרומפין מכילים בועיות גדולות בעלות ליבה צפופה, בעוד שסינפסות מכילות בועיות סינפטיות קטנות, חלבוני האקסוציטוזה והאנדוציטוזה בתאי כרומפין וסינפסות מקבילים למדי ל-10,11,12,20,21,22,23.
כאן מתוארת שיטה למדידת שלושת מצבי ההיתוך האלה באמצעות שיטת הדמיה קונפוקלית בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה בתאי כרומפין יותרת הכליה בקר (איור 1). שיטה זו כוללת העמסה של נוירוטרנסמיטורים כוזבים פלואורסצנטיים (FFN511) לתוך שלפוחית כדי לזהות אקסוציטוזה; תוספת של Atto 655 (A655) בתמיסת האמבטיה כדי למלא את פרופיל צורת Ω שנוצר על ידי היתוך, ותיוג של קרום הפלזמה עם תחום PH של פוספוליפאז C δ (PH), הנקשר ל- PtdIns(4,5)P2 בקרום הפלזמה 8,15,24. ניתן לזהות דינמיקה של נקבוביות היתוך באמצעות שינויים בעוצמות פלואורסצנטיות שונות. למרות שהיא מתוארת עבור תאי כרומפין, העיקרון של שיטה זו המתוארת כאן יכול להיות מיושם באופן נרחב על תאים מפרישים רבים הרבה מעבר לתאי כרומפין.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td>ATP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto 655</td>
			<td>ATTO-TEC GmbH</td>
			<td>AD 655-21</td>
			<td>Atto dye to label bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Nucleofector for Primary Neurons</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VSPI-1003</td>
			<td>Electroporation transfection buffer along with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boroscilicate capillary glass pipette</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0795</td>
			<td>Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride 2 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-130-721</td>
			<td>Reagent for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>Material for filtering chromaffin cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>232041</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.1214E+10</td>
			<td>Enzyme for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-14-Laminin</td>
			<td>GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11885092</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Nucleofector</td>
			<td>Amaxa Biosystems</td>
			<td>Nucleofector II</td>
			<td>Transfect plasmids into cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFN511</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120331</td>
			<td>Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td>GTP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>WaveMetrics</td>
			<td>Igor pro</td>
			<td>Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Confocal software for imaging data collection and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Confocal microscope for imaging data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49449-100G</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Lock-in</td>
			<td>Software for capacitance recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride 1 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3120</td>
			<td>Counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mNG(mNeonGreen)</td>
			<td>Allele Biotechnology</td>
			<td>ABP-FP-MNEONSB</td>
			<td>Template for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh filtering screen 100 micron</td>
			<td>EIKO filtering co</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>Material for filtering medulla suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp EPC-10</td>
			<td>Heka</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td>Amplifier for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH-EGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #51407</td>
			<td>Backbone for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Make pipettes for patch-clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5404-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse software</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Pulse</td>
			<td>Software for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1943/QR-40LP</td>
			<td>coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution, bath solution and internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hot plate</td>
			<td>Barnsted/Thermolyne</td>
			<td>type 10100</td>
			<td>Heater for pipette coating with wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 30 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302832</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2265-100G</td>
			<td>TEA for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9253-5G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid</td>
			<td>Leica</td>
			<td>195371-10-9</td>
			<td>Leica confocal mounting oil</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells

פתיחת נקבוביות היתוך דינמיות וסגירתן מתווכות אקסוציטוזה ואנדוציטוזה וקובעות את הקינטיקה שלהן. כאן, הוא מודגם בפירוט כיצד נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית בשילוב עם רישום מהדק טלאי כדי לזהות שלושה מצבי היתוך בתאי כרומפין יותרת הכליה של התרבית הראשונית. שלושת מצבי ההיתוך כוללים 1) היתוך קרוב (המכונה גם נשיקה וריצה), הכוללים פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, 2) היתוך שהייה, הכולל פתיחת נקבוביות היתוך ושמירה על הנקבובית שנפתחה, ו-3) היתוך-כיווץ, הכרוך בהתכווצות של פרופיל צורת Ω שנוצר על ידי היתוך עד שהוא מתמזג לחלוטין בקרום הפלזמה.
כדי לזהות מצבי היתוך אלה, קרום הפלזמה סומן על ידי ביטוי יתר של mNeonGreen המחובר לתחום PH של פוספוליפאז C δ (PH-mNG), הנקשר לפוספטידילינוזיטול-4,5-ביספוספט (PtdIns(4,5)P2) בעלון הפונה לציטוזול של קרום הפלזמה; שלפוחיות היו עמוסות עם נוירוטרנסמיטר כוזב פלואורסצנטי FFN511 כדי לזהות שחרור תוכן שלפוחית; ואטו 655 נכלל בתמיסת האמבטיה כדי לזהות סגירת נקבוביות היתוך. שלוש בדיקות פלואורסצנטיות אלה צולמו בו-זמנית במהירות של כ-20-90 אלפיות השנייה לפריים בתאי כרומפין חיים כדי לזהות פתיחת נקבוביות היתוך, שחרור תוכן, סגירת נקבוביות היתוך ושינויים בגודל השלפוחית. שיטת הניתוח מתוארת כדי להבחין בין שלושה מצבי היתוך לבין מדידות פלואורסצנטיות אלה. השיטה המתוארת כאן יכולה, באופן עקרוני, לחול על תאים מפרישים רבים מעבר לתאי כרומפין.

בעקבות ההליכים הניסיוניים שהוכחו באיור 1 ובאיור 2, תאי כרומפין מבלוטת יותרת הכליה של בקר הועתקו עם PH-mNG כדי לתייג את קרום הפלזמה; A655 נוסף לתמיסת האמבטיה כדי לזהות סגירת נקבוביות היתוך; והנוירוטרנסמיטר הכוזב הפלואורסצנטי FFN511 הועמס בשלפוחיות לזיהוי שחרור. לאח...

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells at JoVE.com

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה קונפוקלית לזיהוי שלושה מצבי איחוי בתאי כרומפין של יותרת הכליה בקר. מצבי היתוך אלה כוללים 1) היתוך קרוב (המכונה גם נשיקה וריצה), הכוללים פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, 2) היתוך שהייה, הכולל פתיחת נקבוביות היתוך ושמירה על הנקבוביות שנפתחו, ו-3) היתוך-כיווץ, הכולל התכווצות שלפוחית מתמזגת.

מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת שלושה מצבים של דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין של יותרת הכליה

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...

היתוך ממברנה מתווך פונקציות ביולוגיות רבות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזיהוי דינמיקה של פתיחת נקבוביות היתוך ושחרור משדרים והבחנה בין שלושה מצבי היתוך:סגירת היתוך, היתוך שהייה והתכווצות היתוך. השילוב של מיקרוסקופ קונפוקלי ורישום מהדק טלאי מאפשר הדמיה של פתיחת נקבוביות היתוך וסגירה וקביעת הקינטיקה שלהן.למרות שהוא מתואר עבור תאי כרומפין, עקרון השיטה המתוארת כאן יכול להיות מיושם באופן נרחב על תאים מפרישים רבים הרבה מעבר לתאי כרומפין. יישום מוצלח של שיטה זו תלוי במספר שלבים כלליים, כגון יצירת תרבית תאים כרומפינית ראשונית בריאה, יעילות מספקת של טרנספקציה של פלסמיד ושיעורי הצלחה גבוהים ברישום אלקטרופיזיולוגי. בחר שלוש בלוטות שלמות ללא חתכים או דימומים על פני השטח והסר את רקמת השומן עם מספריים.לשטוף את הבלוטות על ידי זלוף עם הפתרון של לוק עד שלא יוצא דם. לעיכול, הזריקו את תמיסת האנזים דרך וריד יותרת הכליה באמצעות מזרק 30 מילימטר המחובר למסנן של 0.22 מיקרומטר עד שהבלוטה מתחילה להתנפח. לאחר מכן להשאיר את הבלוטות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.להזריק שוב ולהשאיר את הבלוטות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות נוספות. לאחר העיכול, לחתוך את הבלוטה אורכית מן הווריד יותרת הכליה לקצה השני עם מספריים כדי לפתוח את הבלוטה. בודדו את המדולה הלבנה על ידי פינצטה לחתיכות לתוך צלחת פטרי באורך 10 סנטימטרים המכילה את התמיסה של לוק.חותכים וכורכים את המדולה במספריים. סנן את תרחיף המדולה באמצעות רשת ניילון בגודל 80 עד 100 מיקרומטר לכוס. מעבירים את התסיס לצינור חרוטי של 50 מיליליטר וצנטריפוגט בטמפרטורת חדר של 48x גרם למשך שלוש דקות עם האטה של שלוש.לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והחזיר את גלולת התא עם התמיסה של לוק על ידי צנרת. סנן את תרחיף התא עם מסננת של 80 עד 100 מיקרומטר וצנטריפוגט בטמפרטורת חדר של 48 x גרם במשך שלוש דקות עם האטה שלוש. מוציאים את הסופרנאטנט ומחזירים את גלולת התא עם 30 מיליליטרים של מדיום תרבית.קבע את מספר התא באמצעות תא ספירה של המוציטומטר. להעביר 2, 800, 000 תאים לתוך צינור 15 מיליליטר. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה ב 48 x g במשך שתי דקות עם האטה של שלושה.הוסף 100 מיקרוליטרים של מאגר טרנסקציה המסופק על ידי היצרן לכדור התא. ואז להוסיף שני מיקרוגרם של פלסמיד PH-mNG. ערבבו בעדינות את המתלים על ידי צנרת התמיסה למעלה ולמטה והעבירו את התערובת לקובט אלקטרופורציה ללא דיחוי.העבר מיד את הקובט לאלקטרופורטור, בחר את תוכנית 005 ברשימת המסך והקש Enter כדי לבצע אלקטרופורציה. לאחר אלקטרופורציה, מיד להוסיף 1.8 מיליליטר של מדיום לקובט ולערבב בעדינות עם micropipette מצויד קצה סטרילי. הוסיפו 300 מיקרוליטרים של ההשעיה של התאים האלקטרו-פוריים על החלקת הכיסוי בכל צלחת בציפוי של חמישה עד שישה כלים בסך הכל לתגובת אלקטרופורציה אחת.מעבירים בזהירות את הכלים לחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 9% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות ומוסיפים בעדינות שני מיליליטרים של מדיום מוכן מראש לכל מנה לאחר 30 דקות. מכינים פיפטות טלאים מנימי זכוכית בורוסיליקט על ידי משיכתם במשיכת פיפטה, ציפוי קצותיהם בשעווה נוזלית וליטושם במיקרופורז'. הפעל את מגבר ההקלטה של מהדק התיקון והפעל את התוכנה.הגדר את הפרמטרים המתאימים של זרם הסידן והקלטת הקיבוליות של התוכנה. קבע פרוטוקול הקלטה של 60 שניות בסך הכל כאשר הגירוי מתחיל ב-10 שניות. הגדר את פוטנציאל ההחזקה של רישום מהדק מתח ל-80 מיליבולטים.קבעו דה-פולריזציה של שנייה אחת ממינוס 80 מיליוולט ל-10 מיליוולטים כגירוי לגרום לזרימת סידן וקפיצת קיבוליות. הפעל את מערכת המיקרוסקופ הקונפוקלית והגדר את הפרמטרים המתאימים בתוכנה. הפעילו את הלייזרים, כולל 458 ננומטרים, 514 ננומטרים ו-633 ננומטרים וקבעו את טווח איסוף הפליטות עבור כל לייזר לפי כל גשושית פלואורסצנטית.בחרו מנה עם מצב תא טוב וביטוי נכון והוסיפו שני מיקרוליטרים של נוירוטרנסמיטר פלואורסצנטי FFN511 לתוך המדיום בצלחת. מחזירים את המנה לאינקובטור למשך 20 דקות. לאחר טעינת FFN511, הכינו את תא ההקלטה והוסיפו שני מיקרוליטרים של צבע פלואורסצנטי A655 לתוך 50 מיקרוליטרים של תמיסת אמבטיה.מעבירים את פתק העטיפה מהתבשיל לתא ההקלטה עם פינצטה ומיד מוסיפים את תמיסת ה-A655 המכילה אמבטיה. הניחו טיפת שמן על יעד טבילת השמן 100X. הרכיבו את התא במיקרוסקופ והשתמשו בידית הכוונון כדי לגרום לשמן פשוט ליצור קשר עם החלקה התחתונה של הכיסוי.הכניסו את התאים למיקוד והשתמשו בשדה בהיר ובהדמיה קונפוקלית כדי למצוא תא מתאים עם ביטוי mNG. הגדל את התצוגה של התא שנבחר ומרכז אותו בשדה הראייה, תוך מזעור אזורים ריקים. הגדר פרמטרים להדמיה קונפוקלית של מישור XY במישור Z קבוע של FFN511, PH-mNG ו- A665 עם מרווח זמן מינימלי.התאם את המיקוד לתחתית התא באמצעות ידית כוונון עדינה. התאם את עוצמת הלייזר של העירור בתוכנה כדי למצוא הגדרה שתקבל את יחס האות לרעש הטוב ביותר ותמנע הלבנה פלואורסצנטית משמעותית. מוסיפים תשעה מיקרוליטרים של תמיסה פנימית לתוך פיפטת טלאי ומחברים את הפיפטה למחזיק שלב מגבר מהדקי התיקון.יש למרוח כמות קטנה של לחץ חיובי עם מזרק ולהזיז את קצה הפיפטה כדי לגעת בתמיסת האמבטיה עם מיקרומניפולטור. ודא שהמגבר מראה שהתנגדות הפיפטה היא בערך בין שניים לארבעה מגה-כמס עם בדיקת דופק מתח. לחץ על LJ/Auto כדי לבטל את הצומת הנוזלי.הזיזו את הפיפטה לכיוון התא שנבחר באמצעות מיקרומניפולטור. כדי ליצור מצב מחובר לתא, הזז את קצה הפיפטה כדי לגעת בתא. שנה את פוטנציאל ההחזקה מאפס למינוס 80 מיליוולטים תוך הפעלת לחץ שלילי עדין עם מזרק.לאחר שההתנגדות עוברת ג'יגה-אוהם אחד, המתן כ-30 שניות עד שהתצורה תתייצב. לחץ על C-fast/Auto כדי לפצות על קיבוליות מהירה. כדי ליצור מצב סיטונאי, להחיל פולסים קצרים אך חזקים של לחץ שלילי עם המזרק עד הקרום נקרע.לחץ על C-slow/Auto כדי לפצות על קיבוליות איטית. התאם מעט את מוקד ההדמיה כדי להתמקד בתחתית התא. התחל את ההדמיה של קיטועי הזמן הקונפוקלי ואת הקלטת מהדק התיקון בו-זמנית על-ידי לחיצה על הלחצנים התחל עם שני יישומי תוכנה שונים.לאחר ההקלטה, ודא שהנתונים נשמרים. שנה את פוטנציאל ההחזקה בחזרה לאפס מיליבולטים. מזיזים את הפיפטה מתמיסת האמבטיה ומשליכים אותה.פתח את קבצי ההדמיה הגולמיים עם כל יצרן או תוכנה שסופקה. עבור אל Process, לחץ על ProcessTools והשתמש בכלים כדי ליצור קבצים ממוצעים מתגלגלים עבור כל תמונה של פגרת זמן. שמור קבצים אלה.תחת כימות, עבור אל כלים ולחץ על לחצני פרופיל מחסנית כדי לבדוק נקודות זמן לפני ואחרי הגירוי ולזהות שינויים פלואורסצנטיים בכל ערוץ. לחץ על לחצן ציור אליפסה כדי להקיף אזורי עניין עבור אירועי היתוך. לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולחץ על שמור ROIs כדי לשמור.לחץ על פתח פרויקטים כדי לאתר את הקובץ הגולמי. לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולחץ על Load ROIs כדי לטעון את קובץ ההחזר על ההשקעה בקובץ ההדמיה הגולמי כדי למדוד את עוצמות הפלואורסצנציה. עבור אל כלים ולחץ על מיין ROIs בתוכנה והתווה את העקבות עבור כל שלושת הערוצים של כל החזר השקעה.לחץ על דווח כדי לשמור את נתוני ההחזר על ההשקעה, כולל מעקבי נתונים דיגיטליים והדמיה עבור כל החזר השקעה בתיקיית קבצים. כל ההקלטה של מהדק התא ויישום של דה-פולריזציה של שנייה אחת מ-80 עד 10 מיליבולטים בוצעה כדי לעורר אקסו ואנדוציטוזה. הדפולריזציה המיושמת גרמה לזרם סידן פנימי, קפיצת קיבוליות, המציינת אקסוציטוזה, ודעיכה קיבולית לאחר הקפיצה, מה שמעיד על אנדוציטוזה.עם הדמיית קיטועי זמן בקרקעית התא, אירועי היתוך המושרים על ידי פרוטוקול הדה-פולריזציה של שנייה אחת צוינו כירידה ב-FFN המשקפת שחרור FFN511, מלווה בעלייה פלואורסצנטית נקודתית של FPH ו-A655, המשקפת את הדיפוזיה PH-mNG ו-A655 מממברנת הפלזמה ואת תמיסת האמבטיה לתוך שלפוחית ההתמזגות. האיור מציג היתוך קרוב שזוהה כעמעום F655, בעוד ש-FPH נמשך או נרקב עם עיכוב. האיור מייצג היתוך שהייה שזוהה על ידי נוכחות של נקודות PH-mNG ו- A655.האיור מייצג היתוך כיווץ שזוהה כדעיכה מקבילית של FPH ו-F655 המלווה בהקטנת גודל מקבילה של נקודת PH-mNG ונקודת A655 הקלטה מוצלחת דורשת יצירת תצורת התא כולה עם מהדק טלאי והדמיה בתחתית התא בעוצמה פלואורסצנטית מתאימה לכל ערוץ. השילוב של אלקטרופיזיולוגיה ומיקרוסקופיה סופר-רזולוציה המתוארת כאן הוא כלי רב ערך למדידת דינמיקה של נקבוביות היתוך ונוירו-מעגלים עצביים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

ניתוח Confocal תלת ממדי של מרקרי Microglia / מקרופאג של קיטוב בניסויי פגיעה מוחית

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

שיטות למדידת קיבול מצורף סלולארי בתא עכבר הכליה Chromaffin

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

TIRFM וGFP-בדיקות pH רגיש להערכת נוירוטרנסמיטר שלפוחיות Dynamics בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה: הדמיה נייד וניתוח נתונים

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

מלכודת בתיווך Fusion של יחיד Proteoliposomes עם Bilayers Tethered הנתמך בתוך תא זרימת Microfluidic מנוטר על ידי Polarized TIRF מיקרוסקופי

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

מתח ומות תא מפעיל באמצעות מיקרוסקופ Confocal הקונבנציונלי UV הליזר

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...