Name: confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells
Uploaded: 2022-03-16T14:30:00
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我々は、この作業を支援してくれたNINDS壁内研究プログラム(ZIA NS003009-13およびZIA NS003105-08)に感謝する。

注:動物の使用手順はNIHのガイドラインに従い、NIH動物愛護および使用委員会によって承認されました。
1. ウシクロマフィン細胞培養
<ol><li>クロマフィン細胞培養の1日前にロックの溶液(表1)とオートクレーブツールを調製する。</li>
	<li>培養日に地元の食肉処理場からウシ副腎を入手し、解剖前に氷冷したロックの溶液に沈めておく。 注:副?...

<ol>
	<li>Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pores+and+their+control+of+neurotransmitter+and+hormone+release.">Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release.</a> Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).</li><li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion.">Viral membrane fusion.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).</li><li>Zhao, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemi-fused+structure+mediates+and+controls+fusion+and+fission+in+live+cells.">Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells.</a> Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).</li><li>Klyachko, V. A., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitance+steps+and+fusion+pores+of+small+and+large-dense-core+vesicles+in+nerve+terminals.">Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals.</a> Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).</li><li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Chiang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-fusion+structural+changes+and+their+roles+in+exocytosis+and+endocytosis+of+dense-core+vesicles.">Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles.</a> Nature Communications. 5, 3356 (2014).</li><li>Sharma, S., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fusion+pore,+60+years+after+the+first+cartoon.">The fusion pore, 60 years after the first cartoon.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).</li><li>Jorgacevski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+tuning+of+vesicle+merger+and+fusion+pore+properties.">Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).</li><li>Rituper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+cholesterol+controls+exocytotic+fusion+pore.">Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore.</a> Cell Calcium. 101, 102503 (2021).</li><li>Gucek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+negative+SNARE+peptides+stabilize+the+fusion+pore+in+a+narrow,+release-unproductive+state.">Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).</li><li>Grabner, C. P., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+synaptic+vesicles+mediate+stimulated+exocytosis+from+cochlear+inner+hair+cells.">Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).</li><li>Wen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+provides+membrane+tension+to+merge+fusing+vesicles+into+the+plasma+membrane.">Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane.</a> Nature Communications. 7, 12604 (2016).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Membrane+Pore+in+Live+Cells+Reveals+a+Dynamic-Pore+Theory+Governing+Fusion+and+Endocytosis.">Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis.</a> Cell. 173 (4), 934-945 (2018).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+Shrinking+and+Enlargement+Play+Opposing+Roles+in+the+Release+of+Exocytotic+Contents.">Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents.</a> Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).</li><li>Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+sequential+compound+fusion+and+kiss-and-run+in+live+excitable+cells.">Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+control+of+kiss-and-run+and+vesicular+reuse+probed+with+single+nanoparticles.">The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles.</a> Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+features+between+chromaffin+and+neural+progenitor+cells.">Common features between chromaffin and neural progenitor cells.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).</li><li>Bornstein, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromaffin+cells:+the+peripheral+brain.">Chromaffin cells: the peripheral brain.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).</li><li>Park, Y., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+plasticity+of+small+synaptic+vesicle+(SSV)+and+large+dense-core+vesicle+(LDCV)+exocytosis.">Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis.</a> Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).</li><li>Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+Chromaffin+Cells:+Culture+and+Fluorescence+Assay+for+Secretion.">Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion.</a> Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+Omega-profile+closure+and+kiss-and-run+mediate+endocytosis+and+diverse+endocytic+modes+in+neuroendocrine+chromaffin+cells.">Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells.</a> Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).</li><li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells.">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).</li><li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Tension+Inhibits+Rapid+and+Slow+Endocytosis+in+Secretory+Cells.">Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells.</a> Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).</li><li>Revelo, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+probe+for+super-resolution+imaging+of+membranes+elucidates+trafficking+pathways.">A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways.</a> Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).</li><li>Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX-box+protein,+prenylation+process+and+carcinogenesis.">CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis.</a> American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+vesicles+from+frog+neuromuscular+junctions+by+prolonged+tetanic+stimulation.">Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation.</a> Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).</li><li>Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MINFLUX+nanometer-scale+3D+imaging+and+microsecond-range+tracking+on+a+common+fluorescence+microscope.">MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope.</a> Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).</li></ol>

共焦点顕微鏡画像化法は、ウシ副腎クロマフィン細胞4,24における融合孔および伝達物質放出のダイナミクス、ならびに3つの融合モード、近接融合、ステイ融合、および収縮融合を検出するために記載されている4,24。細胞を脱分極させ、それによってエキソ細胞症およびエンドサイトーシスを呼び起こす電気生理学的方法が記載されている。体系?...

膜融合は、シナプス伝達、血糖恒常性、免疫応答、およびウイルス侵入を含む多くの生物学的機能を媒介する1,2,3。原形質膜での小胞融合を伴うエキソサイトーシスは、神経伝達物質およびホルモンを放出し、ニューロンネットワーク活動などの多くの重要な機能を達成する。融合は、小胞内容物を放出するために細孔を開き、その後、細孔が融合小胞を取り出すために閉じ得る、これはキスアンドラン1,4と呼ばれる。不可逆的および可逆的な融合孔開口の両方は、単一小胞融合の融合細孔コンダクタンス記録と組み合わせた細胞付着容量記録で測定することができる。
これはしばしば、融合小胞の平坦化までの融合の拡張を伴う完全崩壊融合、および融合孔の開閉を伴うキスアンドランを反映していると解釈され、それぞれ5、6、7、8、9、10、11、12、13.クロマフィン細胞における最近の共焦点および誘導放出枯渇(STED)イメージング研究は、融合孔の開閉(キスアンドラン、クローズフュージョンとも呼ばれる)、ステーフュージョンと呼ばれる、長期間にわたって開いた細孔でΩ形状を維持する融合ポア開口部、および原形質膜と完全に融合するまでの融合小胞の収縮、原形質膜と融合小胞を融合させるための完全崩壊融合を置き換える4、 8,14,15,16,17。
ニューロンにおいて、融合細孔の開閉は、融合孔よりも大きい小胞に予め装填された量子ドットの放出を示す画像化および神経終末の放出面における融合細孔コンダクタンス測定5、18、19によって検出されている。副腎クロマフィン細胞は、外細胞症およびエンドサイトーシスの研究のためのモデルとして広く使用されている20,21。クロマフィン細胞は大きな緻密なコア小胞を含むが、シナプスは小さなシナプス小胞を含むが、クロマフィン細胞およびシナプスにおけるエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスタンパク質は、10、11、12、20、21、22、23と非常に類似している。
ここでは、ウシ副腎クロマフィン細胞における電気生理学と組み合わせた共焦点イメージング法を用いてこれら3つの融合モードを測定する方法について説明する(図1)。この方法は、エキソサイトーシスを検出するために小胞に蛍光偽神経伝達物質(FFN511)をロードすることを含む。Atto 655(A655)を浴液に添加して融合生成したΩ形プロファイルを充填し、原形質膜8、15、24でPtdIns(4,5)P2に結合するホスホリパーゼC δ(PH)のPHドメインで原形質膜を標識する。融合細孔ダイナミクスは、異なる蛍光強度の変化によって検出することができる。クロマフィン細胞について記載されているが、ここで説明するこの方法の原理は、クロマフィン細胞をはるかに超えた多くの分泌細胞に広く適用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td>ATP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto 655</td>
			<td>ATTO-TEC GmbH</td>
			<td>AD 655-21</td>
			<td>Atto dye to label bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Nucleofector for Primary Neurons</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VSPI-1003</td>
			<td>Electroporation transfection buffer along with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boroscilicate capillary glass pipette</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0795</td>
			<td>Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride 2 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-130-721</td>
			<td>Reagent for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>Material for filtering chromaffin cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>232041</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.1214E+10</td>
			<td>Enzyme for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-14-Laminin</td>
			<td>GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11885092</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Nucleofector</td>
			<td>Amaxa Biosystems</td>
			<td>Nucleofector II</td>
			<td>Transfect plasmids into cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFN511</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120331</td>
			<td>Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td>GTP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>WaveMetrics</td>
			<td>Igor pro</td>
			<td>Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Confocal software for imaging data collection and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Confocal microscope for imaging data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49449-100G</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Lock-in</td>
			<td>Software for capacitance recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride 1 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3120</td>
			<td>Counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mNG(mNeonGreen)</td>
			<td>Allele Biotechnology</td>
			<td>ABP-FP-MNEONSB</td>
			<td>Template for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh filtering screen 100 micron</td>
			<td>EIKO filtering co</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>Material for filtering medulla suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp EPC-10</td>
			<td>Heka</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td>Amplifier for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH-EGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #51407</td>
			<td>Backbone for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Make pipettes for patch-clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5404-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse software</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Pulse</td>
			<td>Software for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1943/QR-40LP</td>
			<td>coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution, bath solution and internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hot plate</td>
			<td>Barnsted/Thermolyne</td>
			<td>type 10100</td>
			<td>Heater for pipette coating with wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 30 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302832</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2265-100G</td>
			<td>TEA for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9253-5G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid</td>
			<td>Leica</td>
			<td>195371-10-9</td>
			<td>Leica confocal mounting oil</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells

動的融合細孔開閉は、エキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスを媒介し、それらの動態を決定する。ここでは、共焦点顕微鏡をパッチクランプ記録と組み合わせて使用して、初代培養ウシ副腎クロマフィン細胞における3つの融合モードを検出する方法を詳細に実証する。3つの融合モードには、1)融合孔の開閉を伴う密閉核(キスアンドランとも呼ばれる)、2)融合孔の開口と開いた細孔の維持を含むステイ融合、3)核融合によって生成されたΩ形プロファイルの収縮を伴う蠕動融着が含まれる原形膜で完全に融合する。
これらの融合モードを検出するために、原形質膜を標識し、原形質膜の細胞質ゾル対向小葉においてホスファチジルイノシトール-4,5-ビスリン酸(PtdIns(4,5)P2)に結合するホスホリパーゼC δ(PH-mNG)のPHドメインと結合するmNeonGreenを過剰発現させた。小胞に蛍光偽神経伝達物質FFN511をロードして、小胞内容物放出を検出した。Atto 655を融合孔閉鎖を検出するために浴液に含ませた。これら3つの蛍光プローブを生クロマフィン細胞で1フレームあたり約20〜90ミリ秒で同時に画像化し、融合孔開口、内容物放出、融合細孔閉鎖、および融合小胞サイズ変化を検出した。分析方法は、これらの蛍光測定から3つの融合モードを区別するために説明されています。ここで説明する方法は、原則として、クロマフィン細胞以外の多くの分泌細胞に適用することができる。

図1および図2に示される実験手順に従って、ウシ副腎由来のクロマフィン細胞をPH−mNGでトランスフェクトし、原形質膜を標識した。A655を浴液に添加して、融合孔閉鎖を検出した。蛍光偽神経伝達物質FFN511を放出の検出のために小胞に装填した。次に、FFN511、PH-mNG、およびA655のXY面共焦点タイムラプスイメージングを、細胞底部(細胞膜上方のZ焦点...

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Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

このプロトコルは、ウシ副腎クロマフィン細胞における3つの融合モードを検出するための共焦点イメージング技術を記述する。これらの融合モードには、1)融合孔の開閉を伴う近接融着(キスアンドランとも呼ばれる)、2)融合孔の開口および開放された細孔の維持を伴うステイ融合、および3)融合小胞収縮を伴う収縮融合が含まれる。

副腎クロマフィン細胞における融合細孔ダイナミクスの3つのモードを測定するための共焦点顕微鏡

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...

膜融合は多くの生物学的機能を媒介する。このプロトコルは、核融合孔の開口ダイナミクスと送信機の放出ダイナミクスを検出し、3つの融合モード(クローズフュージョン、ステイフュージョン、シュリンクフュージョン)を区別する方法を説明しています。共焦点顕微鏡とパッチクランプ記録の組み合わせにより、融合孔の開閉の可視化と、その動力学の決定が容易になります。クロマフィン細胞について説明したが、ここで説明する方法の原理は、クロマフィン細胞をはるかに超えた多くの分泌細胞に広く適用することができる。この方法の正常な実施は、健康な初代クロマフィン細胞培養物の生成、十分なプラスミドトランスフェクション効率、および高い電気生理学的記録成功率など、いくつかの一般的なステップに依存する。表面に切り傷や出血のない3つの無傷の腺を選択し、はさみで脂肪組織を除去します。血液が出なくなるまでロックの溶液で灌流して腺を洗う。消化のために、腺が腫れ始めるまで、0.22マイクロメートルのフィルターを取り付けた30ミリメートルのシリンジを使用して、副腎静脈を通して酵素溶液を注入する。その後、腺を摂氏37度に10分間放置します。もう一度注射し、腺を摂氏37度でさらに10分間放置する。消化後、副腎静脈から反対側の端まで腺を縦方向に切断し、腺を広げる。白い髄質を、ロックの溶液を含む10センチメートルのペトリ皿に細かくつまんで分離します。はさみで髄質を切ってミンチにします。80〜100マイクロメートルのナイロンメッシュで髄質懸濁液をビーカーにろ過します。濾液を50ミリリットルの円錐管に移し、48 x gの室温で3分間、3回の減速で遠心分離する。遠心分離後、上清を除去し、ピペッティングにより細胞ペレットをロック溶液で再懸濁する。細胞懸濁液を80〜100マイクロメートルのストレーナーで濾過し、48 x gの室温で3分間減速3分間遠心分離する。上清を除去し、細胞ペレットを30ミリリットルの培養液で再懸濁した。血球計数計数器計数チャンバーを用いて細胞数を決定する。2, 800, 000セルを15ミリリットルのチューブに移す。3回の減速で2分間、48 x gで遠心分離することによって細胞をペレット化する。製造業者から提供された100マイクロリットルの切除バッファーを細胞ペレットに加える。次いで、2マイクログラムのPH-mNGプラスミドを加える。溶液を上下に配管して懸濁液を穏やかに混合し、混合物を遅滞なくエレクトロポレーションキュベットに移す。すぐにキュベットをエレクトロポレーターに移し、画面リストで005プログラムを選択し、Enterキーを押してエレクトロポレーションを実行します。エレクトロポレーション後、直ちに1.8ミリリットルの培地をキュベットに加え、滅菌チップを備えたマイクロピペットで穏やかに混合する。エレクトロポレーションされたセルの懸濁液300マイクロリットルを各ディッシュのカバースリップ上に加え、合計5〜6個のディッシュを1回のエレクトロポレーション反応のためにメッキする。皿を摂氏37度の加湿インキュベーターに9%の二酸化炭素で30分間慎重に移し、30分後に2ミリリットルの予温培地を各皿に静かに加える。ホウケイ酸ガラス毛細血管からパッチピペットをピペットプーラーで引っ張り、先端を液体ワックスでコーティングし、マイクロフォージで研磨して準備します。パッチクランプ記録アンプの電源を入れ、ソフトウェアを起動します。ソフトウェアの適切なカルシウム電流と静電容量の記録パラメータを設定します。刺激が10秒から始まる合計で60秒の持続時間の記録プロトコルを設定します。電圧クランプ記録の保持電位を80ミリボルトに設定します。カルシウム流入と静電容量ジャンプを誘導する刺激として、マイナス80ミリボルトから10ミリボルトまでの1秒間の分極解除を設定します。共焦点顕微鏡システムの電源を入れ、ソフトウェアで適切なパラメータを設定します。458ナノメートル、514ナノメートル、633ナノメートルなどのレーザーをオンにし、各蛍光プローブに応じて各レーザーの発光収集範囲を設定します。良好な細胞状態および適切な発現を有するディッシュを選択し、2マイクロリットルの蛍光偽神経伝達物質FFN511をディッシュ内の培地に加える。皿をインキュベーターに20分間戻します。FFN511を装填した後、記録チャンバーを準備し、50マイクロリットルの浴液に2マイクロリットルの蛍光色素A655を加える。カバースリップを皿からピンセットで記録室に移し、すぐにA655入り浴液を加えます。100Xオイル浸漬対物レンズにオイルを1滴置きます。チャンバーを顕微鏡に取り付け、調整ノブを使用してオイルがカバースリップの底にちょうど接触するようにします。細胞に焦点を合わせ、明視野および共焦点イメージングを使用して、mNG発現を有する適切な細胞を見つける。選択したセルを拡大し、視野の中央に配置して、空白領域を最小限に抑えます。FFN511、PH-mNG、およびA665の固定Z平面でXY平面共焦点イメージングのパラメータを最小の時間間隔で設定します。微調整ノブでセルの下部にフォーカスを調整します。ソフトウェアで励起レーザー出力を調整して、最適な信号対雑音比を取得し、著しい蛍光漂白を回避するための設定を見つけます。9マイクロリットルの内部溶液をパッチピペットに加え、ピペットをパッチクランプアンプステージのホルダーに取り付けます。シリンジで少量の陽圧をかけ、ピペットチップを動かしてマイクロマニピュレーターで浴液に触れます。電圧パルステストで、ピペット抵抗が約2~4メガオームであることをアンプが示していることを確認します。LJ/Autoを押して液体接合部をキャンセルします。マイクロマニピュレーターでピペットを選択したセルに向かって移動させます。セル装着モードを形成するには、ピペットチップを動かしてセルに触れます。シリンジで穏やかな負圧をかけながら、保持電位をゼロからマイナス80ミリボルトに変更します。抵抗が1ギガオームを超えたら、構成が安定するまで約30秒間待ちます。C-fast/Autoを押して、高速容量を補償します。卸売モードを形成するには、膜が破裂するまでシリンジで負圧の短いながらも強力なパルスを適用します。C-slow/Autoを押して、遅い容量を補償します。イメージングの焦点を少し調整して、セルの底に焦点を合わせます。共焦点タイムラプスイメージングとパッチクランプ記録を同時に開始するには、2つの異なるソフトウェアアプリケーションで[スタート]ボタンをクリックします。記録後、データが保存されていることを確認します。保持電位をゼロミリボルトに戻します。ピペットをバス溶液から取り出して廃棄します。製造元または付属のソフトウェアで生のイメージングファイルを開きます。プロセスに移動し、ProcessToolsをクリックし、ツールを使用して各タイムラプス画像のローリング平均ファイルを生成します。これらのファイルを保存します。定量化で、[ツール]に移動し、[スタックプロファイル]ボタンをクリックして、刺激の前後の時間ポイントを確認し、各チャンネルの蛍光変化を特定します。[楕円を描画] ボタンをクリックして、フュージョン イベントの対象領域を丸で囲みます。画像を右クリックし、[ROIを保存]をクリックして保存します。「プロジェクトを開く」をクリックして、生ファイルを見つけます。画像を右クリックし、[ROIのロード]をクリックしてROIファイルを生のイメージングファイルにロードし、蛍光強度を測定します。[ツール]に移動し、ソフトウェアの[ROIのソート]をクリックし、各ROIの3つのチャネルすべてのトレースをプロットします。[レポート] をクリックして、デジタル データや各 ROI のイメージング トレースなどの ROI データをファイル フォルダーに保存します。全細胞パッチクランプ記録および80〜10ミリボルトの1秒間の脱分極の適用を行い、エキソおよびエンドサイトーシスを呼び起こした。印加された脱分極は、内向きのカルシウム電流を誘導し、静電容量ジャンプはエキソサイトーシスを示し、ジャンプ後の静電容量減衰はエンドサイトーシスを示す。細胞底部でのタイムラプスイメージングでは、1秒間の脱分極プロトコルによって誘導された融合事象は、FFN511放出を反映したFFN減少として示され、FPHおよびA655スポット蛍光増加を伴い、原形質膜および浴液から融合小胞へのPH-mNGおよびA655拡散を反映する。この図は、F655調光と同定された密接な融合を示し、FPHは遅延して持続または崩壊した。この図は、PH-mNGおよびA655スポットの両方の存在によって検出されたステイフュージョンを表す。この図は、PH-mNGスポットとA655スポットの平行なサイズ縮小を伴う平行FPHおよびF655崩壊として検出される収縮融着を表し、記録を成功させるには、パッチクランプでセル全体の構成を生成し、各チャネルに対して適切な蛍光強度でセル下部にイメージングする必要があります。ここで説明する電気生理学と超解像顕微鏡の組み合わせは、融合細孔ダイナミクスと神経回路を測定するための貴重なツールです。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

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無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

実験的脳損傷における偏光のミクログリア/マクロファージマーカーの三次元共焦点解析

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

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脳スライスビオチン：<em&gt;生体外</emアダルトニューロンにおいて地域固有の細胞膜のタンパク質輸送を測定するために&gt;の取り組み

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

マウス副腎クロマフィン細胞における細胞 - 添付容量測定のための方法

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

細胞イメージングおよびデータ分析：SH-SY5Y神経芽腫細胞における神経伝達物質小胞のダイナミクスを評価するためにTIRFMとpH感受性GFP-プローブ

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層​​を持つシングルプロテオリポソー​​ムのSNARE媒介性の融合

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

従来のUVレーザー共焦点顕微鏡を用いて細胞ストレスと死のトリガ

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...