Name: confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells
Uploaded: 2022-03-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells at JoVE.com

이 작업을 지원해 주신 NINDS 교내 연구 프로그램(ZIA NS003009-13 및 ZIA NS003105-08)에 감사드립니다.

참고: 동물 사용 절차는 NIH 지침을 따랐으며 NIH 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 소 크로마핀 세포 배양
<ol><li>크로마핀 세포 배양 1일 전에 로크의 용액(표 1) 및 오토클레이브 도구를 준비한다.</li>
	<li>배양 당일에 지역 축사에서 소 부신을 구하고 해부 전에 얼음처럼 차가운 로크의 용액에 잠기게하십시오. 참고 : 부신 땀샘은 21...

<ol>
	<li>Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pores+and+their+control+of+neurotransmitter+and+hormone+release.">Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release.</a> Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).</li><li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion.">Viral membrane fusion.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).</li><li>Zhao, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemi-fused+structure+mediates+and+controls+fusion+and+fission+in+live+cells.">Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells.</a> Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).</li><li>Klyachko, V. A., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitance+steps+and+fusion+pores+of+small+and+large-dense-core+vesicles+in+nerve+terminals.">Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals.</a> Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).</li><li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Chiang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-fusion+structural+changes+and+their+roles+in+exocytosis+and+endocytosis+of+dense-core+vesicles.">Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles.</a> Nature Communications. 5, 3356 (2014).</li><li>Sharma, S., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fusion+pore,+60+years+after+the+first+cartoon.">The fusion pore, 60 years after the first cartoon.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).</li><li>Jorgacevski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+tuning+of+vesicle+merger+and+fusion+pore+properties.">Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).</li><li>Rituper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+cholesterol+controls+exocytotic+fusion+pore.">Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore.</a> Cell Calcium. 101, 102503 (2021).</li><li>Gucek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+negative+SNARE+peptides+stabilize+the+fusion+pore+in+a+narrow,+release-unproductive+state.">Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).</li><li>Grabner, C. P., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+synaptic+vesicles+mediate+stimulated+exocytosis+from+cochlear+inner+hair+cells.">Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).</li><li>Wen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+provides+membrane+tension+to+merge+fusing+vesicles+into+the+plasma+membrane.">Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane.</a> Nature Communications. 7, 12604 (2016).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Membrane+Pore+in+Live+Cells+Reveals+a+Dynamic-Pore+Theory+Governing+Fusion+and+Endocytosis.">Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis.</a> Cell. 173 (4), 934-945 (2018).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+Shrinking+and+Enlargement+Play+Opposing+Roles+in+the+Release+of+Exocytotic+Contents.">Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents.</a> Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).</li><li>Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+sequential+compound+fusion+and+kiss-and-run+in+live+excitable+cells.">Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+control+of+kiss-and-run+and+vesicular+reuse+probed+with+single+nanoparticles.">The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles.</a> Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+features+between+chromaffin+and+neural+progenitor+cells.">Common features between chromaffin and neural progenitor cells.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).</li><li>Bornstein, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromaffin+cells:+the+peripheral+brain.">Chromaffin cells: the peripheral brain.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).</li><li>Park, Y., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+plasticity+of+small+synaptic+vesicle+(SSV)+and+large+dense-core+vesicle+(LDCV)+exocytosis.">Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis.</a> Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).</li><li>Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+Chromaffin+Cells:+Culture+and+Fluorescence+Assay+for+Secretion.">Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion.</a> Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+Omega-profile+closure+and+kiss-and-run+mediate+endocytosis+and+diverse+endocytic+modes+in+neuroendocrine+chromaffin+cells.">Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells.</a> Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).</li><li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells.">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).</li><li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Tension+Inhibits+Rapid+and+Slow+Endocytosis+in+Secretory+Cells.">Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells.</a> Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).</li><li>Revelo, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+probe+for+super-resolution+imaging+of+membranes+elucidates+trafficking+pathways.">A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways.</a> Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).</li><li>Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX-box+protein,+prenylation+process+and+carcinogenesis.">CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis.</a> American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+vesicles+from+frog+neuromuscular+junctions+by+prolonged+tetanic+stimulation.">Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation.</a> Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).</li><li>Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MINFLUX+nanometer-scale+3D+imaging+and+microsecond-range+tracking+on+a+common+fluorescence+microscope.">MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope.</a> Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).</li></ol>

공초점 현미경 이미징 방법은 융합 기공 및 송신기 방출의 역학뿐만 아니라 소 부신 크로마핀 세포4,24에서 세 가지 융합 모드, 근접 융합, 체류 융합 및 수축 융합을 검출하기 위해 설명됩니다. 세포를 탈분극시키고 이에 의해 엑소사이토시스 및 엔도사이토시스를 불러일으키는 전기생리학적 방법이 기재되어 있다. 체계적인 공초점 이미지 처리는 융합...

막 융합은 시냅스 전달, 혈당 항상성, 면역 반응 및 바이러스 진입 1,2,3을 포함한 많은 생물학적 기능을 매개합니다. 원형질막에서 소낭 융합을 포함하는 외세포증은 신경 전달 물질과 호르몬을 방출하여 신경 네트워크 활동과 같은 많은 중요한 기능을 수행합니다. 퓨전은 수포 내용물을 방출하기 위해 기공을 열고, 그 후에 기공은 키스 앤 런 1,4라고 불리는 융합 소포를 회수하기 위해 닫힐 수 있습니다. 비가역적 및 가역적 융합 기공 개방 둘 모두는 단일 소포 융합의 융합 공극 전도도 기록과 결합된 셀 부착 커패시턴스 기록으로 측정될 수 있다.
이것은 종종 융합 소포의 평탄화까지 융합의 팽창을 포함하는 완전 붕괴 융합을 반영하는 것으로 해석되며, 융합 기공 개폐를 포함하는 키스 앤 런은 각각 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . 최근 크로마핀 세포에서의 공초점 및 자극 방출 고갈(STED) 영상 연구는 융합 기공 개폐(키스 앤 런(kiss-and-run, close-fusion이라고도 함), 오랜 시간 동안 열린 기공으로 Ω 형태를 유지하는 융합 기공 개구, 체류-융합(stay-fusion)이라 불리우며, 융합된 소포가 원형질막과 완전히 병합될 때까지 융합된 소포의 축소를 직접 관찰하였으며, 이는 원형질막과 융합된 소포를 병합하기 위한 완전 붕괴 융합을 대체한다4, 8,14,15,16,17.
뉴런에서, 융합 기공 개폐는 융합 기공보다 큰 소포에 미리 로딩된 양자점의 방출을 보여주는 이미징과 신경 말단의 방출면에서의 융합 기공 전도도 측정(5,18,19)으로 검출되었다. 부신 크로마핀 세포는 exo- 및 엔도사이토시스20,21의 연구를 위한 모델로서 널리 사용된다. 크로마핀 세포에는 큰 조밀 코어 소포가 포함되어 있지만 시냅스에는 작은 시냅스 소포가 포함되어 있지만 크로마핀 세포와 시냅스의 엑소 사이토시스 및 엔도 사이토시스 단백질은 10,11,12,20,21,22,23과 매우 유사합니다.
여기에서, 소 부신 크로마핀 세포에서 전기생리학과 결합된 공초점 이미징 방법을 이용하여 이들 세 가지 융합 모드를 측정하는 방법이 설명된다(도 1). 이 방법은 형광 거짓 신경 전달 물질 (FFN511)을 소포에 로딩하여 외세포증을 검출하는 것을 포함합니다. 합착 용액에 Atto 655(A655)를 첨가하여 융해-생성된 Ω형 프로파일을 채우고, 원형질막 8,15,24에서 PtdIns(4,5)P2에 결합하는 포스포리파제 C δ(PH)의 PH 도메인으로 원형질막의 표지를 채운다. 융합 기공 역학은 상이한 형광 강도의 변화를 통해 검출될 수 있다. 크로마핀 세포에 대해 기술되었지만, 여기에 기술된 이 방법의 원리는 크로마핀 세포를 훨씬 넘어서는 많은 분비 세포에 널리 적용될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td>ATP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto 655</td>
			<td>ATTO-TEC GmbH</td>
			<td>AD 655-21</td>
			<td>Atto dye to label bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Nucleofector for Primary Neurons</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VSPI-1003</td>
			<td>Electroporation transfection buffer along with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boroscilicate capillary glass pipette</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0795</td>
			<td>Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride 2 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-130-721</td>
			<td>Reagent for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>Material for filtering chromaffin cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>232041</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.1214E+10</td>
			<td>Enzyme for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-14-Laminin</td>
			<td>GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11885092</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Nucleofector</td>
			<td>Amaxa Biosystems</td>
			<td>Nucleofector II</td>
			<td>Transfect plasmids into cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFN511</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120331</td>
			<td>Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td>GTP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>WaveMetrics</td>
			<td>Igor pro</td>
			<td>Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Confocal software for imaging data collection and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Confocal microscope for imaging data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49449-100G</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Lock-in</td>
			<td>Software for capacitance recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride 1 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3120</td>
			<td>Counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mNG(mNeonGreen)</td>
			<td>Allele Biotechnology</td>
			<td>ABP-FP-MNEONSB</td>
			<td>Template for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh filtering screen 100 micron</td>
			<td>EIKO filtering co</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>Material for filtering medulla suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp EPC-10</td>
			<td>Heka</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td>Amplifier for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH-EGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #51407</td>
			<td>Backbone for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Make pipettes for patch-clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5404-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse software</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Pulse</td>
			<td>Software for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1943/QR-40LP</td>
			<td>coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution, bath solution and internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hot plate</td>
			<td>Barnsted/Thermolyne</td>
			<td>type 10100</td>
			<td>Heater for pipette coating with wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 30 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302832</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2265-100G</td>
			<td>TEA for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9253-5G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid</td>
			<td>Leica</td>
			<td>195371-10-9</td>
			<td>Leica confocal mounting oil</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells

동적 융합 공극 개방 및 폐쇄는 엑소사이토시스 및 엔도사이토시스를 매개하고 이들의 동역학을 결정한다. 여기에서, 공초점 현미경이 일차 배양 소 부신 크로마핀 세포에서 세 가지 융합 모드를 검출하기 위해 패치-클램프 기록과 함께 어떻게 사용되었는지를 상세히 입증한다. 세 가지 융합 모드에는 1) 융합 기공 개폐 및 폐쇄를 포함하는 근접 융합 (키스 앤 런이라고도 함), 2) 융합 기공 개방 및 개방 된 기공 유지를 포함하는 체류 융합, 3) 원형질막에서 완전히 병합 될 때까지 융합 생성 된 Ω 형상 프로파일의 수축을 포함하는 수축 융합이 포함됩니다.
이들 융합 모드를 검출하기 위해, 원형질막은 포스포리파제 C δ(PH-mNG)의 PH 도메인과 부착된 mNeonGreen을 과발현시킴으로써 표지하였고, 이는 원형질막의 시토졸 대향 전단지에서 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트(PtdIns(4,5)P2)에 결합하고; 수포 함량 방출을 검출하기 위해 형광 거짓 신경전달물질 FFN511로 로딩된 소포; 및 Atto 655를 융합 기공 폐쇄를 검출하기 위해 욕조 용액에 포함시켰다. 이 세 개의 형광 프로브를 라이브 크로마핀 세포에서 프레임당 ~20-90ms로 동시에 이미징하여 융합 기공 개방, 함량 방출, 융합 기공 폐쇄 및 융합 소포 크기 변화를 검출하였다. 분석 방법은 이러한 형광 측정으로부터 세 가지 융합 모드를 구별하기 위해 설명된다. 여기에 기술된 방법은 원칙적으로 크로마핀 세포를 넘어 많은 분비 세포에 적용할 수 있다.

도 1 및 도 2에 도시된 실험 절차에 따라, 소 부신으로부터 크로마핀 세포를 PH-mNG로 형질감염시켜 원형질막을 표지하였다; A655를 융합 기공 폐쇄를 검출하기 위해 욕조 용액에 첨가하였고; 형광 거짓 신경전달물질 FFN511을 방출의 검출을 위해 소포에 로딩하였다. 다음으로, FFN511, PH-mNG 및 A655의 XY 평면 공초점 타임랩스 이미징을 세포 바닥에서 20-90 ms마다...

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells at JoVE.com

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

이 프로토콜은 소 부신 크로마핀 세포에서 세 가지 융합 모드를 검출하기 위한 공초점 이미징 기술을 기술한다. 이러한 융합 모드에는 1) 융합 기공 개폐 및 폐쇄를 포함하는 근접 융합 (키스 앤 런이라고도 함), 2) 융합 기공 개방 및 개방 된 기공 유지를 포함하는 체류 융합, 3) 융합 된 소낭 수축을 포함하는 수축 융합이 포함됩니다.

부신 크로마핀 세포에서 융합 기공 역학의 세 가지 모드를 측정하는 공초점 현미경 검사

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...

막 융합은 많은 생물학적 기능을 매개한다. 이 프로토콜은 융합 기공 개방 및 송신기 방출 역학을 감지하고 세 가지 융합 모드, 즉 근접 융합, 융합 유지 및 수축 융합을 구별하는 방법을 설명합니다. 공초점 현미경과 패치 클램프 기록의 조합은 융합 기공 개방 및 폐쇄의 시각화 및 동역학의 결정을 용이하게합니다.크로마핀 세포에 대해 기술되었지만, 여기에 기술된 방법의 원리는 크로마핀 세포를 훨씬 넘어서는 많은 분비 세포에 널리 적용될 수 있다. 이 방법의 성공적인 구현은 건강한 일차 크로마핀 세포 배양, 충분한 플라스미드 형질감염 효율 및 높은 전기생리학적 기록 성공률을 생성하는 것과 같은 몇 가지 일반적인 단계에 의존한다. 표면에 상처 나 출혈이없는 세 개의 손상되지 않은 땀샘을 선택하고 가위로 지방 조직을 제거하십시오.피가 나오지 않을 때까지 로크의 용액으로 관류하여 땀샘을 씻으십시오. 소화를 위해 땀샘이 부풀어 오르기 시작할 때까지 0.22 마이크로 미터 필터가 부착 된 30 밀리미터 주사기를 사용하여 부신 정맥을 통해 효소 용액을 주입하십시오. 그런 다음 땀샘을 섭씨 37도에서 10 분 동안 그대로 두십시오.다시 주사하고 땀샘을 섭씨 37도에서 10 분 동안 그대로 두십시오. 소화 후, 땀샘을 부신 정맥에서 다른 쪽 끝으로 세로 자르고 가위로 선을 펼치십시오. 흰색 수질을 조각으로 묶어서 로크의 용액이 들어있는 10 센티미터 페트리 접시에 넣으십시오.가위로 수질을 자르고 다듬습니다. 수질 현탁액을 80 ~ 100 마이크로미터 나일론 메쉬로 비이커에 걸러냅니다. 여액을 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 48 x g 실온에서 3 분 동안 원심분리하여 세 가지 감속으로 삼십시.원심분리 후, 상층액을 제거하고 피펫팅에 의해 로크의 용액으로 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 80 내지 100 마이크로미터 스트레이너로 여과하고, 감속 세 개로 3분 동안 48 x g 실온에서 원심분리한다. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 30 밀리리터의 배양 배지로 재현탁시켰다.혈구계 계수 챔버를 사용하여 세포 번호를 결정하십시오. 2, 800, 000 세포를 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 세 개의 감속과 함께 두 분 동안 48 x g에서 원심분리하여 세포를 펠릿화한다.제조업체가 제공 한 100 마이크로 리터의 transection 버퍼를 세포 펠렛에 첨가하십시오. 이어서, 두 마이크로그램의 PH-mNG 플라스미드를 첨가한다. 용액을 위아래로 파이핑하여 현탁액을 부드럽게 혼합하고 혼합물을 지체없이 전기 천공 큐벳으로 옮깁니다.즉시 큐벳을 전기 천공기로 옮기고 화면 목록에서 005 프로그램을 선택한 다음 Enter 키를 눌러 전기 천공을 수행하십시오. 전기 천공 후, 즉시 큐벳에 1.8 밀리리터의 배지를 넣고 멸균 팁이 장착 된 마이크로 피펫으로 부드럽게 섞으십시오. 전기천공된 전지의 현탁액 300 마이크로리터를 각 접시의 커버 슬립 상에 넣고 하나의 전기천공 반응을 위해 총 다섯 개에서 여섯 개의 접시를 도금한다.조심스럽게 접시를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터로 옮겨 9 % 이산화탄소로 30 분 동안 옮기고 30 분 후에 각 접시에 두 밀리리터의 미리 데운 배지를 부드럽게 첨가하십시오. 붕규산 유리 모세 혈관에서 패치 피펫을 피펫 풀러로 당기고 액체 왁스로 팁을 코팅하고 마이크로 단조로 연마하여 준비하십시오. 패치 클램프 기록 증폭기를 켜고 소프트웨어를 시작하십시오.소프트웨어의 적절한 칼슘 전류 및 정전 용량 기록 매개 변수를 설정하십시오. 자극이 10초에서 시작되는 총 60초 지속 시간의 기록 프로토콜을 설정합니다. 전압 클램프 기록의 유지 전위를 80밀리볼트로 설정합니다.칼슘 유입과 커패시턴스 점프를 유도하는 자극으로 영하 80밀리볼트에서 10밀리볼트로 1초 탈분극을 설정합니다. 공초점 현미경 시스템을 켜고 소프트웨어에서 적절한 매개 변수를 설정하십시오. 458 나노미터, 514 나노미터 및 633 나노미터를 포함한 레이저를 켜고 각 형광 프로브에 따라 각 레이저의 방출 수집 범위를 설정하십시오.좋은 세포 상태와 적절한 발현을 가진 접시를 선택하고 접시의 배지에 두 마이크로 리터의 형광 거짓 신경 전달 물질 FFN511을 첨가하십시오. 접시를 20 분 동안 인큐베이터에 다시 넣으십시오. FFN511을 로딩 한 후, 기록 챔버를 준비하고 50 마이크로리터의 욕조 용액에 두 마이크로리터의 형광 염료 A655를 첨가한다.접시에서 커버 슬립을 핀셋으로 녹음 챔버로 옮기고 즉시 A655 함유 욕조 용액을 추가하십시오. 100X 오일 침지 목표에 오일 한 방울을 놓습니다. 챔버를 현미경에 장착하고 조정 손잡이를 사용하여 오일이 커버 슬립의 바닥에 닿을 수 있도록하십시오.세포에 초점을 맞추고 밝은 필드 및 공초점 이미징을 사용하여 mNG 발현이 있는 적합한 세포를 찾습니다. 선택한 셀을 확대하고 시야에 가운데에 배치하여 빈 영역을 최소화합니다. 최소화된 시간 간격으로 FFN511, PH-mNG 및 A665의 고정된 Z-평면에서 XY 평면 공초점 이미징에 대한 파라미터를 설정합니다.미세 조정 손잡이로 초점을 셀 하단으로 조정합니다. 소프트웨어에서 여기 레이저 파워를 조정하여 최상의 신호 대 잡음비를 얻고 상당한 형광 표백을 피할 수 있는 설정을 찾으십시오. 아홉 마이크로리터의 내부 용액을 패치 피펫에 넣고 피펫을 패치 클램프 증폭기 스테이지의 홀더에 부착합니다.주사기로 소량의 양압을 가하고 피펫 팁을 움직여 미세 조작기로 목욕 용액을 만지십시오. 증폭기가 전압 펄스 테스트를 통해 피펫 저항이 대략 두 메가옴에서 네 메가옴 사이에 있음을 보여 주는지 확인하십시오. LJ/Auto를 눌러 액체 접합부를 취소합니다.미세 조작기를 사용하여 피펫을 선택한 셀 쪽으로 이동합니다. 셀 부착 모드를 형성하려면 피펫 팁을 움직여 셀을 터치합니다. 주사기로 부드러운 음압을 가하면서 유지 전위를 0에서 영하 80 밀리볼트로 변경하십시오.저항이 한 기가옴을 통과하면 구성이 안정화될 때까지 약 30초 동안 기다립니다. C-fast/Auto를 눌러 빠른 정전 용량을 보정합니다. 도매 모드를 형성하려면 막이 파열 될 때까지 주사기로 짧지 만 강력한 음압 펄스를 적용하십시오.C-slow/Auto를 눌러 느린 정전 용량을 보정합니다. 이미징 초점을 약간 조정하여 셀 바닥에 초점을 맞춥니다. 공초점 시간 경과 이미징과 패치 클램프 기록을 동시에 시작하려면 두 개의 서로 다른 소프트웨어 응용 프로그램이 있는 시작 단추를 클릭합니다.녹음 후 데이터가 저장되었는지 확인하십시오. 보류 전위를 다시 0밀리볼트로 변경합니다. 피펫을 욕조 용액에서 꺼내어 버리십시오.제조업체 또는 제공된 소프트웨어에서 원시 이미징 파일을 엽니다. 프로세스로 이동하여 ProcessTools를 클릭하고 도구를 사용하여 경과 할 때마다 이미지에 대한 롤링 평균 파일을 생성하십시오. 이러한 파일을 저장합니다.정량화에서 도구로 이동하여 스택 프로파일 버튼을 클릭하여 자극 전후의 시점을 확인하고 각 채널의 형광 변화를 확인하십시오. 타원 그리기 버튼을 클릭하여 퓨전 이벤트의 관심 영역을 원으로 돌립니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 ROI 저장을 클릭하여 저장합니다.프로젝트 열기를 클릭하여 원시 파일을 찾습니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 ROI 로드를 클릭하여 ROI 파일을 원시 이미징 파일에 로드하여 형광 강도를 측정합니다. 도구로 이동하여 소프트웨어에서 ROI 정렬을 클릭하고 각 ROI의 세 채널 모두에 대한 추적을 플로팅합니다.보고서를 클릭하여 각 ROI에 대한 디지털 데이터 및 이미징 추적을 포함한 ROI 데이터를 파일 폴더에 저장합니다. 전체 세포 패치-클램프 기록 및 80 내지 10 밀리볼트의 1초 탈분극의 적용은 엑소사이토시스 및 엔도사이토시스를 불러일으키기 위해 수행되었다. 적용된 탈분극은 내측 칼슘 전류, 커패시턴스 점프, 엑소사이토시스를 나타내는 커패시턴스 점프, 및 점프 후 커패시턴스 붕괴를 유도하여 엔도사이토시스를 나타낸다.세포 바닥에서의 시간 경과 영상화와 함께, 일초 탈분극 프로토콜에 의해 유도된 융합 이벤트는 FPH 및 A655 스팟 형광 증가를 수반하는 FFN511 방출을 반영하는 FFN 감소로 표시되었고, 원형질막으로부터 PH-mNG 및 A655 확산을 반영하고 욕조 용액이 융합된 소포 내로 반영되었다. 이 그림은 F655 디밍으로 식별된 근접 융합을 나타내는 반면, FPH는 지연으로 지속되거나 붕괴됩니다. 도면은 PH-mNG 및 A655 스팟 둘 다의 존재에 의해 검출된 체류 융합을 나타낸다.이 그림은 PH-mNG 스폿과 A655 스팟의 병렬 크기 감소를 수반하는 병렬 FPH 및 F655 붕괴로 검출된 수축 융합을 나타내며 성공적인 기록은 패치 클램프로 전체 셀 구성을 생성하고 각 채널에 대해 적절한 형광 강도로 셀 하단에서 이미징해야 합니다. 여기에 설명 된 전기 생리학과 초분해능 현미경의 조합은 융합 기공 역학 및 신경 회로를 측정하는 데 유용한 도구입니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

연구

신경과학

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

실험 뇌 손상 양극화의 소교 / 대식 세포 마커의 3 차원 공 촛점 분석

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

뇌 슬라이스 바이오 티 닐화 :<em&gt; 전의 VIVO</em성인 뉴런에서 지역 고유의 플라즈마 막 단백질 인신 매매를 측정하는&gt; 접근

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

마우스 부신하는 chromaffin 세포에서 세포 부착 된 정전 용량 측정을위한 방법

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

신경 근육 접합 : 측정 시냅스 크기, 공 초점 형광 현미경을 사용하여 시냅스 단백질 농도의 분열 및 변경

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

성상의 3 차원 공 촛점 형태 학적 분석을위한 프로토콜

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

기존의 UV 레이저 공 초점 현미경을 사용하여 트리거 세포 스트레스와 죽음

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...