Name: confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells
Uploaded: 2022-03-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells at JoVE.com

Vi takker NINDS Intramural Research Programs (ZIA NS003009-13 og ZIA NS003105-08) for å støtte dette arbeidet.

MERK: Dyrebruksprosedyren fulgte NIH-retningslinjene og ble godkjent av NIH Animal Care and Use Committee.
1. Bovine chromaffin cellekultur
<ol><li>Forbered Lockes løsning (tabell 1) og autoklavverktøy 1 dag før chromaffincellekultur.</li>
	<li>Få bovin binyrene fra en lokal abattoir på kulturdagen, og hold dem nedsenket i iskald Lockes løsning før disseksjon. MERK: Binyrene er fra 21-27 måneder gamle, sunne, svarte Angus av begge kjønn (hovedsak...

<ol>
	<li>Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pores+and+their+control+of+neurotransmitter+and+hormone+release.">Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release.</a> Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).</li><li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion.">Viral membrane fusion.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).</li><li>Zhao, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemi-fused+structure+mediates+and+controls+fusion+and+fission+in+live+cells.">Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells.</a> Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).</li><li>Klyachko, V. A., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitance+steps+and+fusion+pores+of+small+and+large-dense-core+vesicles+in+nerve+terminals.">Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals.</a> Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).</li><li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Chiang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-fusion+structural+changes+and+their+roles+in+exocytosis+and+endocytosis+of+dense-core+vesicles.">Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles.</a> Nature Communications. 5, 3356 (2014).</li><li>Sharma, S., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fusion+pore,+60+years+after+the+first+cartoon.">The fusion pore, 60 years after the first cartoon.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).</li><li>Jorgacevski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+tuning+of+vesicle+merger+and+fusion+pore+properties.">Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).</li><li>Rituper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+cholesterol+controls+exocytotic+fusion+pore.">Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore.</a> Cell Calcium. 101, 102503 (2021).</li><li>Gucek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+negative+SNARE+peptides+stabilize+the+fusion+pore+in+a+narrow,+release-unproductive+state.">Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).</li><li>Grabner, C. P., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+synaptic+vesicles+mediate+stimulated+exocytosis+from+cochlear+inner+hair+cells.">Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).</li><li>Wen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+provides+membrane+tension+to+merge+fusing+vesicles+into+the+plasma+membrane.">Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane.</a> Nature Communications. 7, 12604 (2016).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Membrane+Pore+in+Live+Cells+Reveals+a+Dynamic-Pore+Theory+Governing+Fusion+and+Endocytosis.">Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis.</a> Cell. 173 (4), 934-945 (2018).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+Shrinking+and+Enlargement+Play+Opposing+Roles+in+the+Release+of+Exocytotic+Contents.">Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents.</a> Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).</li><li>Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+sequential+compound+fusion+and+kiss-and-run+in+live+excitable+cells.">Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+control+of+kiss-and-run+and+vesicular+reuse+probed+with+single+nanoparticles.">The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles.</a> Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+features+between+chromaffin+and+neural+progenitor+cells.">Common features between chromaffin and neural progenitor cells.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).</li><li>Bornstein, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromaffin+cells:+the+peripheral+brain.">Chromaffin cells: the peripheral brain.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).</li><li>Park, Y., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+plasticity+of+small+synaptic+vesicle+(SSV)+and+large+dense-core+vesicle+(LDCV)+exocytosis.">Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis.</a> Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).</li><li>Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+Chromaffin+Cells:+Culture+and+Fluorescence+Assay+for+Secretion.">Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion.</a> Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+Omega-profile+closure+and+kiss-and-run+mediate+endocytosis+and+diverse+endocytic+modes+in+neuroendocrine+chromaffin+cells.">Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells.</a> Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).</li><li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells.">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).</li><li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Tension+Inhibits+Rapid+and+Slow+Endocytosis+in+Secretory+Cells.">Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells.</a> Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).</li><li>Revelo, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+probe+for+super-resolution+imaging+of+membranes+elucidates+trafficking+pathways.">A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways.</a> Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).</li><li>Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX-box+protein,+prenylation+process+and+carcinogenesis.">CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis.</a> American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+vesicles+from+frog+neuromuscular+junctions+by+prolonged+tetanic+stimulation.">Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation.</a> Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).</li><li>Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MINFLUX+nanometer-scale+3D+imaging+and+microsecond-range+tracking+on+a+common+fluorescence+microscope.">MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope.</a> Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).</li></ol>

En konfokal mikroskopisk bildemetode er beskrevet for å oppdage dynamikken i fusjonspor og senderutløsning, samt tre fusjonsmoduser, tett fusjon, stay-fusion og krympefusjon i bovin binyre binyrenes kromatinceller 4,24. En elektrofysiologisk metode for å depolarisere cellen og dermed fremkalle ekso- og endokytose er beskrevet. Systematisk konfokal bildebehandling gir informasjon om ulike typer poreoppførsel for fusjons- og fisjonshendelser.
<p class="jove...

Membranfusjon formidler mange biologiske funksjoner, inkludert synaptisk overføring, blodsukker homeostase, immunrespons og viral oppføring 1,2,3. Exocytose, som involverer vesiclefusjon ved plasmamembranen, frigjør nevrotransmittere og hormoner for å oppnå mange viktige funksjoner, for eksempel nevronale nettverksaktiviteter. Fusion åpner en pore for å frigjøre vesikulært innhold, hvorpå poren kan lukke seg for å hente den fusing vesicle, som kalles kyss-og-kjør 1,4. Både irreversibel og reversibel fusjonsporåpning kan måles med celletilknyttede kapasitansopptak kombinert med fusjons poreledningsopptak av enkelt vesiclefusjon.
Dette tolkes ofte som reflekterende full-kollaps fusjon, som involverer utvidelse av fusjonen til sammenslåing av fusjon vesicle, og kyss-og-løp, involverer fusjon pore åpning og lukking, henholdsvis 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Nylige konfokale og stimulerte utslippsuttømmingsstudier (STED) i kromboffinceller observerte direkte fusjonsporåpning og -lukking (kyss-og-løp, også kalt nærfusjon), fusjonsporåpning som opprettholder en Ω-form med en åpen pore i lang tid, betegnet stay-fusion og krymping av fusing vesicle til den komplette fusjonerer med plasmamembranen, som erstatter full-kollaps fusjon for sammenslåing av fusing vesiles med plasmamembranen4, 8,14,15,16,17.
I nevroner har fusjonsporåpning og -lukking blitt oppdaget med avbildning som viser frigjøring av kvanteprikker forhåndslastet i vesikler som er større enn fusjonsporene og med fusjonsporiske ledningsmålinger ved frigjøringsflaten til nerveterminaler 5,18,19. Binyrenes kromoffinceller er mye brukt som modell for studiet av ekso- og endokytose 20,21. Selv om kromoffinceller inneholder store tette vesicles, mens synapser inneholder små synaptiske vesicles, er eksocytose- og endokytoseproteinene i kromboffinceller og synapser ganske analoge 10,11,12,20,21,22,23.
Her beskrives en metode for å måle disse tre fusjonsmodusene ved hjelp av en konfokal avbildningsmetode kombinert med elektrofysiologi i bovin binyrenes kromoffinceller (figur 1). Denne metoden innebærer lasting av fluorescerende falske nevrotransmittere (FFN511) i vesikler for å oppdage eksocytose; tilsetning av Atto 655 (A655) i badeløsningen for å fylle den fusjonsgenererte Ω-formprofilen, og merking av plasmamembranen med PH-domenet til fosfolipase C δ (PH), som binder seg til PtdIns (4,5)P2 ved plasmamembranen 8,15,24. Fusion poredynamikk kan oppdages gjennom endringer i forskjellige fluorescerende intensiteter. Selv om det er beskrevet for kromboffinceller, kan prinsippet om denne metoden beskrevet her brukes mye på mange sekretoriske celler langt utover kromoffinceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td>ATP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto 655</td>
			<td>ATTO-TEC GmbH</td>
			<td>AD 655-21</td>
			<td>Atto dye to label bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Nucleofector for Primary Neurons</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VSPI-1003</td>
			<td>Electroporation transfection buffer along with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boroscilicate capillary glass pipette</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0795</td>
			<td>Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride 2 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-130-721</td>
			<td>Reagent for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>Material for filtering chromaffin cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>232041</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.1214E+10</td>
			<td>Enzyme for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-14-Laminin</td>
			<td>GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11885092</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Nucleofector</td>
			<td>Amaxa Biosystems</td>
			<td>Nucleofector II</td>
			<td>Transfect plasmids into cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFN511</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120331</td>
			<td>Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td>GTP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>WaveMetrics</td>
			<td>Igor pro</td>
			<td>Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Confocal software for imaging data collection and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Confocal microscope for imaging data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49449-100G</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Lock-in</td>
			<td>Software for capacitance recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride 1 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3120</td>
			<td>Counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mNG(mNeonGreen)</td>
			<td>Allele Biotechnology</td>
			<td>ABP-FP-MNEONSB</td>
			<td>Template for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh filtering screen 100 micron</td>
			<td>EIKO filtering co</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>Material for filtering medulla suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp EPC-10</td>
			<td>Heka</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td>Amplifier for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH-EGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #51407</td>
			<td>Backbone for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Make pipettes for patch-clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5404-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse software</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Pulse</td>
			<td>Software for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1943/QR-40LP</td>
			<td>coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution, bath solution and internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hot plate</td>
			<td>Barnsted/Thermolyne</td>
			<td>type 10100</td>
			<td>Heater for pipette coating with wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 30 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302832</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2265-100G</td>
			<td>TEA for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9253-5G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid</td>
			<td>Leica</td>
			<td>195371-10-9</td>
			<td>Leica confocal mounting oil</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells

Dynamisk fusjon pore åpning og lukking mediat exocytosis og endokytose og bestemme deres kinetikk. Her er det demonstrert i detalj hvordan konfokal mikroskopi ble brukt i kombinasjon med patch-clamp opptak for å oppdage tre fusjonsmoduser i primærkultur bovin binyre binyrene celler. De tre fusjonsmodusene inkluderer 1) nærfusjon (også kalt kyss-og-løp), som involverer fusjonsporåpning og -lukking, 2) stay-fusion, som involverer fusjonsporåpning og vedlikehold av den åpne poren, og 3) krympefusjon, som involverer krymping av den fusjonsgenererte Ω-formprofilen til den smelter helt sammen ved plasmamembranen.
For å oppdage disse fusjonsmodusene ble plasmamembranen merket med overekspresserende mNeonGreen festet med PH-domenet til fosfolipase C δ (PH-mNG), som binder seg til fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat (PtdIns(4,5)P2) ved det cytosolvendte pakningsvedlegget i plasmamembranen; vesicles ble lastet med fluorescerende falsk nevrotransmitter FFN511 for å oppdage vesikulær innholdsutgivelse; og Atto 655 ble inkludert i badeløsningen for å oppdage fusjonsporedlegging. Disse tre fluorescerende sondene ble avbildet samtidig ved ~ 20-90 ms per ramme i levende kromatinceller for å oppdage fusjonsporåpning, innholdsutgivelse, fusjonsporerende og fusjonerende vesiclestørrelsesendringer. Analysemetoden er beskrevet for å skille tre fusjonsmoduser fra disse fluorescensmålingene. Metoden beskrevet her kan i prinsippet gjelde for mange sekretoriske celler utover kromoffinceller.

Etter de eksperimentelle prosedyrene som er vist i figur 1 og figur 2, ble kromaffinceller fra bovin binyrene transfektert med PH-mNG for å merke plasmamembranen; A655 ble lagt til badeløsningen for å oppdage fusjon porelukking; fluorescerende falsk nevrotransmitter FFN511 ble lastet i vesicles for påvisning av frigjøring. Deretter ble XY-plane confocal timelapse imaging av FFN511, PH-mNG og A655 utført hver 20-90 ms ved cellebunnen (Z-fokalplan ~ 100-200 ...

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells at JoVE.com

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

Denne protokollen beskriver en konfokal bildeteknikk for å oppdage tre fusjonsmoduser i bovin binyre binyrene. Disse fusjonsmodusene inkluderer 1) tett fusjon (også kalt kyss-og-løp), som involverer fusjonsporeråpning og -lukking, 2) stay-fusion, som involverer fusjonsporering og vedlikehold av den åpne poren, og 3) krympefusjon, som involverer smeltet vesiclekrymping.

Konfokal mikroskopi for å måle tre moduser av Fusion Pore Dynamics i binyrene chromaffin celler

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...

Membranfusjon formidler mange biologiske funksjoner. Denne protokollen beskriver en metode for å oppdage fusjonsporåpning og senderutløsningsdynamikk og skille mellom tre fusjonsmoduser;lukke fusjon, holde fusjon og krympe fusjon. Kombinasjonen av konfektmikroskop og patch-clamp-opptak muliggjør visualisering av fusjonsporåpning og lukking og bestemmelse av kinetikken.Selv om det er beskrevet for kromoffinceller, kan prinsippet om metoden som er beskrevet her, brukes mye på mange sekretoriske celler langt utover kromoffinceller. Vellykket implementering av denne metoden avhenger av flere generelle trinn, for eksempel å generere sunn primær kromoffincellekultur, tilstrekkelig plasmid transfeksjonseffektivitet og høy elektrofysiologisk registreringssuksessrate. Velg tre intakte kjertler uten kutt eller blødninger på overflaten og fjern fettvevet med saks.Vask kjertlene ved perfusjon med Lockes løsning til det ikke kommer blod ut. For fordøyelsen, injiser enzymoppløsningen gjennom binyreåren ved hjelp av en 30 millimeter sprøyte festet med et 0,22 mikrometer filter til kjertelen begynner å svulme. La deretter kjertlene ligge på 37 grader Celsius i 10 minutter.Injiser igjen og la kjertlene ligge på 37 grader Celsius i ytterligere 10 minutter. Etter fordøyelsen, kutt kjertelen langsgående fra binyrevenen til den andre enden med saks for å utfolde kjertelen. Isoler den hvite medullaen ved å pinse den ut i stykker i en 10 centimeter Petri-tallerken som inneholder Lockes løsning.Klipp og hakk medulla med saks. Filtrer medullafjæringen med et 80 til 100 mikrometer nylonnett i et beger. Overfør filtratet til et konisk rør på 50 milliliter og sentrifugat ved 48 x g romtemperatur i tre minutter med en retardasjon på tre.Etter sentrifugering, fjern supernatanten og resuspender cellepelleten med Lockes løsning ved pipettering. Filtrer cellefjæringen med en 80 til 100 mikrometer sil og sentrifugat ved 48 x g romtemperatur i tre minutter med retardasjon tre. Fjern supernatanten og resuspend cellepellet med 30 milliliter kulturmedium.Bestem cellenummeret ved hjelp av et hemocytometertellingskammer. Overfør 2 800 000 celler til et 15 milliliter rør. Pellet cellene ved sentrifugering ved 48 x g i to minutter med retardasjon av tre.Tilsett 100 mikroliter transeksjonsbuffer levert av produsenten til cellepelleten. Og legg deretter til to mikrogram PH-mNG plasmid. Bland forsiktig suspensjonen ved å røre løsningen opp og ned og overfør blandingen til en elektroporasjonsklynett uten forsinkelse.Overfør umiddelbart cuvette til elektroporatoren, velg 005-programmet i skjermlisten og trykk Enter for å utføre elektroporasjon. Etter elektroporasjon, tilsett umiddelbart 1,8 milliliter medium til cuvette og bland forsiktig med en mikropipette utstyrt med en steril spiss. Tilsett 300 mikroliter av suspensjonen av de elektroporerte cellene på dekselslippet i hver tallerken som plating fem til seks retter totalt for en elektroporasjonsreaksjon.Overfør forsiktig oppvasken til en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius med 9% karbondioksid i 30 minutter og tilsett forsiktig to milliliter forvarselt medium til hver tallerken etter 30 minutter. Forbered patchpipetter fra borosilikatglasskapillærer ved å trekke dem med en pipettetrekker, belegge spissene med flytende voks og polere dem med en mikroforge. Slå på patchklemmeopptaksforsterkeren og start programvaren.Angi programvarens passende kalsiumstrøm og kapasitansregistreringsparametere. Angi en opptaksprotokoll på 60 sekunders varighet totalt der stimuleringen starter på 10 sekunder. Sett holdepotensialet for spenningsklemmeopptak til 80 millivolt.Sett en ett sekund depolarisering fra minus 80 millivolt til 10 millivolt som stimulans for å indusere kalsiumtilstrømning og kapasitanshopp. Slå på det konfiskeringsmikroskopsystemet og angi de riktige parametrene i programvaren. Slå på laserne, inkludert 458 nanometer, 514 nanometer og 633 nanometer og angi utslippsinnsamlingsområdet for hver laser i henhold til hver fluorescenssonde.Velg en tallerken med god celletilstand og riktig uttrykk og legg til to mikroliter fluorescens falsk nevrotransmitter FFN511 i mediet i parabolen. Sett parabolen tilbake i inkubatoren i 20 minutter. Etter lasting av FFN511, klargjør opptakskammeret og tilsett to mikroliter fluorescensfargestoff A655 i 50 mikroliter badeløsning.Overfør dekselslippet fra parabolen til opptakskammeret med pinsett og tilsett umiddelbart A655 som inneholder badeløsning. Plasser en dråpe olje på 100X olje nedsenking mål. Monter kammeret i mikroskopet og bruk justeringsknappen til å få oljen til å bare komme i kontakt med bunnen av dekselslippet.Få cellene i fokus og bruk lyst felt og konfokal avbildning for å finne en passende celle med mNG-uttrykk. Zoom inn på den merkede cellen, og midtstill den i synsfeltet, og minimer tomme områder. Angi parametere for XY-planets konfokale bildebehandling ved et fast Z-plan med FFN511, PH-mNG og A665 med et minimert tidsintervall.Juster fokuset til bunnen av cellen med en finjusteringsknapp. Juster eksitasjonslaserkraften i programvaren for å finne en innstilling for å få det beste signal-til-støy-forholdet og unngå betydelig fluorescensbleking. Tilsett ni mikroliter av intern løsning i en patchpipette og fest pipetten til holderen på patchklemmeforsterkerstadiet.Påfør en liten mengde positivt trykk med en sprøyte og flytt pipettespissen for å berøre badeløsningen med en mikromanipulator. Sørg for at forsterkeren viser at pipettemotstanden er omtrent mellom to og fire megaohms med en spenningspulstest. Trykk på LJ/Auto for å avbryte det flytende krysset.Flytt pipetten mot den merkede cellen med en mikromanipulator. Hvis du vil danne en celle tilkoblet modus, flytter du pipettespissen for å berøre cellen. Endre holdepotensialet fra null til minus 80 millivolt mens du bruker forsiktig negativt trykk med en sprøyte.Når motstanden passerer en gigaohm, vent i omtrent 30 sekunder på at konfigurasjonen skal stabilisere seg. Trykk på C-fast/Auto for å kompensere for rask kapasitans. For å danne en engrosmodus, bruk korte, men kraftige pulser av negativt trykk med sprøyten til membranen brister.Trykk på C-slow/Auto for å kompensere for langsom kapasitans. Juster bildefokuset litt for å fokusere på cellebunnen. Start confocal tidsforløp bildebehandling og patch klemme opptak samtidig ved å klikke på Start-knappene med to forskjellige programmer.Etter opptak, sørg for at dataene er lagret. Endre holdepotensialet tilbake til null millivolt. Flytt pipetten ut av badeløsningen og kast den.Åpne RAW-bildefilene med en hvilken som helst produsent eller medfølgende programvare. Gå til Prosess, klikk på ProcessTools og bruk verktøyene til å generere rullende gjennomsnittlige filer for hvert tidsforløpbilde. Lagre disse filene.Under kvantifiser, gå til Verktøy og klikk på Stack Profile-knapper for å sjekke tidspunkter før og etter stimulering og identifisere fluorescensendringer i hver kanal. Klikk på Tegn ellipse-knappen for å sirkle inn interesseområder for fusjonshendelser. Høyreklikk på bildet og klikk Lagre ROIer for å lagre.Klikk Åpne prosjekter for å finne RAW-filen. Høyreklikk på bildet og klikk Last inn ROIer for å laste inn ROI-filen i raw imaging-filen for å måle fluorescensintensitetene. Gå til Verktøy og klikk på Sorter ROIer i programvaren og plott sporene for alle tre kanalene til hver avkastning.Klikk Rapport for å lagre avkastningsdataene, inkludert digitale data og bildesporinger for hver avkastning, i en filmappe. Hele celle patch-clamp opptak og anvendelse av en ett sekund depolarisering fra 80 til 10 millivolt ble utført for å fremkalle exo og endokytose. Den påførte depolariseringen induserte en innadvendt kalsiumstrøm, et kapasitanshopp, som indikerer eksocytose, og en kapasitans forfall etter hoppet, noe som indikerer endokytose.Med tidsforløpavbildning på cellebunnen ble fusjonshendelser indusert av den ene sekunds depolariseringsprotokollen indikert som FFN-reduksjon som reflekterer FFN511-frigjøring, ledsaget av FPH og A655 spotfluorescensøkning, noe som reflekterer PH-mNG og A655 diffusjon fra plasmamembranen og badeløsningen i den fusjonerende vesicleen. Figuren presenterer tett fusjon identifisert som F655 dimming, mens FPH opprettholdt eller forfalt med en forsinkelse. Figuren representerer stay fusion oppdaget av tilstedeværelsen av både PH-mNG og A655 flekker.Figuren representerer krympefusjon oppdaget som parallell FPH og F655 forfall ledsaget av en parallell størrelse reduksjon av PH-mNG spot og A655 spot Vellykket opptak krever å generere hele cellekonfigurasjonen med patch-clamp og bildebehandling på cellebunnen med riktig fluorescerende intensitet for hver kanal. Kombinasjonen av elektrofysiologi og superoppløsningsmikroskopi beskrevet her er et verdifullt verktøy for måling av fusjonsporiske dynamikk og nevrokretser.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Metoder for Cell-festet måling av kapasitans i Mouse Adrenal chromaffin Cell

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Nevromuskulære krysset: Måling Synapse Størrelse, fragmentering og endringer i Synaptic Protein Tetthet Bruke Confocal Fluorescensmikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

TIRFM og pH-følsomme GFP-sonder for å evaluere Neurotransmitter Vesikkel Dynamics i SH-SY5Y neuroblastom celler: Cell Imaging og dataanalyse

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll for Tredimensjonal Confocal Morfometrisk Analyse av Astrocytter

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

SNARE-mediert Fusion Single Proteoliposomes med tethered Støttede bilagene i en mikrofluid Flow Cell overvåkes av polarisert TIRF Mikroskopi

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Analyse for å måle nukleocytoplasmisk transport i sanntid innen Motor Neuron-lignende NSC-34-celler

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Three-dimensional Navigation-guided, Prone, Single-position, Lateral Lumbar Interbody Fusion Technique

Tredimensjonal navigasjonsstyrt, utsatt, enposisjons, lateral lumbal interbody fusjonsteknikk

Lateral interbody fusion provides a significant biomechanical advantage over the traditional transforaminal lumbar interbody fusion due to the large ...