Name: confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells
Uploaded: 2022-03-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells at JoVE.com

Agradecemos aos Programas de Pesquisa Intramuros do NINDS (ZIA NS003009-13 e ZIA NS003105-08) por apoiarem este trabalho.

NOTA: O procedimento de uso animal seguiu as diretrizes do NIH e foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do NIH.
1. Cultura celular cromafina bovina
<ol><li>Prepare a solução do Locke (Tabela 1) e as ferramentas de autoclave 1 dia antes da cultura celular cromafina.</li>
	<li>Obtenha glândulas adrenal bovinas de um matadouro local no dia da cultura, e mantenha-as submersas na solução gelada de Locke antes da dissecação. NOTA: As glâ...

<ol>
	<li>Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pores+and+their+control+of+neurotransmitter+and+hormone+release.">Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release.</a> Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).</li><li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion.">Viral membrane fusion.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).</li><li>Zhao, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemi-fused+structure+mediates+and+controls+fusion+and+fission+in+live+cells.">Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells.</a> Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).</li><li>Klyachko, V. A., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitance+steps+and+fusion+pores+of+small+and+large-dense-core+vesicles+in+nerve+terminals.">Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals.</a> Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).</li><li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Chiang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-fusion+structural+changes+and+their+roles+in+exocytosis+and+endocytosis+of+dense-core+vesicles.">Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles.</a> Nature Communications. 5, 3356 (2014).</li><li>Sharma, S., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fusion+pore,+60+years+after+the+first+cartoon.">The fusion pore, 60 years after the first cartoon.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).</li><li>Jorgacevski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+tuning+of+vesicle+merger+and+fusion+pore+properties.">Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).</li><li>Rituper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+cholesterol+controls+exocytotic+fusion+pore.">Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore.</a> Cell Calcium. 101, 102503 (2021).</li><li>Gucek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+negative+SNARE+peptides+stabilize+the+fusion+pore+in+a+narrow,+release-unproductive+state.">Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).</li><li>Grabner, C. P., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+synaptic+vesicles+mediate+stimulated+exocytosis+from+cochlear+inner+hair+cells.">Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).</li><li>Wen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+provides+membrane+tension+to+merge+fusing+vesicles+into+the+plasma+membrane.">Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane.</a> Nature Communications. 7, 12604 (2016).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Membrane+Pore+in+Live+Cells+Reveals+a+Dynamic-Pore+Theory+Governing+Fusion+and+Endocytosis.">Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis.</a> Cell. 173 (4), 934-945 (2018).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+Shrinking+and+Enlargement+Play+Opposing+Roles+in+the+Release+of+Exocytotic+Contents.">Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents.</a> Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).</li><li>Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+sequential+compound+fusion+and+kiss-and-run+in+live+excitable+cells.">Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+control+of+kiss-and-run+and+vesicular+reuse+probed+with+single+nanoparticles.">The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles.</a> Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+features+between+chromaffin+and+neural+progenitor+cells.">Common features between chromaffin and neural progenitor cells.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).</li><li>Bornstein, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromaffin+cells:+the+peripheral+brain.">Chromaffin cells: the peripheral brain.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).</li><li>Park, Y., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+plasticity+of+small+synaptic+vesicle+(SSV)+and+large+dense-core+vesicle+(LDCV)+exocytosis.">Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis.</a> Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).</li><li>Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+Chromaffin+Cells:+Culture+and+Fluorescence+Assay+for+Secretion.">Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion.</a> Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+Omega-profile+closure+and+kiss-and-run+mediate+endocytosis+and+diverse+endocytic+modes+in+neuroendocrine+chromaffin+cells.">Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells.</a> Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).</li><li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells.">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).</li><li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Tension+Inhibits+Rapid+and+Slow+Endocytosis+in+Secretory+Cells.">Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells.</a> Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).</li><li>Revelo, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+probe+for+super-resolution+imaging+of+membranes+elucidates+trafficking+pathways.">A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways.</a> Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).</li><li>Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX-box+protein,+prenylation+process+and+carcinogenesis.">CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis.</a> American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+vesicles+from+frog+neuromuscular+junctions+by+prolonged+tetanic+stimulation.">Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation.</a> Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).</li><li>Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MINFLUX+nanometer-scale+3D+imaging+and+microsecond-range+tracking+on+a+common+fluorescence+microscope.">MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope.</a> Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).</li></ol>

Um método de imagem microscópica confocal é descrito para detectar a dinâmica da liberação de poros de fusão e transmissor, bem como três modos de fusão, fusão de perto, fusão de estadia e redução de fusão em células adrenalrnafina bovina 4,24. Um método eletrofisiológico para despolarizar a célula e, assim, evocar exo-e endocitose é descrito. O processamento sistemático de imagens confocal fornece informações sobre diferentes modos de compo...

A fusão de membranas media muitas funções biológicas, incluindo transmissão sináptica, homeostase de glicemia, resposta imune e entrada viral 1,2,3. A excitose, envolvendo a fusão vesícula na membrana plasmática, libera neurotransmissores e hormônios para alcançar muitas funções importantes, como atividades da rede neuronal. Fusion abre um poro para liberar conteúdo vesicular, após o qual o poro pode fechar para recuperar a vesícula fusível, que é chamada de beijo e fuga 1,4. Tanto a abertura irreversível quanto a reversível dos poros de fusão podem ser medidas com gravações de capacitância ligadas a células combinadas com gravações de conduance de poros de fusão de fusão única de fusão vesícula.
Isso é frequentemente interpretado como reflexo da fusão de colapso total, envolvendo a dilatação da fusão até o achatamento da vesícula fusível, e beijo-e-fuga, envolvendo abertura e fechamento de poros de fusão, respectivamente 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Estudos recentes de esgotamento de emissões confocal e estimulados (STED) em células cromafina observaram diretamente abertura e fechamento de poros de fusão (beijo-e-fuga, também chamada de fusão estreita), abertura de poros de fusão que mantém uma forma de Ω com um poro aberto por um longo tempo, denominada fusão de estadia, e encolhimento da vesícula fusória até que se funda com a membrana plasmática, que substitui a fusão de colapso total para a fusão de vesículas fusíveis com a membrana plasmática4, 8,14,15,16,17.
Nos neurônios, a abertura e o fechamento de poros de fusão foram detectados com imagens mostrando a liberação de pontos quânticos pré-carregados em vesículas maiores que o poro de fusão e com medições de condutância de poros de fusão na face de liberação dos terminais nervosos 5,18,19. As células cromafinas adrenal são amplamente utilizadas como modelo para o estudo da exo-e endocitose20,21. Embora as células cromatofinas contenham grandes vesículas densas, enquanto as sinapses contêm pequenas vesículas sinapáticas, as proteínas excitose e endocitose em células cromafinas e sinapses são bastante análogas 10,11,12,20,21,22,23.
Aqui, um método é descrito para medir esses três modos de fusão usando um método de imagem confocal combinado com eletrofisiologia em células adrenal chromaffin bovina (Figura 1). Este método envolve o carregamento de falsos neurotransmissores fluorescentes (FFN511) em vesículas para detectar exocitose; adição de Atto 655 (A655) na solução de banho para preencher o perfil de forma Ω gerado pela fusão, e rotulagem da membrana plasmática com o domínio PH de fosfolipase C δ (PH), que se liga a PtdIns(4,5)P2 na membrana plasmática 8,15,24. A dinâmica dos poros de fusão pode ser detectada através de alterações em diferentes intensidades fluorescentes. Embora descrito para células cromafinas, o princípio deste método descrito aqui pode ser amplamente aplicado a muitas células secretary muito além das células cromafinas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td>ATP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto 655</td>
			<td>ATTO-TEC GmbH</td>
			<td>AD 655-21</td>
			<td>Atto dye to label bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Nucleofector for Primary Neurons</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VSPI-1003</td>
			<td>Electroporation transfection buffer along with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boroscilicate capillary glass pipette</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0795</td>
			<td>Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride 2 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-130-721</td>
			<td>Reagent for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>Material for filtering chromaffin cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>232041</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.1214E+10</td>
			<td>Enzyme for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-14-Laminin</td>
			<td>GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11885092</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Nucleofector</td>
			<td>Amaxa Biosystems</td>
			<td>Nucleofector II</td>
			<td>Transfect plasmids into cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFN511</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120331</td>
			<td>Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td>GTP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>WaveMetrics</td>
			<td>Igor pro</td>
			<td>Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Confocal software for imaging data collection and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Confocal microscope for imaging data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49449-100G</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Lock-in</td>
			<td>Software for capacitance recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride 1 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3120</td>
			<td>Counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mNG(mNeonGreen)</td>
			<td>Allele Biotechnology</td>
			<td>ABP-FP-MNEONSB</td>
			<td>Template for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh filtering screen 100 micron</td>
			<td>EIKO filtering co</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>Material for filtering medulla suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp EPC-10</td>
			<td>Heka</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td>Amplifier for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH-EGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #51407</td>
			<td>Backbone for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Make pipettes for patch-clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5404-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse software</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Pulse</td>
			<td>Software for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1943/QR-40LP</td>
			<td>coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution, bath solution and internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hot plate</td>
			<td>Barnsted/Thermolyne</td>
			<td>type 10100</td>
			<td>Heater for pipette coating with wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 30 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302832</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2265-100G</td>
			<td>TEA for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9253-5G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid</td>
			<td>Leica</td>
			<td>195371-10-9</td>
			<td>Leica confocal mounting oil</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells

Abertura dinâmica de poros de fusão e fechamento mediam exocitese e endocitose e determinam sua cinética. Aqui, é demonstrado em detalhes como a microscopia confocal foi usada em combinação com a gravação de grampo de remendo para detectar três modos de fusão em células adrenal adrenal de cultura primária. Os três modos de fusão incluem 1) fusão de perto (também chamada de kiss-and-run), envolvendo abertura e fechamento de poros de fusão, 2) estadia-fusão, envolvendo abertura de poros de fusão e manutenção do poro aberto, e 3) redução de fusão, envolvendo encolhimento do perfil de forma Ω gerada por fusão até que se funda completamente na membrana plasmática.
Para detectar esses modos de fusão, a membrana plasmática foi rotulada pela superexpressão mNeonGreen anexada ao domínio PH de fosfolipase C δ (PH-mNG), que se liga ao fosfaticicylinositol-4,5-bisfosfato (PtdIns(4,5)P2) no folheto voltado para o citosol da membrana plasmática; vesículas foram carregadas com o falso neurotransmissor fluorescente FFN511 para detectar a liberação de conteúdo vesicular; e Atto 655 foi incluído na solução de banho para detectar o fechamento de poros de fusão. Estas três sondas fluorescentes foram imagens simultaneamente a ~20-90 ms por quadro em células de cromaffin ao vivo para detectar abertura de poros de fusão, liberação de conteúdo, fechamento de poros de fusão e mudanças de tamanho vesícula. O método de análise é descrito para distinguir três modos de fusão dessas medidas de fluorescência. O método aqui descrito pode, em princípio, aplicar-se a muitas células secretas além das células cromafinas.

Seguindo os procedimentos experimentais mostrados na Figura 1 e Figura 2, as células cromafinas das glândulas suprarrenais bovinas foram transfectadas com PH-mNG para rotular a membrana plasmática; O A655 foi adicionado à solução de banho para detectar o fechamento dos poros de fusão; e o falso neurotransmissor fluorescente FFN511 foi carregado em vesículas para detecção de liberação. Em seguida, a imagem de timelapse confocal de plano XY de FFN511, ...

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Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

Este protocolo descreve uma técnica de imagem confocal para detectar três modos de fusão em células adrenals de chromaffin bovinas. Esses modos de fusão incluem 1) close-fusion (também chamado de kiss-and-run), envolvendo abertura e fechamento de poros de fusão, 2) stay-fusion, envolvendo abertura de poros de fusão e manutenção do poro aberto, e 3) redução de fusão, envolvendo encolhimento vesícula fundido.

Microscopia Confocal para medir três modos de dinâmica de poros de fusão em células adrenal chromaffin

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...

A fusão de membrana media muitas funções biológicas. Este protocolo descreve um método para detectar a abertura de poros de fusão e a dinâmica de liberação do transmissor e distinguir três modos de fusão;fusão próxima, fusão de estadia e redução da fusão. A combinação de microscópio confocal e a gravação de grampo de remendo facilita a visualização da abertura e fechamento de poros de fusão e determinação de sua cinética.Embora descrito para células cromafinas, o princípio do método descrito aqui pode ser aplicado amplamente a muitas células secretas muito além das células cromafinas. A implementação bem-sucedida deste método depende de várias etapas gerais, como a geração de cultura celular primária saudável, eficiência de transfecção plasmida suficiente e alta taxa de sucesso de registro eletrofisiológico. Escolha três glândulas intactas sem cortes ou sangramentos na superfície e remova o tecido adiposo com uma tesoura.Lave as glândulas por perfusão com a solução de Locke até que não saia sangue. Para digestão, injete a solução enzimada através da veia adrenal usando uma seringa de 30 milímetros presa com um filtro de 0,22 micrômetros até que a glândula comece a inchar. Em seguida, deixe as glândulas a 37 graus Celsius por 10 minutos.Injete novamente e deixe as glândulas a 37 graus Celsius por mais 10 minutos. Após a digestão, corte a glândula longitudinalmente da veia adrenal para a outra extremidade com uma tesoura para desdobrar a glândula. Isole a medula branca, tweezing-lo em pedaços em uma placa de Petri de 10 centímetros contendo a solução de Locke.Corte e pique a medula com uma tesoura. Filtre a suspensão da medula com uma malha de nylon de 80 a 100 micrômetros em um béquer. Transfira o filtrado para um tubo cônico de 50 mililitros e centrífugas a 48 x g de temperatura ambiente por três minutos com uma desaceleração de três.Após a centrifugação, remova o supernascedor e resuspenque a pelota celular com a solução de Locke por pipetação. Filtre a suspensão celular com um coador de 80 a 100 micrômetros e centrífugas a 48 x g de temperatura ambiente por três minutos com desaceleração três. Remova o supernatante e resuspende a pelota celular com 30 mililitros de meio de cultura.Determine o número da célula usando uma câmara de contagem de hemótmetros. Transfira 2.800.000 células para um tubo de 15 mililitros. Pelota as células por centrifugação a 48 x g por dois minutos com a desaceleração de três.Adicione 100 microliters de tampão de transeção fornecidos pelo fabricante à pelota celular. E, em seguida, adicionar dois microgramas de plasmídeo PH-mNG. Misture suavemente a suspensão encanando a solução para cima e para baixo e transfira a mistura para um cuvette de eletroporação sem demora.Transfira imediatamente a cuvette para o eletroporador, selecione o programa 005 na lista de tela e pressione Enter para realizar a eletroporação. Após a eletroporação, adicione imediatamente 1,8 mililitros de meio ao cuvette e misture suavemente com uma micropipette equipada com uma ponta estéril. Adicione 300 microliters da suspensão das células eletroporadas no deslizamento de cobertura em cada prato emplacando de cinco a seis pratos no total para uma reação de eletroporação.Transfira cuidadosamente os pratos para uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 9% por 30 minutos e adicione suavemente dois mililitros de meio pré-enfersedo a cada prato após 30 minutos. Prepare pipetas de remendo de capilares de vidro borossilicato, puxando-as com um puxador de pipeta, revestindo suas pontas com cera líquida e polindo-as com um microforge. Ligue o amplificador de gravação do grampo de remendo e inicie o software.Defina os parâmetros apropriados de corrente de cálcio e de capacidade de registro do software. Defina um protocolo de gravação de 60 segundos de duração no total onde a estimulação começa em 10 segundos. Defina o potencial de retenção para gravação do grampo de tensão em 80 milvolts.Defina uma despolarização de um segundo de menos 80 milivolts a 10 milivolts como o estímulo para induzir o fluxo de cálcio e o salto de capacitância. Ligue o sistema de microscópio confocal e defina os parâmetros apropriados no software. Ligue os lasers, incluindo 458 nanômetros, 514 nanômetros e 633 nanômetros e defina o intervalo de coleta de emissões para cada laser de acordo com cada sonda de fluorescência.Escolha um prato com bom estado celular e expressão adequada e adicione dois microliters de fluorescência falso neurotransmissor FFN511 no meio no prato. Coloque o prato de volta na incubadora por 20 minutos. Depois de carregar FFN511, prepare a câmara de gravação e adicione dois microliters de corante de fluorescência A655 em 50 microliters de solução de banho.Transfira o deslizamento de tampa do prato para a câmara de gravação com pinças e adicione imediatamente a solução de banho contendo A655. Coloque uma gota de óleo no objetivo de imersão de óleo 100X. Monte a câmara no microscópio e use o botão de ajuste para fazer com que o óleo entre em contato com a parte inferior da tampa.Leve as células ao foco e use imagens de campo brilhante e confocal para encontrar uma célula adequada com expressão mNG. Amplie a célula selecionada e centralize-a no campo de visão, minimizando regiões em branco. Defina parâmetros para imagens confocal de plano XY em um plano Z fixo de FFN511, PH-mNG e A665 com um intervalo de tempo minimizado.Ajuste o foco na parte inferior da célula com um botão de ajuste fino. Ajuste a potência do laser de excitação no software para encontrar uma configuração para obter a melhor relação sinal-ruído e evitar branqueamento significativo de fluorescência. Adicione nove microliters de solução interna em uma pipeta de remendo e conecte a pipeta ao suporte do estágio do amplificador do remendo.Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva com uma seringa e mova a ponta da pipeta para tocar a solução de banho com um micromanipulador. Certifique-se de que o amplificador mostra que a resistência da pipeta está aproximadamente entre dois a quatro megaohms com um teste de pulso de tensão. Pressione LJ/Auto para cancelar a junção líquida.Mova a pipeta para a célula selecionada com um micromanipulador. Para formar um modo de conexão celular, mova a ponta da pipeta para tocar a célula. Altere o potencial de retenção de zero para menos 80 milivolts enquanto aplica pressão negativa suave com uma seringa.Uma vez que a resistência passe um gigaohm, espere aproximadamente 30 segundos para que a configuração se estabilize. Pressione C-fast/Auto para compensar a capacidade rápida. Para formar um modo atacado, aplique pulsos curtos, mas poderosos, de pressão negativa com a seringa até que a membrana se rompa.Pressione C-slow/Auto para compensar a capacidade lenta. Ajuste o foco de imagem ligeiramente para se concentrar na parte inferior da célula. Inicie a imagem de lapso de tempo confocal e a gravação do grampo de correção simultaneamente clicando nos botões Iniciar com dois aplicativos de software diferentes.Após a gravação, certifique-se de que os dados sejam salvos. Mude o potencial de retenção para zero milvolts. Tire a pipeta da solução do banho e descarte-a.Abra os arquivos de imagem bruto com qualquer fabricante ou software fornecido. Vá para Process, clique em ProcessTools e use as ferramentas para gerar arquivos médios de rolagem para cada imagem de lapso de tempo. Salve esses arquivos.Em quantify, vá para Ferramentas e clique nos botões Stack Profile para verificar os pontos de tempo antes e depois da estimulação e identificar alterações de fluorescência em cada canal. Clique no botão Desenhar elipse para circular regiões de interesse para eventos de fusão. Clique com o botão direito do mouse na imagem e clique em Salvar ROIs para salvar.Clique em Abrir projetos para localizar o arquivo bruto. Clique com o botão direito do mouse na imagem e clique em Carregar ROIs para carregar o arquivo ROI no arquivo de imagem bruta para medir as intensidades de fluorescência. Vá para Ferramentas e clique em Classificar ROIs no software e plotar os traços para todos os três canais de cada ROI.Clique em Reportar para salvar os dados do ROI, incluindo dados digitais e rastreamentos de imagem para cada ROI em uma pasta de arquivos. Toda a gravação de grampo de remendo celular e aplicação de uma despolarização de um segundo de 80 a 10 milívolos foi realizada para evocar exo e endocitose. A despolarização aplicada induziu uma corrente de cálcio interior, um salto de capacitância, indicando exocite, e uma decadência de capacitância após o salto, indicando endocitose.Com a imagem do lapso de tempo no fundo celular, os eventos de fusão induzidos pelo protocolo de despolarização de um segundo foram indicados como diminuição do FFN refletindo a liberação de FFN511, acompanhados pelo aumento da fluorescência de fph e a655, refletindo a difusão ph-mNG e A655 da membrana plasmática e a solução de banho na vesícula fusível. A figura apresenta fusão próxima identificada como f655 escurecimento, enquanto FPH sustentado ou deteriorado com um atraso. A figura representa a fusão de permanência detectada pela presença de ambos os pontos PH-mNG e A655.A figura representa a fusão de encolhimento detectada como decadência de FPH e F655 paralelas acompanhada de uma redução de tamanho paralelo do ponto PH-mNG e o registro de tração A655 O sucesso da gravação requer gerar toda a configuração celular com grampo de remendo e imagem na parte inferior celular com intensidade fluorescente adequada para cada canal. A combinação de eletrofisiologia e microscopia de super resolução descrita aqui é uma ferramenta valiosa para medir a dinâmica dos poros de fusão e neurocircuitos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Uma maneira simples para medir a sensibilidade de etanol no Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Neurociência

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

Tridimensional Confocal análise de marcadores Microglia / macrófagos de polarização em Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Métodos de medidas de capacitância ligado por células em Rato Adrenal Cromafim celular

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

TIRFM e GFP-sondas sensíveis ao pH para avaliar Neurotransmitter Vesicle Dynamics em SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: imagens de células e Análise de Dados

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

Fusão SNARE mediada por uma única proteolipossomos com Bicamadas suportados Tethered em uma célula Microfluidic fluxo monitorado por polarizada TIRF microscopia

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Ensaio para Medir o Transporte Nucleocitoplasmático em Tempo Real dentro de Células NSC-34 do tipo Motor-Neuron

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Three-dimensional Navigation-guided, Prone, Single-position, Lateral Lumbar Interbody Fusion Technique

Técnica de fusão intercorpo intercorpo de navegação tridimensional, propensa, de posição única, lateral

Lateral interbody fusion provides a significant biomechanical advantage over the traditional transforaminal lumbar interbody fusion due to the large ...