Name: confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells
Uploaded: 2022-03-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells at JoVE.com

Bu çalışmayı destekledikleri için NINDS Intramural Araştırma Programlarına (ZIA NS003009-13 ve ZIA NS003105-08) teşekkür ederiz.

NOT: Hayvan kullanım prosedürü NIH kurallarına uymuş ve NIH Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Sığır kromafin hücre kültürü
<ol><li>Locke çözeltisini (Tablo 1) ve otoklav aletlerini kromafin hücre kültüründen 1 gün önce hazırlayın.</li>
	<li>Kültür gününde yerel bir mezbahadan sığır adrenal bezleri alın ve diseksiyondan önce buz gibi soğuk Locke'un çözeltisine batırılmış halde tutun....

<ol>
	<li>Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+and+endocytosis:+modes,+functions,+and+coupling+mechanisms.">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li><li>Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pores+and+their+control+of+neurotransmitter+and+hormone+release.">Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release.</a> Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).</li><li>Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion.">Viral membrane fusion.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).</li><li>Zhao, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemi-fused+structure+mediates+and+controls+fusion+and+fission+in+live+cells.">Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells.</a> Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).</li><li>Klyachko, V. A., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitance+steps+and+fusion+pores+of+small+and+large-dense-core+vesicles+in+nerve+terminals.">Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals.</a> Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).</li><li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry.">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Chiang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-fusion+structural+changes+and+their+roles+in+exocytosis+and+endocytosis+of+dense-core+vesicles.">Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles.</a> Nature Communications. 5, 3356 (2014).</li><li>Sharma, S., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fusion+pore,+60+years+after+the+first+cartoon.">The fusion pore, 60 years after the first cartoon.</a> Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).</li><li>Jorgacevski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+tuning+of+vesicle+merger+and+fusion+pore+properties.">Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).</li><li>Rituper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+cholesterol+controls+exocytotic+fusion+pore.">Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore.</a> Cell Calcium. 101, 102503 (2021).</li><li>Gucek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+negative+SNARE+peptides+stabilize+the+fusion+pore+in+a+narrow,+release-unproductive+state.">Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).</li><li>Grabner, C. P., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+synaptic+vesicles+mediate+stimulated+exocytosis+from+cochlear+inner+hair+cells.">Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).</li><li>Wen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+provides+membrane+tension+to+merge+fusing+vesicles+into+the+plasma+membrane.">Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane.</a> Nature Communications. 7, 12604 (2016).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Membrane+Pore+in+Live+Cells+Reveals+a+Dynamic-Pore+Theory+Governing+Fusion+and+Endocytosis.">Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis.</a> Cell. 173 (4), 934-945 (2018).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+Shrinking+and+Enlargement+Play+Opposing+Roles+in+the+Release+of+Exocytotic+Contents.">Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents.</a> Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).</li><li>Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+sequential+compound+fusion+and+kiss-and-run+in+live+excitable+cells.">Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+control+of+kiss-and-run+and+vesicular+reuse+probed+with+single+nanoparticles.">The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles.</a> Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell-attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+features+between+chromaffin+and+neural+progenitor+cells.">Common features between chromaffin and neural progenitor cells.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).</li><li>Bornstein, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromaffin+cells:+the+peripheral+brain.">Chromaffin cells: the peripheral brain.</a> Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).</li><li>Park, Y., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+plasticity+of+small+synaptic+vesicle+(SSV)+and+large+dense-core+vesicle+(LDCV)+exocytosis.">Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis.</a> Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).</li><li>Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+Chromaffin+Cells:+Culture+and+Fluorescence+Assay+for+Secretion.">Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion.</a> Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).</li><li>Shin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preformed+Omega-profile+closure+and+kiss-and-run+mediate+endocytosis+and+diverse+endocytic+modes+in+neuroendocrine+chromaffin+cells.">Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells.</a> Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).</li><li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells.">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).</li><li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Tension+Inhibits+Rapid+and+Slow+Endocytosis+in+Secretory+Cells.">Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells.</a> Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).</li><li>Revelo, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+probe+for+super-resolution+imaging+of+membranes+elucidates+trafficking+pathways.">A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways.</a> Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).</li><li>Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAAX-box+protein,+prenylation+process+and+carcinogenesis.">CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis.</a> American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+demystified.">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li><li>Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+vesicles+from+frog+neuromuscular+junctions+by+prolonged+tetanic+stimulation.">Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation.</a> Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).</li><li>Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MINFLUX+nanometer-scale+3D+imaging+and+microsecond-range+tracking+on+a+common+fluorescence+microscope.">MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope.</a> Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).</li></ol>

Füzyon gözenek ve transmitter salınımının dinamiklerini ve ayrıca sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu, yakın füzyonu, stay-füzyonu ve shrink-füzyonu tespit etmek için konfokal mikroskobik görüntüleme yöntemi tanımlanmıştır 4,24. Hücreyi depolarize etmek ve böylece ekzo- ve endositozu uyandırmak için elektrofizyolojik bir yöntem tanımlanmıştır. Sistematik konfokal görüntü işleme, füzyon ve fisyon olayları ...

Membran füzyonu, sinaptik iletim, kan şekeri homeostazı, immün yanıt ve viral giriş 1,2,3 dahil olmak üzere birçok biyolojik fonksiyona aracılık eder. Plazma zarında vezikül füzyonunu içeren ekzositoz, nöronal ağ aktiviteleri gibi birçok önemli fonksiyona ulaşmak için nörotransmitterleri ve hormonları serbest bırakır. Füzyon, veziküler içeriği serbest bırakmak için bir gözenek açar, bundan sonra gözenek, öp ve çalıştır 1,4 olarak adlandırılan kaynaştırıcı vezikülü almak için kapanabilir. Hem geri dönüşümsüz hem de geri dönüşümlü füzyon gözenek açıklığı, tek vezikül füzyonunun füzyon gözenek iletkenlik kayıtlarıyla birleştirilen hücreye bağlı kapasitans kayıtları ile ölçülebilir.
Bu genellikle kaynaştırıcı vezikülün düzleşmesine kadar füzyonun genişlemesini içeren tam çökme füzyonunu ve füzyon gözenek açma ve kapama işlemini içeren öpüşme ve koşmayı içeren, sırasıyla 5,6,7,8,9,10,11,12,13 olarak yorumlanır. . Kromafin hücrelerinde yapılan son konfokal ve uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) görüntüleme çalışmaları, füzyon gözeneklerinin açılmasını ve kapanmasını (öp ve çalıştır, yakın füzyon olarak da adlandırılır), uzun süre açık gözenekli bir Ω şeklini koruyan füzyon gözenek açıklığını, kalış-füzyon olarak adlandırılan füzyon gözenek açıklığını ve kaynaştırıcı vezikülün plazma zarı ile birleşene kadar küçülmesini doğrudan gözlemlemiştir. 8,14,15,16,17.
Nöronlarda, füzyon gözeneklerinin açılması ve kapanması, füzyon gözeneklerinden daha büyük veziküllere önceden yüklenmiş kuantum noktalarının salınımını gösteren görüntüleme ve sinir terminallerininsalınım yüzünde füzyon gözenek iletkenlik ölçümleri ile tespit edilmiştir 5,18,19. Adrenal kromafin hücreleri, ekzo- ve endositoz20,21'in incelenmesi için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Kromafin hücreleri büyük yoğun çekirdekli veziküller içermesine rağmen, sinapslar küçük sinaptik veziküller içerirken, kromafin hücrelerinde ve sinapslarda ekzositoz ve endositoz proteinleri oldukça benzerdir 10,11,12,20,21,22,23.
Burada, sığır adrenal kromafin hücrelerinde elektrofizyoloji ile kombine konfokal görüntüleme yöntemi kullanılarak bu üç füzyon modunu ölçmek için bir yöntem tanımlanmıştır (Şekil 1). Bu yöntem, ekzositozu tespit etmek için floresan sahte nörotransmitterlerin (FFN511) veziküllere yüklenmesini içerir; füzyon tarafından üretilen Ω şeklindeki profili doldurmak için banyo çözeltisine Atto 655 (A655) eklenmesi ve plazma zarının, plazma zarı 8,15,24'te PtdIns(4,5)P 2'ye bağlanan fosfolipaz Cδ'nin (PH) PH alanı ile etiketlenmesi. Füzyon gözenek dinamikleri, farklı floresan yoğunluklarındaki değişikliklerle tespit edilebilir. Kromafin hücreleri için tanımlanmış olmasına rağmen, burada açıklanan bu yöntemin prensibi, kromafin hücrelerinin çok ötesinde birçok salgı hücresine yaygın olarak uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187-500MG</td>
			<td>ATP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atto 655</td>
			<td>ATTO-TEC GmbH</td>
			<td>AD 655-21</td>
			<td>Atto dye to label bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Nucleofector for Primary Neurons</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VSPI-1003</td>
			<td>Electroporation transfection buffer along with kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boroscilicate capillary glass pipette</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0795</td>
			<td>Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-50G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride 2 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-130-721</td>
			<td>Reagent for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 100 &#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>Material for filtering chromaffin cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>232041</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.1214E+10</td>
			<td>Enzyme for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Neuvitro</td>
			<td>GG-14-Laminin</td>
			<td>GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11885092</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324626-25GM</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Nucleofector</td>
			<td>Amaxa Biosystems</td>
			<td>Nucleofector II</td>
			<td>Transfect plasmids into cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Reagent for preparing culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFN511</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120331</td>
			<td>Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5&#39;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877-250MG</td>
			<td>GTP for preparing internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>WaveMetrics</td>
			<td>Igor pro</td>
			<td>Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Confocal software for imaging data collection and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td>Confocal microscope for imaging data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49449-100G</td>
			<td>Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Lock-in</td>
			<td>Software for capacitance recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride 1 M</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>351-033-721EA</td>
			<td>Reagent for preparing internal solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3120</td>
			<td>Counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-830</td>
			<td>Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mNG(mNeonGreen)</td>
			<td>Allele Biotechnology</td>
			<td>ABP-FP-MNEONSB</td>
			<td>Template for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh filtering screen 100 micron</td>
			<td>EIKO filtering co</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>Material for filtering medulla suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch clamp EPC-10</td>
			<td>Heka</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td>Amplifier for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH-EGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #51407</td>
			<td>Backbone for PH-mNeonGreen construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Make pipettes for patch-clamp recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5404-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution and bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse software</td>
			<td>Heka</td>
			<td>Pulse</td>
			<td>Software for patch-clamp data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1943/QR-40LP</td>
			<td>coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution, bath solution and internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td>Reagent for preparing Locke&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirring hot plate</td>
			<td>Barnsted/Thermolyne</td>
			<td>type 10100</td>
			<td>Heater for pipette coating with wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 30 mL</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302832</td>
			<td>Material for glands wash and digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraethylammonium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2265-100G</td>
			<td>TEA for preparing bath solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9253-5G</td>
			<td>Reagent for gland digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type F Immersion liquid</td>
			<td>Leica</td>
			<td>195371-10-9</td>
			<td>Leica confocal mounting oil</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal microscopy to measure three modes of fusion pore dynamics in adrenal chromaffin cells

Dinamik füzyon gözenek açma ve kapama ekzositoz ve endositoza aracılık eder ve kinetiklerini belirler. Burada, konfokal mikroskopinin, primer kültür sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu tespit etmek için yama-kelepçe kaydı ile kombinasyon halinde nasıl kullanıldığı ayrıntılı olarak gösterilmiştir. Üç füzyon modu arasında 1) füzyon gözeneklerinin açılmasını ve kapatılmasını içeren yakın füzyon (öpüş ve koş olarak da adlandırılır), 2) füzyon gözenek açılmasını ve açılan gözenekin korunmasını içeren stay-füzyon ve 3) füzyon tarafından üretilen Ω şeklindeki profilin plazma zarında tamamen birleşene kadar büzülmesini içeren büzülme-füzyon bulunur.
Bu füzyon modlarını tespit etmek için, plazma membranı, plazma zarının sitosol yüzlü broşüründe fosfatidilinositol-4,5-bisfosfata (PtdIns (4,5) P2) bağlanan fosfolipaz C δ (PH-mNG) PH alanı ile tutturulmuş mNeonGreen'i aşırı eksprese ederek etiketlendi; veziküller, veziküler içerik salınımını tespit etmek için floresan yanlış nörotransmitter FFN511 ile yüklendi; ve Atto 655, füzyon gözenek kapanmasını tespit etmek için banyo çözeltisine dahil edildi. Bu üç floresan prob, füzyon gözenek açıklığını, içerik salınımını, füzyon gözenek kapanmasını ve kaynaştırma vezikül boyutu değişikliklerini tespit etmek için canlı kromafin hücrelerinde kare başına ~ 20-90 ms'de aynı anda görüntülendi. Analiz yöntemi, üç füzyon modunu bu floresan ölçümlerinden ayırt etmek için tanımlanmıştır. Burada açıklanan yöntem, prensip olarak, kromafin hücrelerinin ötesindeki birçok salgı hücresine uygulanabilir.

Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilen deneysel prosedürleri takiben, sığır adrenal bezlerinden kromafin hücreleri, plazma zarını etiketlemek için PH-mNG ile transfekte edildi; Füzyon gözenek kapanmasını tespit etmek için banyo çözeltisine A655 eklendi; ve floresan sahte nörotransmitter FFN511, salınımın tespiti için veziküllere yüklendi. Daha sonra, FFN511, PH-mNG ve A655'in XY düzlemi konfokal timelapse görüntülemesi, hücre tabanında h...

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells at JoVE.com

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

Bu protokol, sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu tespit etmek için konfokal bir görüntüleme tekniğini tanımlar. Bu füzyon modları arasında 1) füzyon gözenek açma ve kapama içeren yakın füzyon (öpüş ve koş olarak da adlandırılır), 2) füzyon gözenek açılmasını ve açılan gözenekin korunmasını içeren stay-füzyon ve 3) kaynaşmış vezikül büzülmesini içeren büzülme-füzyon bulunur.

Adrenal Kromafin Hücrelerinde Üç Füzyon Gözenek Dinamiği Modunu Ölçmek için Konfokal Mikroskopi

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...

Membran füzyonu birçok biyolojik fonksiyona aracılık eder. Bu protokol, füzyon gözenek açıklığını ve verici salınım dinamiklerini tespit etmek ve üç füzyon modunu ayırt etmek için bir yöntem açıklar; füzyonu kapat, füzyonda kal ve füzyonu küçült. Konfokal mikroskop ve yama-kelepçe kaydının kombinasyonu, füzyon gözeneklerinin açılması ve kapatılmasının görselleştirilmesini ve kinetiklerinin belirlenmesini kolaylaştırır.Kromafin hücreleri için tanımlanmış olmasına rağmen, burada açıklanan yöntemin prensibi, kromafin hücrelerinin çok ötesinde birçok salgı hücresine yaygın olarak uygulanabilir. Bu yöntemin başarılı bir şekilde uygulanması, sağlıklı primer kromafin hücre kültürü üretme, yeterli plazmid transfeksiyon etkinliği ve yüksek elektrofizyolojik kayıt başarı oranı gibi birkaç genel adıma bağlıdır. Yüzeyde kesik veya kanama olmadan üç sağlam bez seçin ve yağ dokusunu makasla çıkarın.Bezleri, kan çıkmayana kadar Locke'un çözeltisi ile perfüzyonla yıkayın. Sindirim için, bez şişmeye başlayana kadar 0.22 mikrometrelik bir filtreyle tutturulmuş 30 milimetrelik bir şırınga kullanarak enzim çözeltisini adrenal damardan enjekte edin. Sonra bezleri 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede bırakın.Tekrar enjekte edin ve bezleri 10 dakika daha 37 santigrat derecede bırakın. Sindirimden sonra, bezi açmak için bezi adrenal damardan diğer uca uzunlamasına makasla kesin. Beyaz medullayı, parçalar halinde Locke'un çözeltisini içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına cımbızlayarak izole edin.Medullayı makasla kesin ve doğrayın. Medulla süspansiyonunu 80 ila 100 mikrometre naylon ağ ile bir beher içine filtreleyin. Filtrazı 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın ve üç yavaşlama ile üç dakika boyunca 48 x g oda sıcaklığında santrifüj yapın.Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı çıkarın ve pipetle hücre peletini Locke çözeltisi ile yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 80 ila 100 mikrometrelik bir süzgeçle filtreleyin ve 48 x g oda sıcaklığında üç dakika boyunca yavaşlama ile üç dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 30 mililitre kültür ortamı ile yeniden askıya alın.Bir hemositometre sayma odası kullanarak hücre sayısını belirleyin. 2.800.000 hücreyi 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri 48 x g'de santrifüjleme ile iki dakika boyunca üç yavaşlama ile pelet edin.Hücre peletine üretici tarafından sağlanan 100 mikrolitre transeksiyon tamponu ekleyin. Ve sonra iki mikrogram PH-mNG plazmid ekleyin. Çözeltiyi yukarı ve aşağı borulayarak süspansiyonu yavaşça karıştırın ve karışımı gecikmeden bir elektroporasyon küvetine aktarın.Küveti hemen elektroporatöre aktarın, ekran listesinden 005 programını seçin ve elektroporasyon yapmak için Enter tuşuna basın. Elektroporasyondan sonra, küvete hemen 1,8 mililitre orta ekleyin ve steril bir uçla donatılmış bir mikropipetle hafifçe karıştırın. Elektroporasyonlu hücrelerin süspansiyonunun 300 mikrolitresini, bir elektroporasyon reaksiyonu için toplamda beş ila altı tabak kaplayan her bir tabaktaki kapak kaymasına ekleyin.Bulaşıkları 30 dakika boyunca% 9 karbondioksit ile 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatöre dikkatlice aktarın ve 30 dakika sonra her yemeğe hafifçe iki mililitre önceden ısıtılmış ortam ekleyin. Borosilikat cam kılcal damarlardan yama pipetleri bir pipet çektirme makinesi ile çekerek, uçlarını sıvı balmumu ile kaplayarak ve bir mikroforge ile parlatarak hazırlayın. Yama kelepçesi kayıt amplifikatörünü açın ve yazılımı başlatın.Yazılımın uygun kalsiyum akımını ve kapasitans kayıt parametrelerini ayarlayın. Stimülasyonun 10 saniyede başladığı toplam 60 saniyelik bir kayıt protokolü ayarlayın. Voltaj kelepçesi kaydı için tutma potansiyelini 80 milivolta ayarlayın.Kalsiyum akışını ve kapasitans sıçramasını indüklemek için uyaran olarak eksi 80 milivolttan 10 milivolta bir saniyelik depolarizasyon ayarlayın. Konfokal mikroskop sistemini açın ve yazılımdaki uygun parametreleri ayarlayın. 458 nanometre, 514 nanometre ve 633 nanometre dahil olmak üzere lazerleri açın ve her floresan probuna göre her lazer için emisyon toplama aralığını ayarlayın.İyi hücre durumuna ve doğru ifadeye sahip bir çanak seçin ve çanaktaki ortama iki mikrolitre floresan sahte nörotransmitter FFN511 ekleyin. Çanağı 20 dakika boyunca inkübatöre geri koyun. FFN511'i yükledikten sonra, kayıt odasını hazırlayın ve 50 mikrolitre banyo çözeltisine iki mikrolitre floresan boya A655 ekleyin.Kapak kaymasını çanaktan cımbızla kayıt odasına aktarın ve hemen A655 içeren banyo solüsyonunu ekleyin. 100X yağ daldırma hedefine bir damla yağ yerleştirin. Odayı mikroskopa monte edin ve yağı sadece kapak kaymasının altına temas ettirmek için ayar düğmesini kullanın.Hücreleri odaklayın ve mNG ekspresyonuna sahip uygun bir hücre bulmak için parlak alan ve konfokal görüntüleme kullanın. Seçilen hücreyi yakınlaştırın ve boş bölgeleri en aza indirerek görüş alanında ortalayın. XY düzlemi konfokal görüntüleme parametrelerini, FFN511, PH-mNG ve A665'in sabit bir Z-düzleminde, en aza indirilmiş bir zaman aralığıyla ayarlayın.İnce ayar düğmesiyle odağı hücrenin altına ayarlayın. En iyi sinyal-gürültü oranını elde etmek ve önemli floresan ağartmayı önlemek için bir ayar bulmak üzere yazılımdaki uyarma lazer gücünü ayarlayın. Bir yama pipetine dokuz mikrolitre dahili çözelti ekleyin ve pipeti yama kelepçeli amplifikatör aşamasının tutucusuna takın.Bir şırınga ile az miktarda pozitif basınç uygulayın ve banyo çözeltisine bir mikromanipülatörle dokunmak için pipet ucunu hareket ettirin. Amplifikatörün, voltaj darbe testi ile pipet direncinin yaklaşık iki ila dört megaohm arasında olduğunu gösterdiğinden emin olun. Sıvı bağlantısını iptal etmek için LJ/Auto düğmesine basın.Pipetleri bir mikromanipülatör ile seçilen hücreye doğru hareket ettirin. Hücreye bağlı bir mod oluşturmak için, pipet ucunu hareket ettirerek hücreye dokunun. Bir şırınga ile hafif negatif basınç uygularken tutma potansiyelini sıfırdan eksi 80 milivolta değiştirin.Direnç bir gigaohm'u geçtikten sonra, konfigürasyonun stabilize olması için yaklaşık 30 saniye bekleyin. Hızlı kapasitansı telafi etmek için C-fast/Auto tuşlarına basın. Bir toptan satış modu oluşturmak için, membran yırtılana kadar şırınga ile kısa ama güçlü negatif basınç darbeleri uygulayın.Yavaş kapasitansı telafi etmek için C-yavaş/Otomatik tuşlarına basın. Görüntüleme odağını hücre tabanına odaklanacak şekilde hafifçe ayarlayın. İki farklı yazılım uygulamasıyla Başlat düğmelerine tıklayarak konfokal hızlandırılmış görüntüleme ve yama kelepçesi kaydını aynı anda başlatın.Kayıttan sonra, verilerin kaydedildiğinden emin olun. Tutma potansiyelini sıfır milivolta geri döndürün. Pipetleri banyo solüsyonundan çıkarın ve atın.Ham görüntüleme dosyalarını herhangi bir üreticiyle veya sağlanan yazılımla açın. İşlem'e gidin, ProcessTools'a tıklayın ve her zaman atlamalı görüntü için yuvarlanan ortalama dosyalar oluşturmak için araçları kullanın. Bu dosyaları kaydedin.Nicelik altında, Araçlar'a gidin ve stimülasyondan önceki ve sonraki zaman noktalarını kontrol etmek ve her kanaldaki floresan değişikliklerini tanımlamak için Yığın Profili düğmelerine tıklayın. Füzyon etkinlikleri için ilgi çekici bölgeleri daire içine almak üzere Elips çiz düğmesine tıklayın. Resme sağ tıklayın ve kaydetmek için YG'leri Kaydet'e tıklayın.Ham dosyayı bulmak için Projeleri aç'ı tıklatın. Floresan yoğunluklarını ölçmek üzere ROI dosyasını ham görüntüleme dosyasına yüklemek için resme sağ tıklayın ve YG'leri Yükle'ye tıklayın. Araçlar'a gidin ve yazılımdaki YG'leri Sırala'ya tıklayın ve her YG'nin üç kanalının da izlerini çizin.Her YG için dijital veriler ve görüntüleme izlemeleri de dahil olmak üzere yatırım getirisi verilerini bir dosya klasörüne kaydetmek için Rapor'u tıklatın. Tüm hücre yama-kelepçe kaydı ve 80 ila 10 milivolt arasında bir saniyelik depolarizasyonun uygulanması ekzos ve endositozu uyandırmak için yapıldı. Uygulanan depolarizasyon, içe doğru bir kalsiyum akımına, ekzositozu gösteren bir kapasitans sıçramasına ve sıçramadan sonra endositozu gösteren bir kapasitans bozunumuna neden oldu.Hücre tabanında hızlandırılmış görüntüleme ile, bir saniyelik depolarizasyon protokolünün neden olduğu füzyon olayları, FFN511 salınımını yansıtan FFN azalması olarak, FPH ve A655 spot floresan artışı eşliğinde, plazma zarından ve banyo çözeltisinden kaynaştırıcı veziküle PH-mNG ve A655 difüzyonunu yansıtan FFN azalması olarak belirtildi. Şekil, F655 karartma olarak tanımlanan yakın füzyonu sunarken, FPH gecikmeyle devam etti veya bozundu. Şekil, hem PH-mNG hem de A655 lekelerinin varlığı ile tespit edilen kalma füzyonunu temsil etmektedir.Şekil, PH-mNG noktasının ve A655 noktasının paralel boyut azalmasıyla birlikte paralel FPH ve F655 bozunumu olarak tespit edilen büzülme füzyonunu temsil eder Başarılı kayıt, tüm hücre konfigürasyonunun yama kelepçesi ile oluşturulmasını ve hücre tabanında her kanal için uygun floresan yoğunluğu ile görüntülenmesini gerektirir. Burada açıklanan elektrofizyoloji ve süper çözünürlüklü mikroskopinin kombinasyonu, füzyon gözenek dinamiklerini ve nörodevreleri ölçmek için değerli bir araçtır.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Sinekler Etanol Hassasiyet Tedbir Basit Yolu

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Nörobilim

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

Fare Adrenal Kromafin Cell Hücre bağlı Kapasitans Ölçümler Yöntemleri

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Nöromusküler Kavşak: Ölçme Synapse Boyut, Konfokal Floresan Mikroskobu kullanılarak sinaptik Protein Yoğunluk Parçalanma ve Değişiklikler

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Motor Nöron benzeri NSC-34 Hücrelerinde Gerçek Zamanlı Nükleositoplazmik Taşınımı Ölçüm Testi

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Three-dimensional Navigation-guided, Prone, Single-position, Lateral Lumbar Interbody Fusion Technique

Üç Boyutlu Navigasyon Kılavuzlu, Eğilimli, Tek Pozisyonlu, Yanal Bel İnterkom Füzyon Tekniği

Lateral interbody fusion provides a significant biomechanical advantage over the traditional transforaminal lumbar interbody fusion due to the large ...