Name: establishment of deep hypothermic circulatory arrest in rats
Uploaded: 2022-12-16T12:30:00
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Die Autoren danken Liang Zhang für die Hilfe bei der Sammlung der Videodaten während des Experiments. Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Förderkennzeichen: 82070479) und den Fundamental Research Funds for the Central Universities (Fördernummer: 3332022128) unterstützt.

Die Protokolle wurden einer institutionellen Überprüfung unterzogen und vom Institutional Animal Care and Use Committee, Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (FW-2021-0005) genehmigt. Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem von den National Institutes of Health veröffentlichten Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.
HINWEIS: Männliche Sprague-Dawley-Ratten (Gewicht: 500-600 g, Alter: 12-14 Wochen) wurden unter Standa...

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	<li>Lewis, F. J., Taufic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closure+of+atrial+septal+defects+with+the+aid+of+hypothermia;+experimental+accomplishments+and+the+report+of+one+successful+case.">Closure of atrial septal defects with the aid of hypothermia; experimental accomplishments and the report of one successful case.</a> Surgery. 33 (1), 52-59 (1953).</li><li>Miler, R. 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C., Cao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+effects+of+chlorogenic+acid+treatment+on+neuroinflammation+after+deep+hypothermic+circulatory+arrest+may+be+mediated+through+CYLD/NF-&#954;B+signaling.">Beneficial effects of chlorogenic acid treatment on neuroinflammation after deep hypothermic circulatory arrest may be mediated through CYLD/NF-&#954;B signaling.</a> Brain Research. 1767, 147572 (2021).</li><li>Li, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+profiles+of+circular+RNAs+in+the+rat+hippocampus+after+deep+hypothermic+circulatory+arrest.">Differential expression profiles of circular RNAs in the rat hippocampus after deep hypothermic circulatory arrest.</a> Artificial Organs. 45 (8), 866-880 (2021).</li><li>Linardi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+versus+fast+rewarming+after+hypothermic+circulatory+arrest:+effects+on+neuroinflammation+and+cerebral+oedema.">Slow versus fast rewarming after hypothermic circulatory arrest: effects on neuroinflammation and cerebral oedema.</a> European Journal of Cardiothoracic Surgery. 58 (4), 792-780 (2020).</li><li>Engelman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Society+of+Thoracic+Surgeons,+The+Society+of+Cardiovascular+Anesthesiologists,+and+The+American+Society+of+ExtraCorporeal+Technology:+Clinical+practice+guidelines+for+cardiopulmonary+bypass--Temperature+management+during+cardiopulmonary+bypass.">The Society of Thoracic Surgeons, The Society of Cardiovascular Anesthesiologists, and The American Society of ExtraCorporeal Technology: Clinical practice guidelines for cardiopulmonary bypass--Temperature management during cardiopulmonary bypass.</a> Annals of Thoracic Surgery. 100 (2), 748-757 (2015).</li><li>Jenke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AdipoRon+attenuates+inflammation+and+impairment+of+cardiac+function+associated+with+cardiopulmonary+bypass-induced+systemic+inflammatory+response+syndrome.">AdipoRon attenuates inflammation and impairment of cardiac function associated with cardiopulmonary bypass-induced systemic inflammatory response syndrome.</a> Journal of the American Heart Association. 10 (6), 018097 (2021).</li></ol>

Kanülierung ist das grundlegendste Verfahren zur Etablierung von DHCA bei Ratten. Vor der Kanülierung erleichtert das Einweichen der Arterie mit 0,5 ml 2% Lidocain die Kanülierung. Nach der Kanülierung ist eine Heparinisierung mit 500 I.E./kg Heparin über die Vena jugularis externa notwendig, um eine Mikrothrombusbildung zu vermeiden17. Wir haben wiederholt festgestellt, dass diese Dosis von Heparin das Ziel einer aktivierten Gerinnungszeit (ACT) >480 s erreichen kann. Die Wiedererw?...

Der tiefe hypothermische Kreislaufstillstand (DHCA) wird seit 1953 in der Herzchirurgie eingesetzt1. DHCA beinhaltet die Senkung der Kerntemperatur des Patienten auf ein stark hypothermisches Niveau (15-22 ° C), bevor der Blutfluss zum Körper global unterbrochenwird 2. Der Kreislaufstillstand kann ein relativ unblutiges Operationsfeld liefern. Tiefe Hypothermie verringert den Stoffwechsel, insbesondere im Gehirn und Myokard, was eine wirksame Methode zum Schutz vor Ischämie ist3. DHCA wird häufig bei Operationen bei komplexen angeborenen Herzfehlern, Aortenbogenerkrankungen und sogar Nieren- oder Nebennierentumoren mit einem Vena Cava-Thrombus 4,5 angewendet. Daher bietet die Etablierung von DHCA-Tiermodellen eine wichtige Referenz für die Verfeinerung des Verfahrens und die Vermeidung von Komplikationen im klinischen Umfeld.
Obwohl Modelle mit Eckzähnen6, Kaninchen7 und anderen Tieren etabliert werden können, ist es vorzuziehen, Ratten wegen ihrer Bedienbarkeit und niedrigen Kosten zu verwenden. Das DHCA-Rattenmodell wurde erstmals 2006 von Jungwirth et al.8 beschrieben. Es wurde festgestellt, dass die Dauer des Kreislaufstillstands einen Einfluss auf die neurologischen Ergebnisse hatte. Seitdem wurden DHCA-Rattenmodelle breit untersucht. Es wurde klargestellt, dass DHCA ein systemisches Entzündungsreaktionssyndrom (SIRS) hervorrufen könnte9. In nachfolgenden Studien fanden Pharmakologen heraus, dass die durch SIRS induzierte DHCA-bedingte Neuroinflammation durch Resveratrol10 und Triptolid11 abgeschwächt werden konnte. Unser Team fand auch heraus, dass DHCA-bedingte Neuroinflammation durch Hemmung des kälteinduzierbaren RNA-bindenden Proteins12 abgeschwächt werden kann. Im kardiovaskulären System hat Superoxiddismutase eine kardioprotektive Wirkung auf Ischämie / Reperfusion (I / R) -Verletzungen während DHCA13. Diese Ergebnisse erweiterten das Verständnis von DHCA-bezogenen pathophysiologischen Prozessen und boten neue Wege zur Verbesserung der DHCA-Ergebnisse. Die Ergebnisse in Bezug auf Endotoxämie, oxidativen Stress und Autophagie nach DHCA sind jedoch nicht schlüssig. DHCA verwendet die gleiche operative Technologie wie der kardiopulmonale Bypass (CPB)14, aber seine Managementstrategie ist unterschiedlich, und die Schritte zur Erzeugung von DHCA unterscheiden sich in verschiedenen Teams 8,9,10,11. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, eine Methode zur Etablierung des DHCA-Verfahrens bei Ratten bereitzustellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Heat Exchanger</td>
			<td>Xi&#8217;an Xijing Medical Appliance Co., Ltd</td>
			<td>Animal-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Oxygenator</td>
			<td>Dongguan Kewei Medical Instrument Co., Ltd.</td>
			<td>Micro-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monitor</td>
			<td>Chengdu Techman Co., Ltd</td>
			<td>BL-420s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller Pump</td>
			<td>Changzhou Prefluid Technology Co.,Ltd</td>
			<td>BL100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD Rat</td>
			<td>HFK Bioscience Co.,Ltd.</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>Maruishi Pharmaceutical Co. Ltd</td>
			<td>H20150020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaver</td>
			<td>Hangzhou Huayuan Pet Products Co.,Ltd.</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporizer</td>
			<td>SPACECABS</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ventilator</td>
			<td>Shanghai Alcott Biotech Co., Ltd</td>
			<td>ALC-V8S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Tank</td>
			<td>Maquet Critical Care AB</td>
			<td>Jostra HCU20-600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of deep hypothermic circulatory arrest in rats

Der tiefe hypothermische Kreislaufstillstand (DHCA) wird routinemäßig während Operationen bei komplexen angeborenen Herzfehlern und Aortenbogenerkrankungen angewendet. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, eine Methode zur Etablierung von DHCA bei Ratten bereitzustellen. Um den Einfluss des DHCA-Prozesses auf die Vitalparameter zu bewerten, wurde ein normaltemperatur-Herz-Lungen-Bypass-Modell (CPB) ohne Kreislaufstillstand als Kontrolle verwendet. Wie erwartet, führte DHCA zu einer signifikanten Abnahme der Körpertemperatur und des mittleren arteriellen Blutdrucks. Die Blutgasanalyse zeigte, dass DHCA den Milchsäurespiegel erhöhte, aber den Blut-pH-Wert und die Konzentrationen von Hämoglobin, Hämatokrit, Na+, Cl−, K+ und Glukose nicht beeinflusste. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse der Transmissionselektronenmikroskopie im Vergleich zu den normalen CPB-Ratten einen leichten Anstieg der Hippocampus-Autophagosomen bei den DHCA-Ratten.

Als Kontrollgruppe zeigten die Normaltemperatur-CPB-Ratten (NtCPB) ohne Kreislaufstillstand während des gesamten Verfahrens einen stabilen mittleren arteriellen Blutdruck (MAP) und eine stabile Körpertemperatur, während der MAP der DHCA-Ratten während des Herzstillstands abnahm (p < 0,01, Abbildung 3A). Die Temperatur der DHCA-Ratten sank während der Abkühlphase schnell und erholte sich allmählich während der Wiedererwärmungsphase. Beim Absetzen der Ratten aus den DHCA-Krei...

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Establishment of Deep Hypothermic Circulatory Arrest in Rats

Dieses Protokoll stellt die Etablierung eines tiefen hypothermen Kreislaufstillstands bei Ratten dar, der zur Untersuchung des systemischen Entzündungsreaktionssyndroms, der Ischämie / Reperfusionsverletzung, des oxidativen Stresses, der Neuroinflammation usw. angewendet werden kann.

Etablierung eines tiefen hypothermen Kreislaufstillstands bei Ratten

Deep hypothermic circulatory arrest (DHCA) is routinely applied during surgeries for complex congenital heart disease and aortic arch disease. The present ...

Etablierung eines tiefen hypothermen Kreislaufstillstands bei Ratten. Tiefer hypothermer Kreislaufstillstand, DHCA wird routinemäßig während Operationen von komplexen angeborenen Herzfehlern und Aortenbogenerkrankungen angewendet. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, eine Methode zur Etablierung von DHCA bei Ratten bereitzustellen.Die Protokolle erhielten eine institutionelle Überprüfung und die Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee, Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences. Vorarbeit. Stellen Sie sicher, dass CPB-Kreisläufe ein Reservoir enthalten, das aus Morphen modifiziert ist Tropfer, Rollenpumpe, Wärmetauscher, Membranoxygenator, Verbindungsrohr und ein Wassertank, der den Kreislauf verbindet, und macht 12 Milliliter Hydroxystärke mit einem Milliliter Heparinnatrium und einem Milliliter Kochsalzlösung mit 40 Milliliter Ansauglösung, wobei sich die Rollenpumpe sanft dreht.Zweitens, Anästhesie und Kanülierung. Verbinden Sie den Schlauch mit dem Beatmungsgerät und den Seitenparametern. Legen Sie eine elektrische Heizdecke und die rechte und Gesicht die richtige mit Klebeband.Tragen Sie Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern. Rasieren Sie die Haare an der rechten Leistenregion, der rechten Halsregion und dem Schwanz mit dem Rasierer. Desinfizieren Sie dann die Haut mit Aldehyd und Alkohol.Schneiden Sie die Haut und die linke Leistenregion und sezieren Sie den Muskel- und Gewebeweichknochen, um die linke Oberschenkelvene und Arterie freizulegen. Trennen Sie die Arterie sorgfältig. Cannulate 22 Gauge intravenöser Katheter in die linke Oberschenkelarterie.Ligierte Arterie und Katheter mit Seide. Verwenden Sie Heparinhaltige Kochsalzlösung, um die Kanüle zu spülen, um Gerinnung zu vermeiden. Verbinden Sie den Katheter mit dem Pressensensor, um den Blutdruck zu überwachen.Schneiden Sie die Haut des Schwanzes ab und schneiden Sie dann mit einem Skalpell die oberflächlichen Spezies der Schwanzarterie, um die Schwanzarterie freizulegen, die sich in der Mitte des Operationsfeldes befindet. Cannulatieren Sie die Schwanzarterie mit dem 22 Gauge intravenösen Katheter. Ligatarterie und Katheter mit Seide.Verwenden Sie Heparinhaltige Kochsalzlösung, um den Katheter zu spülen, um Gerinnung zu vermeiden. Schneiden Sie die Haut der rechten Vene ab und trennen Sie dann Muskeln und Gewebe, um die Vene freizulegen. Führen Sie einen 16-Gauge-hausgemachten Multiage-intravenösen Katheter in den rechten äußeren Venenkranz ein und legen Sie ihn vorsichtig in die rechte untere Vena cava oder den rechten Vorhof.Verabreichen Sie Heparinnatrium, wo die rechte äußere Vene jede kanülierte Region mit feuchten Kugeln bedeckt, um eine Kontamination zu vermeiden. Drittens, verbinden Sie den Kreislauf mit dem Katheter in der Schwanzarterie und halten Sie die Pumpe ein bis zwei Milliliter pro Minute niedrig. Verbinden Sie dann das Reservoir mit dem Katheter in der rechten äußeren Halsvene.Stellen Sie sicher, dass sich immer ein Blutspiegel von etwa einem Zentimeter im Reservoir befindet. Schalten Sie den Wassertank ein und stellen Sie zuerst die Wassertemperatur auf 37 Grad Celsius ein. Wenn der Blutdruck stabil ist, erhöhen Sie den Durchfluss vorsichtig auf 80 bis 100 Milliliter pro Minute.Vier, Kühlung. Stellen Sie die Raumtemperatur auf etwa 20 Grad Celsius ein. Legen Sie Eiswürfel in diese Einweghandschuhe und legen Sie sie dann auf den rechten Kopf und die richtigen Seiten.Die Temperatur des Tanks wurde in Echtzeit entsprechend der rektalen Temperatur des Reises vorgeschlagen. Ändern Sie die relevanten Parameter des Beatmungsgeräts entsprechend den Ergebnissen der Blutgasanalyse. Fünf, tiefe Unterkühlung Kreislaufstillstand.Dann sinkt die Rektaltemperatur auf 15 bis 20 Grad Celsius. Wechseln Sie den Eisbeutel und entsorgen Sie die Handschuhe, um die Aufrechterhaltung einer tiefen Unterkühlung während des Kreislaufstillstands zu gewährleisten. Stoppen Sie die Walzenpumpe.Halten Sie das Reservoir in Kontakt mit der Umgebung und lassen Sie das Blut langsam von der äußeren Halsvene zum Reservoir ab. Achten Sie auf die Blutdruckreform. Nachdem es keinen Blutdruck und Herzschlag gibt, stoppen Sie die Drainage und halten Sie das Reservoir geschlossen.Schalten Sie den Ventilator aus. Sechs, Aufwärmen und Reperfusion. Ziehen Sie alle Einweghandschuhe aus und erhöhen Sie die Raumtemperatur auf 25 Grad Celsius.Stellen Sie die Sauerstoff-Beatmung des Speichers wieder her, während der venöse Drainageschlauch abgeschnitten bleibt. Schalten Sie die Rollenpumpe ein, um sicherzustellen, dass das Blut im Reservoir langsam wieder zum richtigen Körper gelangt. Schalten Sie das Beatmungsgerät ein, nachdem der Blutspiegel im Reservoir einen Zentimeter geblieben ist.Verwenden Sie den Drainageschlauch und lassen Sie das Blut langsam aus dem rechten Vorhof in das Reservoir ab. Schalten Sie die Heizlampe, das Heizkissen und den Wassertank ein. Stellen Sie die Temperatur des Wassertanks auf 25 Grad Celsius ein.Stellen Sie es dann rechtzeitig auf die linke Temperatur ein. Entfernen Sie die Heizlampe, nachdem die Rektaltemperatur wieder 34 Grad Celsius erreicht hat. Sieben, Entwöhnung von CPB.Reduzieren Sie langsam und allmählich die Walze der Pumpendurchflussrate und passen Sie die Venengeschwindigkeit an die Durchflussrate auf einen Milliliter pro Minute an. Halten Sie das Reservoir in Kontakt mit der Umgebung. Gießen Sie das restliche Blut in einem Kreislauf mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute.Stoppen Sie die Sauerstoffversorgung des Speichers und die Walzenpumpe. Euthanasiert nach einer Zeit der mechanischen Beatmung und einer tiefen Anästhesie. Repräsentative Ergebnisse.Als Kontrollgruppe gilt die Normaltemperatur CPB, NtCPB, Ratte. Ohne Kreislaufstillstand zeigte sich ein stabiler mittlerer arterieller Blutdruck MAP und Körpertemperatur während des gesamten Eingriffs. Während der MAP von DHCA-Ratten während des Herzstillstands abnahm.Die Temperatur der DHCA-Ratten fiel während der Abkühlphase schnell ab und erholte sich allmählich während der Drehphase. Nach dem Absetzen des DHCA-Kreislaufs normalisierte sich die Temperatur der DHCA-Ratten wieder. Die obigen Daten zeigten, dass unser DHCA-Verfahren die tatsächlichen Temperatur- und MAP-Veränderungen von Patienten in Kliniken imitierte.Die Wirkung des DHCA-Prozessors und des Anstiegs wurde mittels Blutgasanalyse untersucht. Nach dem Vollblutkontakt mit der Primärlösung war die Hämoglobinkonzentration in beiden Gruppen höher als sechs Gramm pro Deziliter. Die Entwöhnung von der DHCA-Oberfläche erhöhte sich auf neun Gramm pro Deziliter, da das verbleibende Blut im CPB-Kreislauf wieder in den rechten Kreis infundiert wurde.Der Hämatokrit, HCT, zeigte eine ähnliche Tendenz wie HB. Nach der DHCA-Reperfusion stieg die Laktatsäure schnell an, was in der DHCA-Gruppe ausgeprägter war. Der pH-Wert sank nach dem DHCA-Verfahren, was höchstwahrscheinlich das Ergebnis einer Laktatsäureansammlung war. Während des gesamten Experiments zeigte die Konzentration von Natrium, Chlorid, Kaliumionen und Glukose an jedem 10-Punkt keine signifikanten Unterschiede.Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass DHCA nur den erhöhten Laktatsäureanstieg induzierte, aber nicht den Blut-pH-Wert und die Konzentration von Hämoglobin, Hämatokrit, Natriumionen, Chloridionen, Kaliumionen und Glukose beeinflusste. Um den Einfluss von DHCA auf die neuronale Autophagie zu bewerten, verwendeten wir das Transmissionselektromikroskop und fanden und erhöhten überraschenderweise die Anzahl der Autophagosomen im Hippocampus von DHCA-Ratten. Die obigen Daten zeigten, dass unser DHCA-Modell tatsächliche Temperatur- und MAP-Änderungen der Patienten in den Kliniken imitierte.Dieses Modell kann angewendet werden, um systemisches Entzündungsreaktionssyndrom, Neuroinflammation usw. zu untersuchen.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Orthotopic Hind-Limb Transplantation in Rats

Composite tissue allotransplantation (CTA) now represents a valid therapeutic option after the loss of a hand, forearm or digits and has become a novel therapeutic entity in reconstructive surgery. However, long term high-dose multi-drug immunosuppressive therapy is required to ensure graft survival, bearing the risk of serious side effects which halters broader application. Further progression in this field may depend on better understanding of basic immunology and ischemia reperfusion injury in composite tissue grafts.
To date, orthotopic hind limb transplantation in rats has been the preferred rodent model for reconstructive transplantation (RT), however, it is an extremely demanding procedure that requires extraordinary microsurgical skills for reattachment of vasculature, bones, muscles and nerves.
We have introduced the vascular cuff anastomosis technique to this model, providing a rapid and reliable approach to rat hind limb transplantation. This technique simplifies and shortens the surgical procedure and enables surgeons with basic microsurgical experience to successfully perform the operation with high survival and low complication rates. The technique seems to be well suited for immunological as well as ischemia reperfusion injury (IRI) studies.

Here we describe the orthotopic rat hind-limb transplantation procedure, which seems to be the gold standard in vivo model for composite tissue allotransplantation research.

Orthotopen Hind-Limb Transplantation in Ratten

Composite tissue allotransplantation (CTA) now represents a valid therapeutic option after the loss of a hand, forearm or digits and has become a novel ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized animals. Before embarking on an examination of animals for parasites, two things should be considered. One: what use will be made of the information collected, and two: which test is the most appropriate. Knowing that animals are parasitized may be something that the facility accepts, but there is often a need to treat animals and then to determine the efficacy of treatment. Parasites may be detected in animals through various techniques, including samples taken from live or euthanized animals. Historically, the tests with the greatest diagnostic sensitivity required euthanasia of the animal, although PCR has allowed high-sensitivity testing for several types of parasite. This article demonstrates procedures for the detection of endo- and ectoparasites in mice and rats. The same procedures are applicable to other rodents, although the species of parasites found will differ.

This article describes various procedures for screening rats and mice to detect endo- or ectoparasitism. Several diagnostic assays will be demonstrated, both those suitable for use on live animals and those used after euthanasia of the animal. Photographs to aid in identification of rat and mouse parasites will be included.

Diagnose von Ekto-und Endoparasiten in Laborratten und Labormäusen

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized ...

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid cell lines (LCL) in vitro. Since LCL are latently infected with EBV, they provide a model system to investigate EBV latency and virus-driven B cell proliferation and tumorigenesis1. LCL have been used to present antigens in a variety of immunologic assays2, 3. In addition, LCL can be used to generate human monoclonal antibodies4, 5 and provide a potentially unlimited source when access to primary biologic materials is limited6, 7.
A variety of methods have been described to generate LCL. Earlier methods have included the use of mitogens such as phytohemagglutinin, lipopolysaccharide8, and pokeweed mitogen9 to increase the efficiency of EBV-mediated immortalization. More recently, others have used immunosuppressive agents such as cyclosporin A to inhibit T cell-mediated killing of infected B cells7, 10-12.
The considerable length of time from EBV infection to establishment of cell lines drives the requirement for quicker and more reliable methods for EBV-driven B cell growth transformation. Using a combination of high titer EBV and an immunosuppressive agent, we are able to consistently infect, transform, and generate LCL from B cells in peripheral blood. This method uses a small amount of peripheral blood mononuclear cells that are infected in vitroclusters of cells can be demonstrated. The presence of CD23 with EBV in the presence of FK506, a T cell immunosuppressant. Traditionally, outgrowth of proliferating B cells is monitored by visualization of microscopic clusters of cells about a week after infection with EBV. Clumps of LCL can be seen by the naked eye after several weeks. We describe an assay to determine early if EBV-mediated growth transformation is successful even before microscopic clusters of cells can be demonstrated. The presence of CD23hiCD58+ cells observed as early as three days post-infection indicates a successful outcome.

We describe a method for generating transformed B cell lines using Epstein-Barr virus. We also illustrate a novel assay that can identify B cells destined to undergo transformation as early as three days after infection.

Gründung des Epstein-Barr Virus Growth-transformierten lymphoblastoiden Zelllinien

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Einrichtung einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; System zur intrazelluläre Verhalten der Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Menschen THP-1-Makrophagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and pneumothorax from pleural disruption can result in a significant mortality rate. This protocol is a simple method of rat thymectomy that utilizes a mini-sternotomy and endotracheal intubation. Intubation is accomplished with a non-invasive and easily reproducible method and allows for positive pressure ventilation to prevent pneumothorax and a controlled airway that allows sufficient time for careful thymus dissection to minimize pleural disruption. A 1.5 cm sternal incision decreases contact with mediastinal vessels and pleura, while still providing full visualization of the thymus. Following exposure of the mediastinum, the thymus is removed by blunt dissection under magnification. The pleural space is then sealed by suture closure of the pre-tracheal muscles followed by the application of surgical glue. The thorax is then closed by suture closure of the sternum, followed by suture closure of the skin. All thymectomies were complete as evidenced by immunohistochemical (IHC) staining of mediastinal tissue, and absence of na&#239;ve T-cells by flow cytometry, and the procedure had a 96% survival rate. This method is suitable when complete thymectomy with minimal complications is desired for further immunological studies in athymic adult rats.

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

Komplette Thymektomie bei erwachsenen Ratten mit Nicht-invasive Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two Sprague-Dawley rats were used in this study. Animals were orally treated twice a day for two days with B. subtilis BSB3 strain or PBS. The next day after the last treatment, each group was divided and two experimental groups (one treated with PBS and one treated with B. subtilis) were placed at 45 oC for 25 min. Two control groups stayed for 25 min at room temperature. All rats were euthanized and different parameters were analyzed in all groups. Adverse effects of heat stress are registered by the decrease of villi height and total mucosal thickness in the intestinal epithelium; translocation of bacteria from the lumen; increased vesiculation of erythrocytes and elevation of the lipopolysaccharides (LPS) level in the blood. The protective efficacy of treatment is evaluated by prevention of these side effects. The protocol was set up for the oral treatment of rats with bacteria for prevention of heat stress complications, but this protocol can be modified and used for other routes of administration and for analysis of different compounds.

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

We described a protocol for prevention of heat stress effects in rats by oral pre-treatment with beneficial bacteria. This protocol can be modified and used for various routes of administration and for analysis of different compounds.

Prävention von Hitzestress Unerwünschte Wirkungen bei Ratten durch<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Dehnungs

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus formation in veins remain obscure. Lack of mobility (e.g., after surgery or long-haul flights) is one of the main factors leading to DVT. The pathophysiological consequence of the lack of mobility is blood flow stagnation in venous valves. Here, a model is described that mimics such flow disturbance as a thrombosis-driving factor. In this model, partial flow restriction (stenosis) in the inferior vena cava (IVC) is created. Closure of about 90% of the IVC lumen for 48 h results in development of thrombi structurally similar to those in humans. The similarities are: i) most of the thrombus volume is red, i.e., consists of red blood cells and fibrin, ii) presence of a white part (lines of Zahn), iii) non-denuded endothelial monolayer, iv) elevated plasma D-Dimer levels, and v) possibility to prevent thrombosis by low molecular weight heparin. Limitations include variable size of thrombi and the fact that a certain percentage of wild-type mice (0 - 35%) may not produce a thrombus. In addition to visual observation and measurement, thrombi may be visualized by non-invasive technologies, such as ultrasonography, which allows for monitoring the dynamics of thrombus development. At shorter time points (1 - 6 h), intravital microscopy may be applied to directly observe events (e.g., recruitment of cells to the vessel wall) preceding thrombus formation. Use of this method by several teams around the world has made it possible to uncover basic mechanisms of DVT initiation and identify potential targets that might be beneficial for its prevention.

We describe here stenosis in the inferior vena cava as a murine model of deep vein thrombosis. This model recapitulates blood flow restriction, one of the major triggers of venous thrombosis in humans.

Stenose der minderwertigen Vena Cava: ein Mausmodell der tiefen Venenthrombose

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus ...

Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death through pulmonary embolism or results in the post-thrombotic syndrome, characterized by chronic leg pain, swelling, and ulceration, or in chronic pulmonary hypertension resulting in significant chronic respiratory compromise. This is the most common cardiovascular disease after myocardial infarction and ischemic stroke and is a clinical challenge for all medical disciplines, as it can complicate the course of other disorders such as cancer, systemic disease, surgery, and major trauma.
Experimental models are necessary to study these mechanisms. The stasis model induces consistent thrombus size and a quantifiable amount of thrombus. However, it is necessary to systematically ligate side branches of the inferior vena cava to avoid variability in thrombus sizes and any erroneous data interpretation. We have developed a non-invasive technique to measure thrombus size using ultrasonography. Using this technique, we can assess thrombus development and resolution over time in the same animal. This approach limits the number of mice required for quantification of venous thrombosis consistent with the principle of replacement, reduction, and refinement of animals in research. We have demonstrated that thrombus weight and histological analysis of thrombus size correlate with measurement obtained with ultrasonography. Therefore, the current study describes how to induce deep vein thrombosis in mice using the inferior vena cava stasis model and how to monitor it using high frequency ultrasound.

The present protocol describes the steps to obtain venous thrombosis using a stasis model. In addition, we are using a non-invasive method to measure thrombus formation and resolution over time.

Tiefe Venenthrombose, induziert durch Stauung in den Mäusen durch Hochfrequenz-Sonographie überwacht

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily lead to infections in the dermis which can, in turn, result in the dissemination of pathogens into the bloodstream. Understanding how the immune system fights infections at the very early stage and how the host can eliminate the pathogens is an important step to set the base for future therapeutic interventions. Here we describe a model of Candida albicans infection that can visualize the processes that occur early during an infection, including when the pathogen has passed the epithelial barrier, as well as the immune response elicited by the C. albicans invasion. We used this infection model to perform histological analyses that show the immune cells that infiltrate the skin as well as the presence and localization of the pathogen. Samples collected after the infection can be processed for RNA extraction.

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Here we describe a protocol that allows histological and molecular analysis of skin samples after Candida albicans intradermal injection. This protocol maintains the structural integrity of the skin and allows for the localization of tissue-resident or newly recruited immune cells as well as the pathogen distribution.

Tief dermalen Injektion als ein Modell von Candida Albicans Infektion der Haut für histologische Analysen

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

Gründung der Virusinfektion und Analyse von Host-Virus-Wechselwirkung in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...