Dit protocol maakt een niet-invasieve transplantatie van iPSMG in immunocompetente muizenhersenen mogelijk door farmacologische aan/uit van een CSF1-receptorantagonist PLX5622 te combineren met transnasale transplantatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat iPSMG kan worden getransplanteerd zonder hersenschade te veroorzaken, zelfs bij immunocompetente muizen. Microgliale transplantatie kan dienen als een potentiële therapie om disfunctionele microglia uit te wisselen met functionele microglia bij verschillende neurodegeneratieve ziekten in de toekomst.
De procedure wordt gedemonstreerd door Bijay Parajuli, een onderzoeker uit mijn laboratorium. Begin met het snel ontdooien van de bevroren geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide menselijke microgliacellen in een waterbad van 37 graden Celsius. Draai de monsters totdat al het zichtbare ijs is gesmolten.
Voeg de ontdooide iPSMG toe aan de kweekmedia, opgewarmd tot 37 graden Celsius. Voeg één milliliter cellen toe aan 10 milliliter kweekmedia. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten op 300 maal g om een celkorrel te verkrijgen.
Verwijder het supernatant zonder de celkorrel te verstoren. Voeg het transplantatiemedium toe om een celconcentratie van 10 tot de vijfde cel per microliter te verkrijgen. Plaats de iPSMG op ijs en ga onmiddellijk over tot transplantatie.
Om muizen voor te bereiden op transnasale transplantatie, voedt u de mannelijke muizen met een dieet met PLX gedurende zeven dagen. Aan het einde van de zevende dag stopt u met het PLX-dieet en voedt u de muizen met een normaal dieet. Dien een uur voor transnasale transplantatie van iPSMG tweemaal 2,5 microliter hyaluronidase in PBS toe aan elk neusgat met behulp van een pipetpunt van 10 microliter om de permeabiliteit naar het neusslijmvlies te vergroten.
Plaats de muizen in rugligging na het aanbrengen van hyaluronidase. Dien 2,5 microliter hyaluronidase toe tien minuten voor de transnasale transplantatie van iPSMG. Breng 2,5 microliter celsuspensie aan in één neusgat van de muis met behulp van een pipetpunt van 10 microliter.
Plaats de muis gedurende vijf minuten in rugligging voordat de celsuspensie aan het andere neusgat wordt toegediend. Dien de celsuspensie vier keer toe, waarbij een totaal volume van 20 microliter per dier wordt toegepast. Herhaal 48 uur na het stoppen van PLX-voeding de toediening van hyaluronidase en celsuspensie op dezelfde muizen.
Breng voor toediening van cytokines 2,5 microliter van het transplantatiemedium aan in één neusgat van de muis met behulp van een pipetpunt van 10 microliter. Na twee maanden transnasale transplantatie kan het aantal getransplanteerde cellen worden bepaald door cellen te tellen die positief zijn voor zowel mensspecifieke als pan-microgliale markers. Endogene muismicroglia zijn alleen positief voor pan-microgliale marker.
Bij controlemuizen werden alleen muismicroglia gedetecteerd in zowel cortex als hippocampus. In de cortex van iPSMG getransplanteerde muizen werden alleen muismicroglia gedetecteerd, terwijl in de hippocampus iPSMG werden gedetecteerd. Bij het proberen van dit protocol is volledige verwijdering van supernatant essentieel om de verdunning van cytokines te voorkomen.
Het is cruciaal om cytokine elke 12 uur toe te passen voor de levensvatbaarheid van getransplanteerde cellen. Uitputting van endogene muismicroglia is vereist voor de transplantatie van iPSMG. Deze procedure maakt de transplantatie van iPSMG in een normaal of ziek muizenbrein mogelijk.
Zo kunnen de kenmerken van iPSMG en de respons op ziekte worden bepaald. Deze techniek is geschikt om de in vivo karakteristiek van iPSMG in het muizenbrein te bepalen. Het transplanteren van iPSMG in ziektemodelmuizen zal ons dus helpen de respons te begrijpen en kan de weg vrijmaken voor een nieuw therapeutisch doelwit.