该方法描述了一种使用活体亚细胞显微镜研究活体动物中性粒细胞迁移过程中膜重塑的技术。该协议提供了一种独特的方法，用于在物理条件下研究动物迁移过程中的膜动力学，并且不涉及组织微环境。该技术可以进行定制，以解决不同细胞类型和迁移细胞中的膜重塑和细胞骨架动态器官重新定位和膜运输。
首先，将绿色荧光染料添加到中性粒细胞悬浮液中，该悬浮液在1.5毫升BSA包被管中从野生型小鼠中纯化。在室温下在试管旋转器中轻轻搅拌孵育 30 分钟。使用 HBSS 洗涤 3 次，然后在室温下以 400 倍 G 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 1 毫升 Hanks 平衡盐溶液中。
将该悬浮液置于管旋转器中的BSA涂层管中，轻轻搅拌直至注射程序。注射前，将细胞沉淀重悬于盐水溶液中，以达到每 20 微升 200 万至 500 万个细胞的密度。将麻醉的动物转移到 37 摄氏度的加热垫上以保持其体温。
在测试爪子退出反射后，使用精细修剪器去除耳朵上的毛发以优化图像质量。将动物侧放，握住耳朵的边缘，用手术胶带将其沿加热垫压平，然后用中性粒细胞悬浮液填充装有 33 号针头的注射器，并将其安装在显微操纵器上。轻轻地将针头移向耳朵，然后慢慢刺穿皮肤。
一旦针头进入皮肤内，慢慢推动活塞，并输送两到三微升的细胞悬液。在小心地重复注射耳朵的两到三个不同区域后，小心地取下手术胶带，让动物在监督下恢复意识。让动物休息一小时，然后再进行成像，让组织和细胞从注射程序中恢复。
确保显微镜已打开，并将载物台和镜片预热至 37 摄氏度，然后再将麻醉动物放在显微镜载物台上。用玻璃盖玻片盖住载物台上的孔。小心地将麻醉的动物移到载物台上。
如果计划影像学检查超过一个小时，则使用眼药膏，并固定基于翼状输液的灌注系统。在盖玻片的中心滴一滴生理盐水，然后将注射中性粒细胞的耳朵放在其顶部。用无菌棉签轻轻将耳朵压平，划过盖玻片的中心，以去除气穴。
将一根木棍轻轻按在耳朵靠近动物头部的一侧，然后用胶带将其锁定，从而固定耳朵。然后使用显微镜目镜找到一个感兴趣的区域，并切换到多光子采集模式。将激光激发波长设置为 900 至 930 纳米，以允许同时采集绿色荧光染料、mTomato 和 Colagen-I。
然后在探测器上设置适当的反射镜和滤光片组合，以收集发射的光。确定最适合硬件配置的设置。即使可以以 30 秒到 1 分钟的间隔跟踪迁移细胞，也可以以至少不到 10 秒的更快速度对亚细胞事件进行成像。
在经典的活体显微镜方法中，使用 30X 镜头和图像尺寸为 512 x 512 像素的 Galvo 扫描仪来跟踪细胞迁移并研究宿主小鼠组织，并使用步长为 2 微米的电动载物台设置 Z 轴位移，以允许每 30 秒成像 30 微米深的体积。在活体亚细胞显微镜方法中，使用 40X 镜头和三倍平均共振扫描仪以更高的放大倍率和分辨率对高动态膜重塑进行成像。此外，还可以使用步长为 1 微米的压电陶瓷设置 Z 轴位移，允许每 4 到 5 秒进行 20 微米的深度体积成像。
通过将高功率激发激光聚焦在 20 x 20 微米的狭窄区域 10 秒，诱导无菌激光损伤以触发中性粒细胞迁移。通过出现在所有通道中的强自发荧光信号以及由此产生的胶原蛋白排列改变来识别激光诱导的损伤。在实验结束时保存数据以供进一步分析。
受体小鼠能够通过基于活体显微镜的方法可视化耳组织中的结构特征，例如血管、驻留细胞和毛囊。由于在所有通道中都能检测到强烈的自发荧光，并且由于胶原蛋白排列的改变，激光诱导的损伤很容易看到。皮肤的三维结构和注射的中性粒细胞定位的完整视图在三维体积渲染中描绘了皮肤从外层到内层的 Z 堆栈。
延时成像显示中性粒细胞对耳部皮肤进行采样，并与细胞内基质和宿主组织相互作用。使用活体亚细胞显微镜，可以清楚地看到质膜在迁移过程中的动态重塑、前缘膜突起的形成以及细胞后部的回缩。延时序列揭示了与细胞内基质相互作用的复杂性。
使用基于识别细胞表面下方 100 个边界点的算法管道分析质膜的局部动力学。计算了每个边界点的局部曲率和质膜突起下划线区域的变化，并在每个时间范围内以 kymograph 的形式报告。细胞的前部和后部都比细胞的侧面保持更高的曲率。
负区域变化在细胞的后部比在前缘更明显，在前缘，正区域的变化更突出。成像后，可以收集、固定和处理组织进行染色，以进一步评估感兴趣的靶标并阐明机制。该程序旨在对膜动力学进行成像，可以进行定制，以解决不同细胞类型和各自环境中迁移细胞中更广泛的细胞生物学问题。
