बड़े पैमाने पर संवेदनशील कण ट्रैकिंग झिल्ली-संबद्ध Macromolecule Dynamics को चिह्नित करने के लिए

बड़े पैमाने पर संवेदनशील कण ट्रैकिंग के साथ, हम लिपिड झिल्ली पर अलग-अलग अलग बायोमोलेक्यूल्स का निरीक्षण कर सकते हैं और वास्तविक समय में उनकी गतिशीलता को माप सकते हैं, सभी पूरी तरह से मुक्त लेबल कर सकते हैं। चूंकि कोई लेबल की आवश्यकता नहीं है, इसलिए बायोमोलेक्यूल्स के गतिशील व्यवहार को परेशान करने का कोई खतरा नहीं है। इस विधि का एक और लाभ इसकी बड़े पैमाने पर संवेदनशीलता है, जो हमें झिल्ली-बाध्य ओलिगोमेरिक राज्यों को निर्धारित करने की अनुमति देता है।

इसकी बहुमुखी प्रतिभा के कारण, हम इस विधि को किसी भी झिल्ली से जुड़ी प्रणाली पर लागू कर सकते हैं। विशेष रूप से, इसका उपयोग लिगैंड-प्रेरित रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स के गठन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। PTFE धारकों में माइक्रोस्कोप स्लाइड की एक समान संख्या वितरित करके शुरू करें।

पीटीएफई धारकों को बीकरों में स्थानांतरित करें। अल्ट्राप्योर पानी जोड़ें और उन्हें कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए sonicate। बीकरों को साफ करने और अल्ट्राप्योर आइसोप्रोपेनॉल जोड़ने के लिए धारकों को स्थानांतरित करने के लिए चिमटी का उपयोग करें।

15 मिनट के लिए फिर से Sonicate, तो फिर ultrapure पानी के साथ isopropanol की जगह, और 15 मिनट के लिए धारकों युक्त बीकर sonicate. बीकर से धारकों को निकालें और नाइट्रोजन गैस या संपीड़ित हवा की एक स्थिर धारा के तहत धारक में माइक्रोस्कोप स्लाइड को सुखाएं। प्लाज्मा क्लीनर में बड़े माइक्रोस्कोप स्लाइड वाले सूखे धारक को रखें और इसे चालू करें।

एल्यूमीनियम पन्नी के साथ फ्लैट कार्डबोर्ड लपेटें। एक दूसरे के बीच पर्याप्त दूरी के साथ एल्यूमीनियम पन्नी पर 24 मिलीमीटर माइक्रोस्कोप स्लाइड द्वारा साफ 24 मिलीमीटर फैलाएं। फिर स्लाइड के ऊपरी और निचले किनारों पर डबल-साइडेड टेप स्ट्रिप्स संलग्न करें।

एक स्केलपेल के साथ प्रत्येक माइक्रोस्कोप स्लाइड को एक्साइज करें जैसे कि इसे एल्यूमीनियम पन्नी से हटाया जा सकता है। प्रत्येक स्लाइड में स्लाइड के ऊपरी और निचले किनारों से जुड़े डबल-साइडेड टेप की धारियां होनी चाहिए। फिर हाइड्रोफिलाइज्ड स्लाइड में दो डबल-साइडेड टेप स्ट्रिप्स के साथ स्लाइड को संलग्न करें।

यह छोटे और बड़े माइक्रोस्कोप स्लाइड्स के बीच एक प्रवाह पथ बनाएगा। ताजा extruded छोटे unilamellar vesicles, या एसयूवी, आवश्यक प्रतिक्रिया बफर में 0.4 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला। वैकल्पिक रूप से, पुटिका टूटने को बढ़ावा देने के लिए, पुटिका निलंबन में दो मिलीमोलर कैल्शियम क्लोराइड जोड़ें।

बड़े पैमाने पर फोटोमीटर चरण पर एक प्रवाह कक्ष माउंट करें। प्रवाह कक्ष में पुटिका निलंबन के 25 माइक्रोलीटर फ्लश करें और दो मिनट के लिए कक्ष को इनक्यूबेट करें, फिर हर बार प्रतिक्रिया बफर के 200 माइक्रोलीटर के साथ प्रवाह कक्ष के बार-बार धोने के माध्यम से अनफ्यूज्ड पुटिकाओं को हटा दें। एक बार जब लिपिड झिल्ली unfused vesicles से मुक्त है, नमूना कक्ष के लिए ब्याज के प्रोटीन के 50 microliters जोड़ें।

इसके बाद इमेजिंग शर्तों को सेट करें जैसे कि दृश्य के क्षेत्र का आकार, एक्सपोज़र समय, फ्रेम दर, और अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर में अधिग्रहण समय। फ़ोकस को स्वचालित रूप से समायोजित करें. यदि आवश्यक हो तो दृश्य के क्षेत्र को एक समरूप झिल्ली के साथ एक स्थिति में ले जाने के लिए पार्श्व नियंत्रण का उपयोग करें।

कोई प्रोजेक्ट फ़ोल्डर बनाएँ और चलचित्र रिकॉर्ड करना प्रारंभ करें. रिकॉर्डिंग के पूरा होने के बाद, अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर द्वारा प्रेरित संवाद में एक फ़ाइल नाम निर्दिष्ट करें. चलचित्र स्वचालित रूप से बाद के विश्लेषण के लिए एक MP फ़ाइल के रूप में प्रोजेक्ट फ़ोल्डर में सहेजा जाएगा।

रिकॉर्ड किए गए वीडियो का विश्लेषण करने के लिए, Jupyter नोटबुक ऐप लॉन्च करें। दिखाई देने वाली फ़ोल्डर सूची में, उस स्थान पर नेविगेट करें जहाँ MSPT विश्लेषण. IPY नोटबुक फ़ाइल संग्रहीत है और फ़ाइल पर क्लिक करें.

जुपीटर नोटबुक में, कोड को कोशिकाओं में व्यवस्थित किया जाता है और इसे चरण-दर-चरण निष्पादित किया जा सकता है। सेल के बगल में छोटे प्ले बटन पर क्लिक करें या एक सेल का चयन करें और सेल को निष्पादित करने के लिए Shift Enter दबाएं। विश्लेषण के लिए सभी आवश्यक पैकेज आयात करके प्रारंभ करें।

फ़ाइल प्रॉम्प्ट लॉन्च करने के लिए अगले कक्ष को निष्पादित करें. विश्लेषण करने के लिए एक या एकाधिक MP वीडियो फ़ाइलों वाला फ़ोल्डर चुनें और फ़ोल्डर का चयन करें दबाएँ. चुनी गई फ़ाइलों की एक सूची कक्ष के नीचे मुद्रित की जाती है.

पिक्सेल-वार पृष्ठभूमि अनुमान एल्गोरिथ्म के साथ प्रकाश के प्रमुख स्थैतिक प्रकीर्णन को हटाने के लिए, पैरामीटर मोड के लिए निरंतर माध्यिका विकल्प चुनें और स्लाइडिंग माध्यिका विंडो के लिए एक उपयुक्त लंबाई सेट करें। वैकल्पिक रूप से, कण का पता लगाने और प्रक्षेपवक्र जोड़ने के लिए उनका उपयोग करने के लिए save_processed_movies True सेट करके पृष्ठभूमि हटाने के बाद फिल्मों को सहेजें। CPU पर संसाधित करने के लिए समानांतर True और GPU False सेट करना सुनिश्चित करें या GPU पर संसाधित करने के लिए इसके विपरीत।

कणों और उनकी संबंधित स्थिति की पहचान की जाती है और पूरी फिल्म में स्थानीयकृत किया जाता है। एक थ्रेशोल्ड पैरामीटर के साथ कण का पता लगाने की संवेदनशीलता को ट्यून करें जिसका उपयोग छवि binarization द्वारा उम्मीदवार धब्बों को उजागर करने के लिए किया जाता है। मूवी विज़ुअलाइज़ेशन नामक एक अलग नोटबुक में स्पॉट डिटेक्शन संवेदनशीलता पर अलग-अलग थ्रेशोल्ड पैरामीटर के प्रभाव की जाँच करें.

ipy नोटबुक. फ़्रेम व्यूअर में चलचित्र लोड करने के बाद कण का पता लगाने की सीमा को समायोजित करने और एक उपयुक्त सेटिंग खोजने के लिए थ्रेशोल्ड स्लाइडर का उपयोग करें। अन्य नोटबुक पर वापस, पायथन पैकेज ट्रैक्पी का उपयोग करके प्रक्षेपवक्र में लगातार फ्रेम में कणों को जोड़ने के लिए तीन पैरामीटर चुनें।

अधिकतम अपेक्षित प्रसार गति के अनुसार एक फ्रेम से अगले तक कणों के अधिकतम विस्थापन को सेट करें। एक कण गायब हो सकता है और फिर से प्रकट हो सकता है, लेकिन अभी भी एक ही कण माना जा सकता है फ्रेम की अधिकतम संख्या का चयन करें। प्रसार गुणांक के अधिक मजबूत निर्धारण के लिए minimum_trajectory_length पैरामीटर का उपयोग करके बहुत कम बिंदुओं वाले प्रक्षेपवक्रों को हटाया जा सकता है।

इसे निष्पादित करके कक्ष में सभी पैरामीटर्स को ठीक करें. चुने गए पैरामीटर्स के साथ सभी चयनित वीडियो का विश्लेषण करने के लिए अगले कक्ष को निष्पादित करें. प्रत्येक संसाधन चरण के लिए प्रगति पट्टियाँ कक्ष के नीचे दिखाई देंगी.

वीडियो लंबाई, पैरामीटर सेटिंग्स और हार्डवेयर के आधार पर इसमें कुछ समय लग सकता है. अगले चरण में सॉफ्टवेयर पिछले अनुभाग में पाए जाने वाले प्रक्षेपवक्रों के लिए प्रसार गुणांक निर्धारित करता है, जो कूद दूरी वितरण और माध्य वर्ग विस्थापन विश्लेषण दोनों पर आधारित है। चलचित्र frame_rate और pixel_size निर्दिष्ट करके प्रारंभ करें.

सेल को निष्पादित करके उन्हें ठीक करें, फिर अगले सेल को चलाएं और ट्रैक्पी द्वारा उत्पन्न सभी सीएसवी फ़ाइलों वाली पैरेंट निर्देशिका का चयन करें। मिली CSV फ़ाइलों की एक सूची कक्ष के नीचे मुद्रित की जाती है. अगले कक्ष में HDF5 कंटेनर के लिए एक नाम चुनें जहाँ परिणाम संग्रहीत किए जाते हैं और इसे निष्पादित करते हैं.

अंत में प्रसार विश्लेषण करने के लिए सेल C.4 निष्पादित करें। सेल C.5 में द्रव्यमान अंशांकन लाइन पैरामीटर के विपरीत दर्ज करें, जिसका अर्थ है कि ज्ञात द्रव्यमान के नमूनों का उपयोग करके निर्धारित ढलान और ऑफसेट और सभी कण विरोधाभासों को आणविक द्रव्यमान में परिवर्तित करने के लिए इसे निष्पादित करें। सेल C.6 निष्पादित करके झिल्ली पर स्पष्ट कण घनत्व का मूल्यांकन करें, जो डेटा फ्रेम में अतिरिक्त स्तंभों के रूप में प्रत्येक फ्रेम के दौरान पता लगाए गए कणों और वर्तमान प्रक्षेपवक्रों के संदर्भ में माध्यिका घनत्व मान लौटाता है।

द्रव्यमान और प्रसार गुणांक के सहसंबंध के लिए अंतिम प्लॉट उत्पन्न करने के लिए, एक फ़ाइल प्रॉम्प्ट लोड करने के लिए सेल D.1 निष्पादित करें और MSPT परिणामों वाली HDF5 फ़ाइल निर्दिष्ट करें, फिर या तो सेल D.2 में प्लॉट करने के लिए एकल वीडियो से सेट किए गए डेटा का चयन करें या सेल D.3 को निष्पादित करके एकाधिक वीडियो से डेटा को एकल डेटा फ़्रेम में संयोजित करें। इस उदाहरण में, चूंकि सभी वीडियो समान नमूनों की प्रतिकृति हैं, इसलिए डेटा सेट पूल किया गया है। अंत में सेल D.4 निष्पादित करके 2D कर्नेल घनत्व प्लॉट।

यदि संतुष्ट हो, तो प्लॉट को कक्ष D.5 में एक PDF फ़ाइल में सहेजने और इसे निष्पादित करने के लिए एक स्थान निर्दिष्ट करें. एक समर्थित लिपिड बाईलेयर के गठन के दौरान एक ग्लास कवर स्लाइड की सतह खुरदरापन की प्रतिनिधि छवियां, एक बरकरार समर्थित लिपिड बाईलेयर के साथ, और एक एसएलबी पर पुनर्गठित अनुकरणीय प्रोटीन की यहां दिखाई गई हैं। सभी चार उदाहरण मूल मोड में प्रदर्शित होते हैं, जिन्हें माप के दौरान ही एक्सेस किया जा सकता है, और माध्य-आधारित पृष्ठभूमि हटाने के बाद संसाधित रेशियोमेट्रिक छवियों के रूप में।

एक अंशांकन जो आणविक द्रव्यमान में इसके विपरीत अनुवाद करता है, उसे बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स के माध्यम से एसएलबी में ज्ञात द्रव्यमान के बायोमोलेक्यूल्स को जोड़कर प्राप्त किया जा सकता है। एक अनुकरणीय रणनीति के रूप में, कोई भी गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन, प्रोटीन ए, क्षारीय फॉस्फेट और फाइब्रोनेक्टिन के बायोटिनिलेटेड वेरिएंट का उपयोग कर सकता है जो स्ट्रेप्टाविडिन से बंधते हैं जो स्वयं झिल्ली में बायोटिन युक्त लिपिड के लिए बाध्य हैं। इन अनुकरणीय मैक्रोमोलेक्यूल्स के तेजी से स्पष्ट विपरीत संबंधित बायोटिनिलेटेड मानकों के बढ़ते आणविक वजन को दर्शाता है।

मानक प्रोटीन के ओलिगोमर राज्य के संबंधित द्रव्यमान के लिए विपरीत हिस्टोग्राम के प्रत्येक शिखर को असाइन करके, इसके विपरीत और द्रव्यमान के बीच एक रैखिक संबंध का पता चला है और बाद में अज्ञात मैक्रोमोलेक्यूल सिस्टम के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है। बायोटिनिलेटेड एल्डोलेज़ के साथ जटिल में या बायोटिन-संशोधित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी एंटीबॉडी के साथ जटिल में टेट्रावैलेंट स्ट्रेप्टाविडिन के द्रव्यमान और प्रसार गुणांक दोनों के 2 डी कर्नेल घनत्व अनुमान यहां दिखाए गए हैं। प्रतिनिधि छवियां बायोटिन-संशोधित एल्डोलेज़ या आईजीजी और अपेक्षित आणविक भार के साथ टेट्रावैलेंट स्ट्रेप्टाविडिन के परिसर के लिए निर्धारित ओलिगोमर द्रव्यमान की तुलना दिखाती हैं।

MSPT के साथ, हम लिपिड झिल्ली पर सीधे बायोमोलेक्यूल्स को ट्रैक कर सकते हैं, यह निर्धारित कर सकते हैं कि उनके पास कौन सा द्रव्यमान है, वे कैसे चलते हैं, और वे कैसे बातचीत करते हैं। मुझे विश्वास है कि यह तकनीक झिल्ली पर और उसके साथ जैविक प्रक्रियाओं की हमारी समझ को बदल देगी।