Name: a nonsequencing approach for the rapid detection of rna editing
Uploaded: 2022-04-21T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل منحة معونة للبحث العلمي من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (17H02204 و 18K19288). تم دعم روتشيكا ماليا من قبل الحكومة اليابانية (منحة MEXT). نشكر السيدة راديكا بياني (مختبر تاكاغي، JAIST) والدكتورة كيرتي شارما (شركة BioSeeds Corporation) على المساعدة في التجارب المتعلقة بالرحلان الكهربائي.

1. تحسين الجزء المستهدف
ملاحظة: تم استخدام أربعة جينات معدلة في تطوير هذا البروتوكول ، بما في ذلك جينان نوويان (AT2G16586 و AT5G02670) من A. thaliana ، والجينات المشفرة بروتين الفلورسنت الأزرق (BFP) وبروتين الفلورسنت الأخضر المحسن (EGFP) المعبر عنه في خلايا HEK293.
<ol><li>لتحديد شظايا ...

<ol>
	<li>Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+high-throughput+method+for+the+detection+and+quantification+of+RNA+editing+based+on+high-resolution+melting+of+amplicons.">A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons.</a> Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+real-time+PCR+method+for+the+quantitative+analysis+of+RNA+editing+at+specific+sites.">A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites.</a> Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).</li><li>Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+RNA+editing:+a+molecular+analysis+of+GluR2,+GluR5+and+GluR6+in+human+brain+tissues+and+in+NT2+cells+following+in+vitro+neural+differentiation.">Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation.</a> Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).</li><li>Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-processing+events+in+mRNAs+identified+by+DHPLC+analysis.">Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis.</a> Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).</li><li>Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+method+to+detect+RNA+editing+events.">A Quantitative method to detect RNA editing events.</a> Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).</li><li>Burns, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+serotonin-2C+receptor+G-protein+coupling+by+RNA+editing.">Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing.</a> Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).</li><li>Marian, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bottleneck+in+genetic+testing.">The bottleneck in genetic testing.</a> Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).</li><li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+biology:+Not+drowning+but+waving.">Genome biology: Not drowning but waving.</a> Cell. 154 (5), 951-952 (2013).</li><li>Jones, B. M., Knapp, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+temperature+gradient+electrophoresis+for+detection+of+single+nucleotide+polymorphisms.">Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms.</a> Methods in Molecular Biology. 578, 153-165 (2009).</li><li>Riesner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-gradient+gel+electrophoresis+of+nucleic+acids:+analysis+of+conformational+transitions,+sequence+variations,+and+protein-nucleic+acid+interactions.">Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions.</a> Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).</li><li>Biyani, M., Nishigaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hundred-fold+productivity+of+genome+analysis+by+introduction+of+micro-temperature+gradient+gel+electrophoresis.">Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).</li><li>Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palm-size+and+one-inch+gel+electrophoretic+device+for+reliable+and+field-applicable+analysis+of+recombinase+polymerase+amplification.">Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification.</a> Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).</li><li>Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=uMELT:+prediction+of+high-resolution+melting+curves+and+dynamic+melting+profiles+of+PCR+products+in+a+rich+web+application.">uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application.</a> Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+using+TRIzol+(TRI+Reagent).">Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li><li>Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+editing+of+BFP,+a+point+mutant+of+GFP,+using+artificial+APOBEC1+deaminase+to+restore+the+genetic+code.">RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code.</a> Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).</li><li>Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+activity+of+adenosine+deaminase+acting+on+RNA+(ADARs)+isoforms+for+correction+of+genetic+code+in+gene+therapy.">Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).</li><li>Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+U-To-C+RNA+editing+events+for+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana.">Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Cells. 10 (3), 635 (2021).</li><li>Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U-to-C+RNA+editing+affects+the+mRNA+stability+of+nuclear+genes+in+Arabidopsis+thaliana.">The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).</li></ol>

يلعب تحرير الحمض النووي الريبي دورا مهما في علم الأحياء. ومع ذلك ، فإن الطرق الحالية للكشف عن تحرير الحمض النووي الريبي ، مثل الكروماتوغرافيا والتسلسل ، تمثل العديد من التحديات بسبب تكلفتها العالية ، ومتطلبات الوقت المفرطة ، والتعقيد. البروتوكول الموضح هنا هو طريقة بسيطة وسريعة وفعالة من...

يمكن أن تشير متغيرات النوكليوتيدات المفردة (SNVs) في الحمض النووي الريبي الجينومي ، بما في ذلك متغيرات A-to-I و C-to-U و U-to-C ، إلى أحداث تحرير الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، فإن اكتشاف SNVs في الحمض النووي الريبي لا يزال مهمة صعبة تقنيا. تقليديا ، يتم تحديد نسبة الحمض النووي الريبي المحرر إلى الحمض النووي الريبي غير المعدل عن طريق التسلسل المباشر ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (PCR) الخاص بالأليل ،أو تغيير طبيعة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) إلى 1،2،3،4،5،6. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب ليست فعالة من حيث الوقت أو التكلفة بشكل خاص ، ودقتها المنخفضة ، الناجمة عن ارتفاع مستويات الضوضاء ، تشكل اختناقات تكنولوجية للكشف عن SNV القائم على الحمض النووي الريبي 7,8. هنا ، نصف بروتوكولا يعتمد على الرحلان الكهربائي الهلامي المتدرج في درجة الحرارة (TGGE) لتحديد تعدد أشكال النيوكليوتيدات المفردة (SNPs) كطريقة بديلة تلغي الحاجة إلى نهج تسلسل الحمض النووي الريبي المباشرة لتحليلات تحرير الحمض النووي الريبي.
الرحلان الكهربائي هو الطريقة المفضلة لفصل وتحليل الجزيئات الحيوية في مختبرات علوم الحياة. يتيح TGGE فصل شظايا الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل والتي هي بنفس الحجم ولكن لها تسلسلات مختلفة. تعتمد هذه التقنية على الاختلافات المرتبطة بالتسلسل في درجات حرارة انصهار شظايا الحمض النووي والتغيرات اللاحقة في تحركاتها في المواد الهلامية المسامية مع تدرج درجة حرارة خطي 9,10. ذوبان شظايا الحمض النووي يولد ملامح ذوبان محددة. بمجرد أن يصل المجال ذو أدنى درجة حرارة انصهار إلى درجة الحرارة المقابلة في موضع معين في الجل ، يحدث الانتقال من بنية حلزونية إلى بنية مذابة جزئيا ، وسيتوقف ترحيل الجزيء عمليا. لذلك ، يستخدم TGGE كلا من التنقل (معلومات الحجم) والتحولات الهيكلية الناجمة عن درجة الحرارة لشظايا الحمض النووي (المعلومات المعتمدة على التسلسل) ، مما يجعلها نهجا قويا لتوصيف شظايا الحمض النووي. نقاط السمة في نمط انصهار TGGE ، والتي تتوافق مع ثلاثة تحولات هيكلية لجزيء الحمض النووي ، هي نقطة التفكك الأولي للحبلا ، ونقطة التفكك منتصف الخيط ، ونقطة التفكك النهائية للحبلا (الشكل 1). تؤثر اختلافات التسلسل داخل المجالات ، حتى الاختلافات أحادية القاعدة ، على درجة حرارة الانصهار ، وبالتالي ، فإن الجزيئات ذات التسلسلات المختلفة ستظهر أنماط ذوبان منفصلة (تمسخ) في تحليلات TGGE. لذلك ، يمكن استخدام TGGE لتحليل SNVs في الحمض النووي الريبي الجينومي ويمكن أن يكون طريقة عالية الإنتاجية لا تقدر بثمن للكشف عن تحرير الحمض النووي الريبي. يتم فقدان هذا الكسب عالي الإنتاجية عند استخدام TGGE التقليدي القائم على الرحلان الكهربائي الهلامي. ومع ذلك ، يمكن استخدام نسخة مصغرة من TGGE ، تسمى microTGGE (μTGGE) ، لتقصير الوقت الكهربائي الهلامي وتسريع التحليل مع زيادة 100 ضعف في الإنتاجية11. تم تحسين بساطة واكتناز طريقة μTGGE من خلال إدخال PalmPAGE12 ، وهو نظام هرهلام كهربائي قابل للتطبيق في الميدان ومحمولة باليد وبأسعار معقولة.
هنا ، يتم استخدام بروتوكول جديد قائم على TGGE لفحص ثلاثة أنواع من مواقع تحرير الحمض النووي الريبي (A-to-I و C-to-U و U-to-C) في أربعة جينات ، بما في ذلك اثنان من أنسجة Arabidopsis thaliana واثنان معبرا عنهما في خلايا HEK293 الثديية (الشكل 1A). يدمج البروتوكول استخدام PalmPAGE (الأجهزة) ، وهو نظام محمول للكشف السريع عن تحرير الحمض النووي الريبي ، و uMelt (برنامج)13. مع متوسط وقت تشغيل يتراوح بين 15 و 30 دقيقة ، يتيح هذا البروتوكول التعرف السريع والموثوق والسهل على تحرير الحمض النووي الريبي دون الحاجة إلى نهج تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2U ExoI</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2650A</td>
			<td>Exonuclease I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1)</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>AM9022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Mini spin</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5452000034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath/ block heater</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Taq Polymerase Master mixture</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LATaq DNA polymerase</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>RR002A</td>
			<td>Taq Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-TGGE&#160; cassette holder</td>
			<td>BioSeeds Corp.</td>
			<td>BS-GE-CH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-TGGE apparatus</td>
			<td>Lifetech Corp.</td>
			<td>TG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-TGGE gel cassette</td>
			<td>BioSeeds Corp.</td>
			<td>BS-TGGE-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant Rneasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTra Ace Master Mix</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>TRT101</td>
			<td>M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2660B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>Thermo fisher</td>
			<td>B52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea, Nuclease and protease tested</td>
			<td>Nacalai tesque</td>
			<td>35940-65</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nonsequencing approach for the rapid detection of rna editing

تحرير الحمض النووي الريبي هو عملية تؤدي إلى تغييرات تسلسل ما بعد النسخ في الحمض النووي الريبي. يعتمد الكشف عن تحرير الحمض النووي الريبي وتحديده كميا بشكل أساسي على تقنيات تسلسل Sanger وتسلسل الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه الطرق مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام نظام الرحلان الكهربائي الهلامي المتدرج في درجة الحرارة الدقيقة المحمول (μTGGE) كنهج غير تسلسلي للكشف السريع عن تحرير الحمض النووي الريبي. وتستند العملية إلى مبدأ الرحلان الكهربائي، الذي يستخدم درجات حرارة عالية لتشويه عينات الأحماض النووية أثناء تحركها عبر هلام بولي أكريلاميد. عبر مجموعة من درجات الحرارة ، تشكل شظية الحمض النووي تدرجا من الحمض النووي المزدوج بالكامل إلى خيوط منفصلة جزئيا ثم إلى حمض نووي منفصل تماما. تنتج المواقع التي تم تحريرها بواسطة الحمض النووي الريبي مع قواعد النيوكليوتيدات المتميزة ملفات تعريف ذوبان مختلفة في تحليلات μTGGE. استخدمنا النهج القائم على μTGGE لتوصيف الاختلافات بين ملفات تعريف الذوبان لأربعة أجزاء من الحمض النووي الريبي المحررة والأجزاء المقابلة غير المحررة (من النوع البري). تم حساب درجات تشابه النمط (PaSSs) من خلال مقارنة أنماط النطاق التي تنتجها الحمض النووي الريبي المحرر وغير المحرر وتم استخدامها لتقييم قابلية تكرار الطريقة. بشكل عام ، تتيح المنصة الموضحة هنا اكتشاف طفرات قاعدة واحدة في الحمض النووي الريبي بطريقة مباشرة وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة. ومن المتوقع أن تساعد أداة التحليل هذه في التوصل إلى نتائج جديدة في البيولوجيا الجزيئية.

استخدام μTGGE لتحديد تغيرات قاعدة النيوكليوتيدات المفردة في أحداث تحرير الحمض النووي الريبي تم استخدام أربعة جينات معدلة لهذا البروتوكول (الجدول 1) ، بما في ذلك جين BFP المنتج في خلايا HEK293 (مع تحرير الحمض النووي الريبي C-to-U بواسطة إنزيمات deaminase من مركب تحرير البروتين الشحمي...

Watch this Scientific Journal Video about A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing at JoVE.com

A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing

لا يزال الكشف السريع والقياس الكمي الموثوق به لأحداث تحرير الحمض النووي الريبي على نطاق الجينوم أمرا صعبا ويعتمدان حاليا على طرق تسلسل الحمض النووي الريبي المباشرة. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا الرحلان الكهربائي الهلامي المتدرج في درجة الحرارة الدقيقة (μTGGE) كطريقة بسيطة وسريعة ومحمولة للكشف عن تحرير الحمض النووي الريبي.

نهج غير تسلسلي للكشف السريع عن تحرير الحمض النووي الريبي

RNA editing is a process that leads to posttranscriptional sequence alterations in RNAs. Detection and quantification of RNA editing rely mainly on Sanger ...

يلعب تحرير الحمض النووي الريبي دورا حاسما في الأمراض البشرية. العلماء يجدون تطبيقا لا نهاية له في الأدوية. يوضح هذا البروتوكول تطبيق تقنية الرحلان الكهربائي لدرجة الحرارة المحمولة كنهج غير تسلسلي لتحديد سريع وموثوق به لتعديل الحمض النووي الريبي في تحرير الحمض النووي الريبي دون الحاجة إلى تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر.تم استخدام النهج القائم على الرحلان الكهربائي tTG الصغير لتوصيف الاختلافات بين ملف تعريف الذوبان لأربعة أجزاء من الحمض النووي الريبي المحررة والشظايا المقابلة غير المحررة. تم استخدام درجات تشابه النمط لتقييم قابلية تكرار الطريقة. تمكن هذه المنصة من اكتشاف حتى الاستبدال القائم على أساس واحد في الحمض النووي الريبي ، بطريقة مباشرة وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة.ومن المتوقع أن تساعد هذه الأداة التحليلية في التوصل إلى نتائج جديدة في البيولوجيا الجزيئية Begin من خلال تحديد شظايا الجينات مع ملامح ذوبان مختلفة وتوليد منحنيات الانصهار المتوقعة باستخدام أداة Umelt HETS المستندة إلى الويب. صمم ثلاثة أزواج من 300 إلى 324 شظايا جينية للزوج الأساسي لكل جين مستهدف. حدد الزوج غير المحرر أو المحرر الذي يوضح الفرق الأقصى بين مناطق الانصهار على محور الهيلية لمزيد من التحليل.لتحليل micro-TGGE ، قم بتوليف الجزء الجيني المحدد عن طريق تضخيم PCR. صمم الاشعال الأمامي والخلفي باستخدام برنامج دينامو الحمض النووي، وتحقق من تسلسل التمهيدي باستخدام أداة NCBI Primer-BLAST. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من مصدر الجينات المحررة وغير المحررة باستخدام الطرق القياسية.توليف cDNA المقابل ، وإعداد 20 ميكرولتر من خليط تفاعل PCR ، وإعداد PCR كما هو موضح في مخطوطة النص. ثم ، امزج ستة ميكرولترات من منتج PCR مع ثلاثة ميكرولترات من صبغة تحميل هلام 6x في أنبوب سعة 250 ميكرولتر ، وشكل الحجم الإجمالي إلى 12 ميكرولتر بالماء المعقم. قم بتخزين منتج PCR عند 25 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.لتجميع أشرطة الجل ، قم بشطيرة لوحة الجل العلوية بين اللوحتين الأخريين في حامل كاسيت الجل لبلمرة الهلام. لتحضير جل بولي أكريلاميد ، أضف 7.2 جرام من اليوريا إلى أنبوب 50 ملليلتر وتذوب في 10 ملليلتر من الماء المعقم. سخني العينة في الميكروويف لمدة 20 إلى 30 ثانية.واتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. أضف ثلاثة ملليلترات من 5x TBE buffer ، و 2.25 ملليلتر من مكرر الأكريلاميد ، و 75 ميكرولتر من 10x بيرسلفات الأمونيوم ، و 15 ميكرولتر من TEMED إلى المحلول. صب محلول الجل في حامل كاسيت الجل ببطء بزاوية مائلة لتجنب فقاعات الهواء.بعد حوالي 30 دقيقة ، قم بتفكيك أشرطة الجل وتنظيفها. استخدم جهاز micro-TGGE مع مجموعة تدرج درجة الحرارة عموديا على اتجاه هجرة الحمض النووي. انقع منصات العازلة للرحلان الكهربائي العلوية والسفلية في ملليلترين من المخزن المؤقت 1x TBE.ضع كاسيت الجل في وحدة غرفة الرحلان الكهربائي الأفقي ، وضع منصات التخزين المؤقت العلوية والسفلية. ثم قم بتحميل 10 ميكرولترات من منتج PCR في البئر الأوسط ، وميكرولتر واحد من منتج PCR في كل جانب جيدا. انتظر لمدة دقيقة ، وقم بتوصيل وحدة الطاقة وقم بتزويد 100 فولت لمدة 12 دقيقة عند تدرج درجة حرارة خطي من 15 إلى 65 درجة مئوية.بعد اكتمال التشغيل. أخرج الكاسيت وأزل الغطاء الزجاجي العلوي. صب 300 ميكرولتر من 10x صبغة SYBR Gold على الجل.تصور ملامح الذوبان باستخدام مصباح LED الأزرق المثبت في الجهاز الكهربائي بحجم راحة اليد. كرر كل تجربة كهروبلوريتية ثلاث مرات لتأكيد قابلية البيانات للتكرار. قم بتنزيل برنامج محلل micro-TGGE وفتحه.افتح ملف JPEG الذي يحتوي على صورة الجل. انقر فوق الزر "الإطار" وحدد الإطار المناسب لصورة الهلام. انقر على زر تصحيح الإحداثيات "وأضف نقطتين مرجعيتين.انقر على إضافة نقاط الميزة"زر وإضافة نقاط عينة. ثم احفظ بيانات صورة الجل المعالجة بتنسيق micro-TGGE. انقر على زر العينة وحدد خيار البحث عن نقاط بسيطة لمقارنة صورتين أو أكثر.بالنسبة لنوع تحرير الحمض النووي الريبي C-to-U، أظهرت العينة غير المحررة مع cBase الأصلي نمط انصهار أطول عند نقطة انصهار نهاية الخيط من العينة المحررة باستخدام قاعدة U المعدلة. بالنسبة لنوع تحرير الحمض النووي الريبي من A إلى I، عرضت العينة التي تم تحريرها باستخدام قاعدة G المعدلة نمط انصهار أطول عند نقطة انصهار نهاية الخيط مقارنة بالعينة غير المحررة باستخدام القاعدة A الأصلية. بالنسبة لنوع تحرير الحمض النووي الريبي العكسي من U-to-C ، أظهرت العينة المعدلة في الجين الأول مع قاعدة C المعدلة نمط انصهار أطول بين نقطتي الانصهار الأولية والنهائية للخيط مقارنة بالعينة غير المحررة مع قاعدة U الأصلية.ومع ذلك ، لم يلاحظ نمط مماثل للجين الآخر. كانت درجات تشابه النمط لأنواع تحرير الحمض النووي الريبي من C-to-You و A-to-I أقل من تلك الموجودة في نوعي تحرير الحمض النووي الريبي U-to-C. من المحتمل أن يكون هذا الاختلاف مرتبطا بالمواقع المعنية لمواقع التحرير.أظهر تحليل uMelt HETS أن تعديل C-to-U سيحول منحنى الانصهار إلى اليسار على طول محور درجة الحرارة. كانت درجات تشابه النمط المحسوبة من تحليلات micro-TGGE للأجزاء غير المحررة والأجزاء الثلاثة المحررة متسقة مع النتائج المتوقعة باستخدام uMelt. يعد تحسين جزء الجين المستهدف أمرا بالغ الأهمية للتمييز الواضح بين السبب المحرر وغير المحرر.وقد تم تبسيط هذه العملية في البروتوكول الحالي.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

اكتشاف الجزيئية البيولوجية توظيف الانعكاس التداخل التصوير الاستشعار (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

تصنيع أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية الدنا للكشف Reagentless من الأحماض النووية والبروتينات والجزيئات الصغيرة

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

أ ف التوحد لجنة المساواة العرقية ، السلمون المدخن النهج للكشف عن خلية الانصهار في فيفو</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

كشف البكتيرية والاستدلال باستخدام مجسات الكهروكيميائية

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

الوقت الفاصل بين التصوير الإسفار من نمو الجذور Arabidopsis مع التلاعب السريع للبيئة الجذر باستخدام RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

الجلد الوشم ونهجا جديدا للتسليم اللقاحات DNA

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

توصيف النظم المعقدة باستخدام تصميم التجارب النهج: عابر التعبير البروتين في التبغ كدراسة حالة

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Nanomanipulation من واحدة RNA الجزيئات بواسطة الملقط البصرية

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

مضان غشاء حيوي قوة دقق: الكميات المتزامنة من حركية مستقبلات يجند والتي يسببها ملزم بين الخلايا اشارة على خلية واحدة

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Rapid Mix Preparation of Bioinspired Nanoscale Hydroxyapatite for Biomedical Applications

تحضير مزيج سريع من Bioinspired النانو هيدروكسيباتيت للتطبيقات الطبية الحيوية

Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a medical ceramic due to its good biocompatibility and osteoconductivity. Recently there has been interest ...