Name: mycorrhizal maps as a tool to explore colonization patterns and fungal strategies in the roots of festuca rubra and zea mays
Uploaded: 2022-08-26T13:00:00
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Questo articolo utilizza i dati risultanti da due studi di dottorato nell'area tematica "Corn Mycorrhizal Patterns Driven by Agronomic Inputs", condotto da Victoria Pop-Moldovan, e "Mycorrhizal Status and Development of Colonization in Mountain Grassland Dominant Species", condotto da Larisa Corcoz, sotto il coordinamento della Prof. Dr. Roxana Vidican.

1. Selezione del materiale biologico, campionamento delle radici e conservazione
<ol><li>Raccogliere l'intera radice delle piante con una pala (Figura 1A) separatamente per ciascuna variante e replicare. Rimuovere delicatamente, a mano, i grandi aggregati di terreno dalle radici. Lavare l'intero apparato radicale e misurarlo su una bilancia con celle di 1 cm x 1 cm (Figura 1B). Tagliare le radici separatamente per ogni pianta e metterle in un ...

<ol>
	<li>Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-microbiome+interactions:+From+community+assembly+to+plant+health.">Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (11), 607-621 (2020).</li><li>Jeffries, P., Barea, J. M., Hock, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4+Arbuscular+Mycorrhiza:+A+Key+Component+of+Sustainable+Plant-Soil+Ecosystems.">4 Arbuscular Mycorrhiza: A Key Component of Sustainable Plant-Soil Ecosystems.</a> The Mycota. 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Agriculture. 66 (1), 2009 (2009).</li><li>Prates J&#250;nior, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroecological+coffee+management+increases+arbuscular+mycorrhizal+fungi+diversity.">Agroecological coffee management increases arbuscular mycorrhizal fungi diversity.</a> PLoS One. 14 (1), 0209093 (2019).</li><li>Rillig, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+farmers+should+manage+the+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">Why farmers should manage the arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> New Phytologist. 222 (3), 1171-1175 (2019).</li><li>Rillig, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+integrated+mycorrhizal+technology:+Harnessing+mycorrhiza+for+sustainable+intensification+in+agriculture.">Towards an integrated mycorrhizal technology: Harnessing mycorrhiza for sustainable intensification in agriculture.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1625 (2016).</li><li>Bhale, U. N., Bansode, S. A., Singh, S., Gehlot, P., Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifactorial+Role+of+Arbuscular+Mycorrhizae+in+Agroecosystem.">Multifactorial Role of Arbuscular Mycorrhizae in Agroecosystem.</a> Fungi and their Role in Sustainable Development: Current Perspectives. , 205-220 (2018).</li><li>Khaliq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+control+of+dry+root+rot+of+chickpea+caused+by+Rhizoctonia+bataticola+under+the+natural+field+condition.">Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition.</a> Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).</li><li>Vaida, I., P&#259;curar, F., Rotar, I., Tomo&#537;, L., Stoian, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+diversity+due+to+long-term+management+in+a+high+natural+value+grassland.">Changes in diversity due to long-term management in a high natural value grassland.</a> Plants. 10 (4), 739 (2021).</li><li>. The International Collection of (Vesicular) Arbuscular Mycorrhizal Fungi Available from: <a target="_blank" href="https://invam.wvu.edu/collection">https://invam.wvu.edu/collection</a> (2022)</li><li>. The International Bank for the Glomeromycota Available from: <a target="_blank" href="https://www.i-beg.eu/">https://www.i-beg.eu/</a> (2022)</li></ol>

Gli studi sulla colonizzazione micorrizica sono vitali per lo sviluppo di nuove strategie in campo agronomico. Il potenziale di più piante coltivate di formare un'associazione simbiotica con le micorrize arbuscolari le ha rese una componente importante dello sviluppo sostenibile dell'agroecosistema e del mantenimento della sua salute 16,17,18,19,20. Pertanto,...

I funghi micorrize arbuscolari (AM) sono una categoria di endofiti del suolo che sono costantemente un'area di interesse per i ricercatori. La loro presenza nelle radici della maggior parte delle piante e il loro coinvolgimento nei cicli dei nutrienti le rende componenti vitali per la stabilità di ogni ecosistema in cui sono presenti piante erbacee 1,2. Attraverso il loro micelio extra-radicolare, AM agisce come un'estensione fungina per le radici delle piante, specialmente nelle aree difficili da raggiungere3. L'attività principale è nelle radici delle piante ospiti, dove AM sviluppa grandi reti ife e specifiche strutture intracellulari chiamate arbuscoli. La mancanza di specificità dell'ospite consente al simbionte di colonizzare più specie contemporaneamente. Questa capacità fornisce all'AM il ruolo dell'allocazione delle risorse e della regolazione dei nutrienti nell'ecosistema; Il fungo fornisce anche supporto nella sopravvivenza delle piante e aiuta nelle prestazioni della pianta 4,5,6,7. La reazione delle specie AM alle radici ospiti è visibile nell'estensione e nella posizione del micelio intra-radicolare e nella presenza e nella forma degli arbuscoli sviluppati intracellulari. Gli arbuscoli intracellulari fungono da punto di interscambio tra i due simbionti e rappresentano aree caratterizzate da processi di trasferimento rapidi. Le strutture che l'AM produce sono specie-dipendenti e, oltre agli arbuscoli, nelle radici, sviluppano anche vescicole, spore e cellule ausiliarie.
Ci sono molte sfide nella valutazione dei simbionti AM nelle radici delle piante 8,9. Il primo è il loro costante sviluppo durante l'intero periodo vegetativo degli ospiti, che porta a molteplici cambiamenti nella struttura arbuscolare ifale. I diversi stadi di crescita arbuscolare, fino al loro collasso, sono chiaramente presenti nelle radici, ma le strutture senescenti AM sono talvolta digerite, il che le rende solo parzialmente visibili10. La seconda sfida è rappresentata dal metodo e dal protocollo di colorazione, dalla grande diversità dei sistemi radicali, dalla dimensione delle loro cellule e dalle differenze di spessore, che rendono difficile proporre un metodo unificato. L'ultima sfida è rappresentata dalla valutazione e dal punteggio della colonizzazione AM. Esistono numerosi metodi che valutano AM con diversi gradi di obiettività e la maggior parte di essi sono ancora limitati alle tecniche di microscopia. Quelli semplici si basano sulla presenza/assenza di strutture nella corteccia radicolare, mentre quelli più complessi si basano sul visual scoring e sull'uso di classi di colonizzazione, con l'integrazione della frequenza e dell'intensità del fenomeno di colonizzazione. Negli ultimi decenni sono stati prodotti molti dati sullo stato micorrizico di più specie, ma la maggior parte dei metodi sono limitati al valore osservato della colonizzazione senza indicare la posizione reale di ciascuna struttura nella corteccia radicale. Come risposta alla necessità di risultati più accurati sulla colonizzazione AM, è stato sviluppato un metodo basato sull'analisi microscopica dei pattern micorrizici (MycoPatt) nelle radici per assemblare, in forma digitale, le mappe micorriziche dettagliate11. Inoltre, il metodo consente il calcolo oggettivo dei parametri di colonizzazione e la determinazione della posizione effettiva di ciascuna struttura nella radice.
La posizione delle strutture fungine AM può essere importante per rispondere alle seguenti due domande. Il primo è legato all'analisi della colonizzazione in un momento specifico dal ciclo vegetativo di una pianta. In questo contesto, è molto utile osservare l'abbondanza arbuscolare / vescicolare, segnalare come si trovano nella radice e fornire un'immagine e parametri di colonizzazione molto chiari. Il secondo è legato al rilevamento della strategia fungina e al suo orientamento e persino alla previsione del suo sviluppo futuro. Un'applicazione del MycoPatt può essere per le piante analizzate quotidianamente, ogni 2-3 giorni, settimanalmente o durante varie fasi di crescita. In questo contesto, la posizione delle vescicole/arbuscole è importante per comprendere meglio il meccanismo biologico della colonizzazione AM. Questi parametri e osservazioni sono molto utili per integrare i parametri matematici.
Lo scopo di questo articolo è dimostrare la capacità del sistema MycoPatt di esplorare il potenziale e la strategia di colonizzazione dei funghi AM nativi nelle radici di Zea mays (mais) durante le diverse fasi di sviluppo e nelle radici di Festuca rubra (festuca rossa) in diverse condizioni di fecondazione a lungo termine. Per raggiungere l'obiettivo, sono stati analizzati due grandi database di due esperimenti. L'esperimento del mais fu stabilito a Cojocna (46°44′56" lat. N e 23°50′0" di lunghezza. E), nella Fattoria Didattica Sperimentale dell'Università di Scienze Agrarie e Medicina Veterinaria Cluj su un feoziom con un terreno a tessitura argillosa12. L'esperimento della festuca rossa fa parte di un più ampio sito sperimentale istituito nel 2001 a Ghețari, sui Monti Apuseni (46°49'064" lat. N e 22°81'418'' di lunghezza. E), su terreno preluvosol (terra rossa) tipo13,14. Il mais è stato raccolto in cinque diverse fenofasi di crescita12: B1 = 2-4 foglie (come punto di controllo per l'inizio della colonizzazione micorrizica); B2 = 6 foglie; B3 = 8-10 foglie; B4 = formazione di pannocchie; B5 = maturità fisiologica. A partire dalla fase di 2-4 foglie (A0), è stato applicato un trattamento organico, che ha portato a un fattore di due graduazioni (A1 = controllo e A2 = trattato). Le radici della festuca rossa sono state raccolte alla fioritura da un esperimento con cinque concimazioni a lungo termine13,14: V1 = controllo, non fecondato; V2 = 10 t·ha-1 letame; V3 = 10 t·ha-1 letame + N 50 kg·ha-1, P 2 O5 25 kg·ha-1, K2O 25 kg·ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1; V5 = 10 t·ha-1 letame + N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1. Cinque piante sono state raccolte in ogni fase di sviluppo da ogni variante di fertilizzazione. Sono stati analizzati i protocolli di colorazione e le loro prestazioni in termini di tempo di elaborazione del campione e qualità della colorazione. La relazione tra lo sviluppo delle ife AM e la presenza delle sue strutture nelle radici è stata analizzata separatamente per ciascuna specie ed è proseguita con l'identificazione delle radici più permissive per la colonizzazione. I modelli di colonizzazione specifici di ciascun sistema di root sono stati analizzati in base alle mappe di colonizzazione e al valore dei parametri AM.
Il mais è una pianta annuale, che implica una crescita continua delle radici, e questa è stata la ragione principale per applicare il MycoPatt nelle fasi di crescita. La festuca rossa è una pianta perenne proveniente da una prateria trattata a lungo con diversi fertilizzanti. Le sue radici hanno uno sviluppo più breve di 1 anno e l'antesi è considerata come il punto di vegetazione quando la pianta cambia il suo metabolismo da vegetativo a generativo. Per catturare queste piante durante questi intensi periodi di attività, sono stati scelti i punti temporali sopra menzionati. Il campionamento durante il periodo vegetativo è difficile per questa specie se coltivata in praterie naturali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Apple vinegar 5%</td>
			<td>FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.</td>
			<td>O&#538;ET DE MERE</td>
			<td>https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Ink</td>
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			<td>4001</td>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
			<td>Glass jar 47 mL</td>
			<td>Indigo Cards</td>
			<td>BORCAN 47 ML HEXAGONAL</td>
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		</tr>
		<tr>
			<td>Laminating Pouches</td>
			<td>Peach</td>
			<td>PP525-08</td>
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		</tr>
		<tr>
			<td>Microflow Class II ABS Cabinet</td>
			<td>Bioquell UK Ltd</td>
			<td>Microflow Class II ABS Cabinet</td>
			<td>http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D100001</td>
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			YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ 
			hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb 
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		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office 365</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Office 365</td>
			<td>Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Oltchim</td>
			<td>01-2119457892-27-0065</td>
			<td>http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
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			<td>816780637</td>
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			AAYhwhxuXHWZcw4hlR 
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			wQAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optika camera</td>
			<td>OPTIKA</td>
			<td>CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0</td>
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		</tr>
		<tr>
			<td>Optika Microscope</td>
			<td>OPTIKA</td>
			<td>B383pL</td>
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		</tr>
		<tr>
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			<td>Hermes Gift</td>
			<td>HERMES000100</td>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
			<td>White wine vinegar 9%</td>
			<td>FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.</td>
			<td>O&#538;ET DE VIN ALB</td>
			<td>https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mycorrhizal maps as a tool to explore colonization patterns and fungal strategies in the roots of festuca rubra and zea mays

I funghi micorrizici arbuscolari sono simbionti nelle radici delle piante. Il loro ruolo è quello di sostenere lo sviluppo dell'ospite e mantenere l'equilibrio nutrizionale negli ecosistemi. Il processo di colonizzazione dipende da diversi fattori come l'ecologia del suolo, la diversità genetica dei funghi e dell'ospite e le pratiche agronomiche. La loro azione sincronizzata porta allo sviluppo di una complessa rete ifica e porta allo sviluppo secondario di vescicole e arbuscoli nelle cellule radicali. Lo scopo di questa ricerca è stato quello di analizzare l'efficienza del metodo MycoPatt (pattern micorrizici) per il posizionamento di strutture fungine nelle radici di Festuca rubra e Zea mays. Un altro obiettivo era quello di esplorare la strategia di colonizzazione fungina come rivelato dalle mappe micorriziche di ciascuna specie. L'acquisizione e l'assemblaggio di più immagini microscopiche consentono la valutazione della colonizzazione micorrizica sia nelle piante di mais che in quelle di festuca rossa per fornire informazioni sulla posizione realistica delle strutture sviluppate. I pattern micorrizici osservati evidenziano l'efficienza variabile di ogni pianta in termini di sviluppo di connessioni con funghi simbiotici del suolo, causati da trattamenti applicati e fase di crescita. Le mappe dettagliate micorriziche ottenute attraverso il metodo MycoPatt sono utili per la diagnosi precoce dell'efficienza delle piante nell'acquisizione simbiotica dal suolo.

L'uso corretto del metodo di schiacciamento delicato delle radici dopo le procedure di colorazione fornisce buoni dettagli delle strutture micorriziche, sia per Zea mays (Figura 8A-C) che per Festuca rubra (Figura 9A-E), un buon contrasto tra strutture micorriziche e cellule radicali e una conferma della stele dovuta al colore blu. Se le procedure di pulizia e colorazione non h...

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Mycorrhizal Maps as a Tool to Explore Colonization Patterns and Fungal Strategies in the Roots of Festuca rubra and Zea mays

Il protocollo qui descrive i metodi per la valutazione dei modelli di colonizzazione micorrizica arbuscolare e la strategia nelle radici per due specie: Zea mays e Festuca rubra. L'uso del metodo MycoPatt consente il calcolo dei parametri, la conversione delle strutture micorriziche in dati digitali e la mappatura della loro posizione reale nelle radici.

Mappe micorriziche come strumento per esplorare i modelli di colonizzazione e le strategie fungine nelle radici di Festuca rubra e Zea mays

Arbuscular mycorrhizal fungi are symbionts in the roots of plants. Their role is to sustain host development and maintain the nutritional equilibrium in ...

Il metodo MycoPatt consente un'esplorazione approfondita della colonizzazione micorrizica arbuscolare nelle radici. Le mappe micorriziche indicano l'espansione fungina e presentano la posizione reale di ciascuna struttura come un modello specifico. La colonizzazione micorrizica viene analizzata oggettivamente con una risoluzione dell'1%.Ogni segmento radice viene automaticamente convertito in una matrice digitale e genera un ampio database di parametri di colonizzazione. Per iniziare, rimuovere le radici dal frigorifero e posizionarle su una piattaforma di lavoro per lo scongelamento a temperatura ambiente. Per eseguire la pulizia delle radici, posizionare tutte le radici di una pianta in un barattolo da 30 a 50 millilitri, quindi preparare una soluzione di idrossido di sodio al 10% con acqua di rubinetto e versarla nel barattolo fino a coprire completamente le radici.Agitare vigorosamente il barattolo per uno o due minuti per una dispersione omogenea della soluzione di pulizia nelle radici. Lasciare che le radici rimangano nella soluzione di compensazione per 48 ore. Per il risciacquo delle radici, passare il contenuto del barattolo attraverso un setaccio.Risciacquare le radici più volte in acqua di rubinetto fino a completa rimozione della soluzione di pulizia. Quindi posizionare le radici sciacquate in un barattolo pulito per la colorazione. Quindi preparare una soluzione di aceto di inchiostro da cinque a cinque percento con acqua di rubinetto.Versalo nel barattolo fino a coprire le radici e agitalo per uno o due minuti. Dopo 48 ore per la decolorazione parziale, sciacquare le radici macchiate in acqua di rubinetto per uno o due minuti. Agitare vigorosamente il barattolo per rimuovere la soluzione macchiante in eccesso.Ripetere la procedura fino a quando le radici sono chiare per la valutazione microscopica. Per la segmentazione delle radici, posizionare le radici macchiate su un tagliere scalato. Tagliare le radici in segmenti di un centimetro.Scegli 15 segmenti per ogni variante. Quindi, distribuire le radici su un vetrino per la preparazione del segmento, utilizzare una busta di laminazione per coprire le radici e schiacciarle delicatamente, partendo da un bordo. Utilizzare uno strumento di plastica morbida per visualizzare le radici sulla diapositiva.Rimuovere con cautela la busta di laminazione e coprire il campione con un vetrino di copertura. Aggiungere acqua a un angolo del vetrino con una pipetta e lasciare che l'acqua si diffonda lentamente sul vetrino. Rimuovere l'acqua in eccesso con un tovagliolo di carta.Per l'analisi microscopica, utilizzare un microscopio dotato di una fotocamera di buona risoluzione. Analizza le diapositive partendo da un'estremità. Cattura ogni campo microscopico.Utilizzare un ingrandimento 10 o 40x per radici spesse e 40x per radici sottili. Dopo l'acquisizione, rinominare ogni immagine con un codice che consentirà il vero post-assemblaggio delle parti radice. Utilizzare il software di presentazione per progettare un tavolo da disegno per l'assemblaggio delle immagini, impostare la larghezza da due a tre centimetri più larga della larghezza dell'immagine.Dopo aver acquisito 15 immagini, aggiungere tutte le immagini acquisite da un segmento nell'ordine di acquisizione, iniziando da uno a 15, e ricostruire l'intera lunghezza del segmento radice. Quindi, utilizza l'allineamento verticale per allineare le immagini al centro e assicurati che ogni immagine segua quella precedente. Posiziona una griglia di 10 per 150 celle su tutte le immagini per coprire l'intero segmento radice.Inoltre, posizionare una griglia 10 per 10 su ogni immagine e in ogni cella di questa griglia, inserire un numero da uno a sei se è visibile una struttura micorrizica arbuscolare o AM o lasciare vuota se non è presente alcuna struttura AM. Aggiungere una tabella per una griglia di 10 celle di larghezza e 150 celle di lunghezza. Modificare la tabella con le dimensioni in base alla larghezza delle immagini, quindi modificare la lunghezza della tabella in modo che comprenda tutte le immagini.Per assegnare un punteggio alla colonizzazione micorrizica, utilizzare il numero univoco per valutare ciascun tipo di struttura come descritto nel metodo del pattern micorrizico. Usa uno per le ife, due per gli arbuscoli, tre per le vescicole, quattro per le spore, cinque per le cellule ausiliarie e sei per i punti di ingresso. Assegna un punteggio a ciascuna struttura micorrizica osservata da ciascuna cellula delle griglie precedentemente applicate.Dopo aver ottenuto il punteggio, inserisci tutti i punteggi ottenuti nel foglio di calcolo MycoPatt. Utilizzare la funzione copia incolla per trasferire tutti i punteggi dalla presentazione nel primo foglio denominato Dati grezzi. Per l'analisi primaria, utilizzare il terzo foglio denominato Parametri per visualizzare i risultati come percentuali separatamente in tre forme.Usa le colonne da A a K per analizzare l'immagine orizzontale della colonizzazione, le colonne da M a W per l'immagine verticale della colonizzazione e le colonne da Y a AI per analizzare la colonizzazione trasversale per ciascuno dei 15 quadrati 10 per 10 e la colonizzazione media finale. Quindi, applicare le definizioni e le formule specifiche per ogni parametro. Per la produzione e l'estrazione di mappe micorriziche, visualizzare l'immagine ottenuta dalla conversione del codice delle strutture micorriziche in colori nel secondo foglio denominato Grafici.Quindi esportare l'immagine risultante nel foglio grafico come immagine e utilizzare il codice colore nella legenda per analizzare i modelli micorrizici. Per l'analisi della mappa micorrizica, identificare le strutture più importanti e il loro assemblaggio. Quindi descrivere il modello di colonizzazione micorrizica osservato nelle radici analizzate, seguito da una strategia di colonizzazione basata sullo sviluppo strutturale osservato nella radice, sul modello di ramificazione e sullo sviluppo delle vescicole arbuscolari.Questo protocollo fornisce i dettagli delle strutture micorriziche con un buon contrasto tra strutture micorriziche e cellule radicali per Zea mays e Festal rubra. Le procedure di pulizia e colorazione infruttuose hanno portato a immagini microscopiche poco chiare delle strutture micorriziche in Festal rubra e Zea mays. I modelli di colonizzazione micorrizica hanno permesso un'esplorazione completa del meccanismo di colonizzazione, questo metodo fornisce un'esplorazione profonda e su piccola scala dei modelli e delle strategie di colonizzazione per Zea mays e Festuca rubra con un'ulteriore espressione visiva dei parametri di colonizzazione.In Zea mays è stato osservato un potenziale di colonizzazione altamente fluttuante a seconda dello stadio di sviluppo della pianta, tuttavia, in Festuca rubra, i processi di colonizzazione avvengono all'interno delle radici e lo sviluppo di reti ifali è stato correlato con una bassa velocità di sviluppo delle radici. MycoPatt è adatto per mappare la colonizzazione micorrizica arbuscolare in qualsiasi pianta. È anche utile esplorare a fondo il meccanismo di colonizzazione e valutare la strategia fungina lungo le radici.

mycorrhizal-maps-as-tool-to-explore-colonization-patterns-fungal

Research

JoVE Journal

Biology

Mycorrhizal Maps as a Tool to Explore Colonization Patterns and Fungal Strategies in the Roots of Festuca rubra and Zea mays

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity necessary for proper cellular function. Understanding how the enzymes, proteins, and cytoskeletal components govern and maintain this biochemical segregation is therefore of paramount importance. The use of fluorescently tagged molecules to localize to and/or perturb subcellular compartments has yielded a wealth of knowledge and advanced our understanding of cellular regulation. Imaging techniques such as fluorescent and confocal microscopy make ascertaining the position of a fluorescently tagged small molecule relatively straightforward, however the resolution of very small structures is limited 1.
On the other hand, electron microscopy has revealed details of subcellular morphology at very high resolution, but its static nature makes it difficult to measure highly dynamic processes with precision 2,3. Thus, the combination of light microscopy with electron microscopy of the same sample, termed Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, affords the dual advantages of ultrafast fluorescent imaging with the high-resolution of electron microscopy 6. This powerful technique has been implemented to study many aspects of cell biology 5,7. Since its inception, this procedure has increased our ability to distinguish subcellular architectures and morphologies at high resolution. 
Here, we present a streamlined method for performing rapid microinjection followed by CLEM (Fig. 1). The microinjection CLEM procedure can be used to introduce specific quantities of small molecules and/or proteins directly into the eukaryotic cell cytoplasm and study the effects from millimeter to multi-nanometer resolution (Fig. 2). The technique is based on microinjecting cells grown on laser etched glass gridded coverslips affixed to the bottom of live cell dishes and imaging with both confocal fluorescent and electron microscopy. Localization of the cell(s) of interest is facilitated by the grid pattern, which is easily transferred, along with the cells of interest, to the Epon resin used for immobilization of samples and sectioning prior to electron microscopy analysis (Fig. 3). Overlay of fluorescent and EM images allows the user to determine the subcellular localization as well as any morphological and/or ultrastructural changes induced by the microinjected molecule of interest (Fig. 4). This technique is amenable to time points ranging from &le;5 s up to several hours, depending on the nature of the microinjected sample.

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The CLEM technique has been adapted to analyze ultrastructural morphology of membranes, organelles, and subcellular structures affected by microinjected molecules. This method combines the powerful techniques of micromanipulation/microinjection, confocal fluorescent microscopy, and electron microscopy to allow millimeter to multi-nanometer resolution. This technique is amenable to a wide variety of applications.

Luce Correlativo e Microscopia Elettronica (CLEM) come strumento per visualizzare molecole microiniezione e dei loro sub-cellulari eucariotiche Obiettivi


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Ricerca

Biologia

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

Una guida al moderno Quantitative Fluorescent Western Blotting con strategie di risoluzione dei problemi

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, is expressed in neurons in response to various stimuli. The protein product can be readily detected with immunohistochemical techniques leading to the use of c-FOS detection to map groups of neurons that display changes in their activity. In this article, we focused on the identification of brainstem neuronal populations involved in the ventilatory adaptation to hypoxia or hypercapnia. Two approaches were described to identify involved neuronal populations in vivo in animals and ex vivo in deafferented brainstem preparations. In vivo, animals were exposed to hypercapnic or hypoxic gas mixtures. Ex vivo, deafferented preparations were superfused with hypoxic or hypercapnic artificial cerebrospinal fluid. In both cases, either control in vivo animals or ex vivo preparations were maintained under normoxic and normocapnic conditions. The comparison of these two approaches allows the determination of the origin of the neuronal activation i.e., peripheral and/or central. In vivo and ex vivo, brainstems were collected, fixed, and sliced into sections. Once sections were prepared, immunohistochemical detection of the c-FOS protein was made in order to identify the brainstem groups of cells activated by hypoxic or hypercapnic stimulations. Labeled cells were counted in brainstem respiratory structures. In comparison to the control condition, hypoxia or hypercapnia increased the number of c-FOS labeled cells in several specific brainstem sites that are thus constitutive of the neuronal pathways involved in the adaptation of the central respiratory drive.

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

La proteina C-FOS immunoistologiche Detection: uno strumento utile come indicatore di percorsi centrali coinvolti nelle risposte fisiologiche specifiche<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Risoluzione Quantificazione alta del cristallino cellulosa accumulo in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots a Monitor tessuto-specifica delle cellule parete Modifiche

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of these analyses is of crucial importance, because growth is driven by cell division and cell elongation. Kinematic analysis represents a methodology to quantify these two processes. Moreover, this technique is easy to use in non-specialized laboratories. Here, we present a protocol for performing a kinematic analysis in monocotyledonous maize (Zea mays) leaves. Two aspects are presented: (1) the quantification of cell division and expansion parameters, and (2) the determination of the location of the developmental zones. This could serve as a basis for sampling design and/or could be useful for data interpretation of biochemical and molecular measurements with high spatial resolution in the leaf growth zone. The growth zone of maize leaves is harvested during steady-state growth. Individual leaves are used for meristem length determination using a DAPI stain and cell-length profiles using DIC microscopy. The protocol is suited for emerged monocotyledonous leaves harvested during steady-state growth, with growth zones spanning at least several centimeters. To improve the understanding of plant growth regulation, data on growth and molecular studies must be combined. Therefore, an important advantage of kinematic analysis is the possibility to correlate changes at the molecular level to well-defined stages of cellular development. Furthermore, it allows for a more focused sampling of specified developmental stages, which is useful in case of limited budget or time.

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies.

Analisi cinematica di divisione cellulare e di espansione: Quantificare la base cellulare della crescita e dello sviluppo di campionamento zone in<em&gt; Zea mays</em&gt; Foglie

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Luce Foglio microscopia a fluorescenza delle radici delle piante che crescono sulle superficie di un gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Magnetico-Activated Cell Sorting strategie per isolare e purificare Synovial cellule staminali mesenchimali liquido derivato da un modello di coniglio

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological samples, designed for high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), also referred to as MR microscopy (MRM). It may be used at pre-clinical MRI spectrometers, demonstrated on Medicago truncatula root samples. Microcoils increase sensitivity by matching the size of the RF resonator to the size of the sample of interest, thereby enabling higher image resolutions in a given data acquisition time. Due to the relatively simple design, solenoidal microcoils are straightforward and cheap to construct and can be easily adapted to the sample requirements. Systematically, we explain how to calibrate new or home-built microcoils, using a reference solution. The calibration steps include: pulse power determination using a nutation curve; estimation of RF-field homogeneity; and calculating a volume-normalized signal-to-noise ratio (SNR) using standard pulse sequences. Important steps in sample preparation for small biological samples are discussed, as well as possible mitigating factors such as magnetic susceptibility differences. The applications of an optimized solenoid coil are demonstrated by high-resolution (13 x 13 x 13 &#956;m3, 2.2 pL) 3D imaging of a root sample.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

A protocol to study biological tissue at high spatial resolution using ultra-high field magnetic resonance microscopy (MRM) using microcoils is presented. Step-by-step instructions are provided for characterizing the microcoils. Finally, optimization of imaging is demonstrated on plant roots.