Name: mycorrhizal maps as a tool to explore colonization patterns and fungal strategies in the roots of festuca rubra and zea mays
Uploaded: 2022-08-26T13:00:00
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Este artigo utiliza dados resultantes de dois estudos de doutoramento na área temática de "Corn Mycorrhizal Patterns Driven by Agronomic Inputs", conduzidos por Victoria Pop-Moldovan, e "Mycorrhizal Status and Development of Colonization in Mountain Grassland Dominant Species", conduzido por Larisa Corcoz, sob a coordenação da Profª Dra. Roxana Vidican.

1. Seleção de material biológico, amostragem radicular e armazenamento
<ol><li>Coletar toda a raiz das plantas com uma pá (Figura 1A) separadamente para cada variante e replicar. Retire suavemente, à mão, os grandes agregados de solo das raízes. Lavar todo o sistema radicular e medi-lo em uma escala com células de 1 cm x 1 cm (Figura 1B). Corte as raízes separadamente para cada planta e coloque-as em um saco plástico.</li>
	<li>Colet...

<ol>
	<li>Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-microbiome+interactions:+From+community+assembly+to+plant+health.">Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (11), 607-621 (2020).</li><li>Jeffries, P., Barea, J. M., Hock, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4+Arbuscular+Mycorrhiza:+A+Key+Component+of+Sustainable+Plant-Soil+Ecosystems.">4 Arbuscular Mycorrhiza: A Key Component of Sustainable Plant-Soil Ecosystems.</a> The Mycota. IX Fungal Associations. , 51-75 (2012).</li><li>Parniske, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbuscular+mycorrhiza:+the+mother+of+plant+root+endosymbioses.">Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (10), 763-775 (2008).</li><li>Gianinazzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroecology:+The+key+role+of+arbuscular+mycorrhizas+in+ecosystem+services.">Agroecology: The key role of arbuscular mycorrhizas in ecosystem services.</a> Mycorrhiza. 20 (8), 519-530 (2010).</li><li>Lee, E. -. H., Eo, J. -. K., Ka, K. -. H., Eom, A. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+arbuscular+mycorrhizal+fungi+and+their+roles+in+ecosystems.">Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi and their roles in ecosystems.</a> Mycobiology. 41 (3), 121-125 (2013).</li><li>Zhang, Y., Zeng, M., Xiong, B., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+significance+of+arbuscular+mycorrhiza+biotechnology+in+modern+agricultural+system.">Ecological significance of arbuscular mycorrhiza biotechnology in modern agricultural system.</a> Ying Yong Sheng Tai Xue Bao = The Journal of Applied Ecology. 14 (4), 613-617 (2003).</li><li>Shah, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+endophytic+Bacillus+megaterium+colonization+on+structure+strengthening,+microbial+community,+chemical+composition+and+stabilization+properties+of+Hybrid+Pennisetum.">Effect of endophytic Bacillus megaterium colonization on structure strengthening, microbial community, chemical composition and stabilization properties of Hybrid Pennisetum.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 100 (3), 1164-1173 (2020).</li><li>Souza, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Arbuscular Mycorrhizal Fungi. , (2015).</li><li>Sun, X. -. G., Tang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+four+routinely+used+methods+for+assessing+root+colonization+by+arbuscular+mycorrhizal+fungi.">Comparison of four routinely used methods for assessing root colonization by arbuscular mycorrhizal fungi.</a> Botany. 90 (11), 1073-1083 (2012).</li><li>Smith, S., Read, D., Smith, S. E., Read, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+Roots+and+Anatomy+of+Arbuscular+Mycorrhiza.">Colonization of Roots and Anatomy of Arbuscular Mycorrhiza.</a> Mycorrhizal Symbiosis. , 42-90 (2008).</li><li>Stoian, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+approach+and+future+perspectives+in+microscopic+patterns+of+mycorrhizal+roots.">Sensitive approach and future perspectives in microscopic patterns of mycorrhizal roots.</a> Scientific Reports. 9 (1), 10233 (2019).</li><li>Pop-Moldovan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergence+in+corn+mycorrhizal+colonization+patterns+due+to+organic+treatment.">Divergence in corn mycorrhizal colonization patterns due to organic treatment.</a> Plants. 10 (12), 2760 (2021).</li><li>Corcoz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycorrhizal+patterns+in+the+roots+of+dominant+Festuca+rubra+in+a+high-natural-value+grassland.">Mycorrhizal patterns in the roots of dominant Festuca rubra in a high-natural-value grassland.</a> Plants. 11 (1), 112 (2021).</li><li>Corcoz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+colonization+strategies+in+roots+of+long-term+fertilized+Festuca+rubra.">Deciphering the colonization strategies in roots of long-term fertilized Festuca rubra.</a> Agronomy. 12 (3), 650 (2022).</li><li>Stoian, V., Florian, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycorrhiza+-+Benefits,+influence,+diagnostic+method.">Mycorrhiza - Benefits, influence, diagnostic method.</a> Bulletin of University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca. Agriculture. 66 (1), 2009 (2009).</li><li>Prates J&#250;nior, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroecological+coffee+management+increases+arbuscular+mycorrhizal+fungi+diversity.">Agroecological coffee management increases arbuscular mycorrhizal fungi diversity.</a> PLoS One. 14 (1), 0209093 (2019).</li><li>Rillig, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+farmers+should+manage+the+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">Why farmers should manage the arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> New Phytologist. 222 (3), 1171-1175 (2019).</li><li>Rillig, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+integrated+mycorrhizal+technology:+Harnessing+mycorrhiza+for+sustainable+intensification+in+agriculture.">Towards an integrated mycorrhizal technology: Harnessing mycorrhiza for sustainable intensification in agriculture.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1625 (2016).</li><li>Bhale, U. N., Bansode, S. A., Singh, S., Gehlot, P., Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifactorial+Role+of+Arbuscular+Mycorrhizae+in+Agroecosystem.">Multifactorial Role of Arbuscular Mycorrhizae in Agroecosystem.</a> Fungi and their Role in Sustainable Development: Current Perspectives. , 205-220 (2018).</li><li>Khaliq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+control+of+dry+root+rot+of+chickpea+caused+by+Rhizoctonia+bataticola+under+the+natural+field+condition.">Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition.</a> Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).</li><li>Vaida, I., P&#259;curar, F., Rotar, I., Tomo&#537;, L., Stoian, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+diversity+due+to+long-term+management+in+a+high+natural+value+grassland.">Changes in diversity due to long-term management in a high natural value grassland.</a> Plants. 10 (4), 739 (2021).</li><li>. The International Collection of (Vesicular) Arbuscular Mycorrhizal Fungi Available from: <a target="_blank" href="https://invam.wvu.edu/collection">https://invam.wvu.edu/collection</a> (2022)</li><li>. The International Bank for the Glomeromycota Available from: <a target="_blank" href="https://www.i-beg.eu/">https://www.i-beg.eu/</a> (2022)</li></ol>

Estudos sobre colonização micorrízica são vitais para o desenvolvimento de novas estratégias no campo agronômico. O potencial de múltiplas plantas cultivadas para formar uma associação simbiótica com micorrizas arbusculares tornou-as um importante componente do desenvolvimento sustentável do agroecossistema e da manutenção de sua saúde 16,17,18,19,20.<...

Os fungos micorrizas arbusculares (MA) são uma categoria de endófitos transmitidos pelo solo que são constantemente uma área de interesse para os pesquisadores. Sua presença nas raízes da maioria das plantas e seu envolvimento nos ciclos de nutrientes as tornam componentes vitais na estabilidade de todos os ecossistemas onde as plantas herbáceas estão presentes 1,2. Através de seu micélio extra-radicular, o AM atua como uma extensão fúngica para as raízes das plantas, especialmente em áreas de difícil acesso3. A principal atividade é nas raízes das plantas hospedeiras, onde a MA desenvolve grandes redes de hifas e estruturas intracelulares específicas chamadas arbúsculos. A falta de especificidade do hospedeiro permite que o simbionte colonize várias espécies ao mesmo tempo. Essa habilidade fornece à AM o papel da alocação de recursos e da regulação de nutrientes no ecossistema; o fungo também fornece suporte na sobrevivência das plantas e auxilia no desempenho das plantas 4,5,6,7. A reação de espécies de micorrizas arbustivas às raízes hospedeiras é visível na extensão e localização do micélio intra-radicular e na presença e forma dos arbúsculos desenvolvidos intracelularmente. Os arbúsculos intracelulares atuam como um ponto de intercâmbio entre os dois simbiontes e representam áreas caracterizadas por processos de transferência rápida. As estruturas que o AM produz são dependentes da espécie e, além dos arbúsculos, nas raízes, eles também desenvolvem vesículas, esporos e células auxiliares.
Há muitos desafios na avaliação de simbiontes de micorrizas arbusculares em raízes de plantas 8,9. O primeiro deles é o seu constante desenvolvimento durante todo o período de vegetação dos hospedeiros, o que leva a múltiplas mudanças na estrutura arbuscular hifal. Os diferentes estágios do crescimento arbuscular, até o seu colapso, estão claramente presentes nas raízes, mas as estruturas arbusculares senescentes às vezes são digeridas, o que as torna apenas parcialmente visíveis10. O segundo desafio é representado pelo método e protocolo de coloração, pela grande diversidade de sistemas radiculares, pela dimensão de suas células e pelas diferenças de espessura, que dificultam a proposição de um método unificado. O último desafio é representado pela avaliação e pontuação da colonização da MA. Existem inúmeros métodos que pontuam a MA com diferentes graus de objetividade, e a maioria deles ainda está restrita às técnicas de microscopia. As simples baseiam-se na presença/ausência de estruturas no córtex radicular, enquanto as mais complexas baseiam-se no escore visual e no uso de classes de colonização, com a integração da frequência e intensidade do fenômeno de colonização. Muitos dados foram produzidos nas últimas décadas sobre o status micorrízico de múltiplas espécies, mas a maioria dos métodos se restringe ao valor observado da colonização sem apontar para a posição real de cada estrutura no córtex radicular. Como resposta à necessidade de resultados mais precisos sobre a colonização por MA, foi desenvolvido um método baseado na análise microscópica de padrões micorrízicos (MycoPatt) em raízes para montar, em formato digital, os mapas micorrízicos detalhados11. Além disso, o método permite o cálculo objetivo dos parâmetros de colonização e a determinação da posição real de cada estrutura na raiz.
A posição das estruturas fúngicas da micorrizas do miocárdio pode ser importante para responder às duas perguntas a seguir. A primeira está relacionada à análise da colonização em um momento específico do ciclo vegetacional de uma planta. Nesse contexto, é muito útil observar a abundância de arbusculares/vesículas, relatar como elas estão localizadas na raiz e fornecer uma imagem e parâmetros de colonização muito claros. A segunda está relacionada à detecção da estratégia fúngica e sua orientação e até mesmo à previsão de seu desenvolvimento futuro. Uma aplicação do MycoPatt pode ser para plantas analisadas diariamente, a cada 2-3 dias, semanalmente ou durante vários estágios de crescimento. Nesse contexto, a localização das vesículas/arbúsculos é importante para melhor compreensão do mecanismo biológico da colonização por MA. Estes parâmetros e observações são muito úteis para complementar os parâmetros matemáticos.
O objetivo deste artigo é demonstrar a capacidade do sistema MycoPatt de explorar o potencial e a estratégia de colonização de fungos de micorrizas arbusculares nativos em raízes de Zea mays (milho) durante diferentes estágios de desenvolvimento e em raízes de Festuca rubra (fescue vermelha) sob diferentes condições de fertilização a longo prazo. Para cumprir o objetivo, foram analisadas duas grandes bases de dados de dois experimentos. O experimento com milho foi estabelecido em Cojocna (46°44′56" lat. N e 23°50′0" de comprimento. E), na Fazenda Didática Experimental da Universidade de Ciências Agrárias e Medicina Veterinária de Cluj sobre um feozoima com textura argilosa do solo12. O experimento de fescue vermelha é uma parte de um local experimental maior estabelecido em 2001 em Ghețari, Montanhas Apuseni (46°49'064" lat. N e 22°81'418'' de comprimento. E), em um solo preluvosol (terra rossa) tipo13,14. O milho foi coletado em cinco diferentes fenófases de crescimento12: B1 = 2-4 folhas (como ponto de controle para o início da colonização micorrízica); B2 = 6 folhas; B3 = 8-10 folhas; B4 = formação de espiga ; B5 = maturidade fisiológica. A partir do estágio de 2-4 folhas (A0), aplicou-se um tratamento orgânico, que resultou em um fator de duas graduações (A1 = controle e A2 = tratado). Raízes de fescue vermelha foram coletadas na floração de um experimento com cinco adubações de longa duração13,14: V1 = controle, não adubado; V2 = 10 t·ha-1 de estrume; V3 = 10 t·ha-1 de estrume + N 50 kg·ha-1, P 2 O5 25 kg·ha-1, K2O 25 kg·ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1; V5 = 10 t·ha-1 de estrume + N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1. Cinco plantas foram coletadas em cada estágio de desenvolvimento de cada variante de fertilização. Foram analisados os protocolos de coloração e seu desempenho em termos de tempo de processamento da amostra e qualidade da coloração. A relação entre o desenvolvimento das hifas de micorrizas arbustivas e a presença de suas estruturas nas raízes foi analisada separadamente para cada espécie e continuou com a identificação das raízes mais permissivas para colonização. Os padrões específicos de colonização de cada sistema radicular foram analisados com base em mapas de colonização e no valor dos parâmetros de MA.
O milho é uma planta anual, o que implica o crescimento contínuo das raízes, e essa foi a principal razão para aplicar o MycoPatt nos estágios de crescimento. A fescue vermelha é uma planta perene de uma pastagem tratada por um longo tempo com diferentes fertilizantes. Suas raízes têm um desenvolvimento mais curto de 1 ano, e a antese é considerada como o ponto de vegetação quando a planta muda seu metabolismo de vegetativo para generativo. Para a captura dessas plantas durante esses períodos de intensa atividade, foram escolhidos os pontos de tempo acima mencionados. A amostragem durante o período de vegetação é difícil para esta espécie quando cultivada em pastagens naturais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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			<td>Peach</td>
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		</tr>
		<tr>
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			<td>Bioquell UK Ltd</td>
			<td>Microflow Class II ABS Cabinet</td>
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		</tr>
		<tr>
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			YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ 
			hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb 
			xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office 365</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Office 365</td>
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		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Oltchim</td>
			<td>01-2119457892-27-0065</td>
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		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
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			wQAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr>
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			<td>OPTIKA</td>
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		</tr>
		<tr>
			<td>Optika Microscope</td>
			<td>OPTIKA</td>
			<td>B383pL</td>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
		<tr>
			<td>White wine vinegar 9%</td>
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			<td>O&#538;ET DE VIN ALB</td>
			<td>https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mycorrhizal maps as a tool to explore colonization patterns and fungal strategies in the roots of festuca rubra and zea mays

Os fungos micorrízicos arbusculares são simbiontes nas raízes das plantas. Seu papel é sustentar o desenvolvimento do hospedeiro e manter o equilíbrio nutricional nos ecossistemas. O processo de colonização é dependente de vários fatores, como a ecologia do solo, a diversidade genética dos fungos e hospedeiros e práticas agronômicas. Sua ação sincronizada leva ao desenvolvimento de uma complexa rede hifal e leva ao desenvolvimento secundário de vesículas e arbúsculos nas células radiculares. O objetivo deste trabalho foi analisar a eficiência do método de padrões micorrízicos (MycoPatt) para o posicionamento de estruturas fúngicas nas raízes de Festuca rubra e Zea mays. Outro objetivo foi explorar a estratégia de colonização fúngica revelada pelos mapas micorrízicos de cada espécie. A aquisição e a montagem de múltiplas imagens microscópicas permitem a avaliação da colonização micorrízica em plantas de milho e fescue vermelha para fornecer informações sobre a posição realista das estruturas desenvolvidas. Os padrões micorrízicos observados destacam a eficiência variável de cada planta em termos de desenvolvimento de conexões com fungos simbióticos do solo, causadas por tratamentos aplicados e estágio de crescimento. Mapas detalhados micorrízicos obtidos pelo método MycoPatt são úteis para a detecção precoce da eficiência das plantas na aquisição simbiótica do solo.

O uso correto do método de esmagamento suave das raízes após os procedimentos de coloração fornece bons detalhes das estruturas micorrízicas, tanto para Zea mays (Figura 8A-C) quanto para Festuca rubra (Figura 9A-E), bom contraste entre estruturas micorrízicas e células radiculares e confirmação da estela devido à cor azul. Se os procedimentos de limpeza e coloraçã...

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Mycorrhizal Maps as a Tool to Explore Colonization Patterns and Fungal Strategies in the Roots of Festuca rubra and Zea mays

O protocolo aqui descreve os métodos para a avaliação dos padrões de colonização micorrízica arbuscular e a estratégia em raízes para duas espécies: Zea mays e Festuca rubra. O uso do método MycoPatt permite o cálculo de parâmetros, a conversão de estruturas micorrízicas em dados digitais e o mapeamento de sua posição real nas raízes.

Mapas micorrízicos como ferramenta para explorar padrões de colonização e estratégias fúngicas nas raízes de Festuca rubra e zea mays

Arbuscular mycorrhizal fungi are symbionts in the roots of plants. Their role is to sustain host development and maintain the nutritional equilibrium in ...

O método MycoPatt permite uma exploração em profundidade da colonização micorrízica arbuscular em raízes. Os mapas micorrízicos apontam para a expansão fúngica e apresentam a posição real de cada estrutura como um padrão específico. A colonização micorrízica é objetivamente analisada a 1% de resolução.Cada segmento raiz é automaticamente convertido em uma matriz digital e gera um extenso banco de dados de parâmetros de colonização. Para começar, retire as raízes da geladeira e coloque-as em uma plataforma de trabalho para descongelar à temperatura ambiente. Para realizar a limpeza das raízes, coloque todas as raízes de uma planta em um frasco de 30 a 50 mililitros, em seguida, prepare uma solução de hidróxido de sódio a 10% com água da torneira e despeje-a no frasco até cobrir completamente as raízes.Agitar vigorosamente o frasco durante um a dois minutos para dispersão homogénea da solução de limpeza nas raízes. Deixe as raízes permanecerem na solução de limpeza por 48 horas. Para enxaguar as raízes, passe o conteúdo do frasco através de uma peneira.Lave as raízes várias vezes em água da torneira até que a solução de limpeza seja completamente removida. Em seguida, coloque as raízes enxaguadas em um frasco limpo para colorir. Em seguida, prepare uma solução de vinagre de tinta de cinco a cinco por cento com água da torneira.Despeje-o no frasco até cobrir as raízes e agite-o por um a dois minutos. Após 48 horas para a coloração parcial, enxaguar as raízes coradas em água da torneira por um a dois minutos. Agite o frasco vigorosamente para remover a solução de coloração extra.Repita o procedimento até que as raízes estejam claras para avaliação microscópica. Para segmentação radicular, coloque as raízes manchadas em uma tábua de corte em escamas. Corte as raízes em segmentos de um centímetro.Escolha 15 segmentos para cada variante. Em seguida, espalhe as raízes em uma lâmina para preparação do segmento, use uma bolsa de laminação para cobrir as raízes e esmagá-las suavemente, começando por uma borda. Use uma ferramenta de plástico macio para exibir as raízes no slide.Remova cuidadosamente a bolsa de laminação e cubra a amostra com um deslizamento de cobertura. Adicione água a um canto do escorregador com uma pipeta e deixe a água se espalhar lentamente no escorregador. Retire a água extra com uma toalha de papel.Para análise microscópica, use um microscópio equipado com uma câmera de boa resolução. Analise os slides a partir de uma extremidade. Capture cada campo microscópico.Use uma ampliação de 10 ou 40x para raízes grossas e 40x para raízes finas. Após a captura, renomeie cada imagem com um código que permitirá a pós-montagem real de peças raiz. Use o software de apresentação para projetar uma prancheta de desenho para montagem de imagens, defina a largura de dois a três centímetros a mais do que a largura da imagem.Depois de capturar 15 imagens, adicione todas as imagens capturadas de um segmento na ordem de captura, começando com uma a 15, e reconstrua todo o comprimento do segmento raiz. Em seguida, use o alinhamento vertical para alinhar as imagens no centro e garantir que cada imagem siga a anterior. Coloque uma grade de 10 por 150 células em todas as imagens para cobrir todo o segmento raiz.Além disso, coloque uma grade de 10 por 10 em cada imagem e, em cada célula dessa grade, insira um número de um a seis se uma estrutura micorrízica arbuscular ou AM estiver visível, ou deixe em branco se nenhuma estrutura AM estiver presente. Adicione uma tabela para uma grade de 10 células de largura e 150 células de comprimento. Altere a tabela com dimensões para a largura das imagens e, em seguida, altere o comprimento da tabela para incluir todas as imagens.Para pontuar a colonização micorrízica, use o número único para pontuar cada tipo de estrutura, conforme descrito no método do padrão micorrízico. Use um para hifas, dois para arbúsculos, três para vesículas, quatro para esporos, cinco para células auxiliares e seis para pontos de entrada. Pontuar cada estrutura micorrízica observada de cada célula das grades aplicadas anteriormente.Após a pontuação, insira todos os escores obtidos na planilha do MycoPatt. Use a função copiar e colar para transferir todas as pontuações da apresentação para a primeira planilha chamada Dados Brutos. Para a análise primária, use a terceira folha chamada Parâmetros para visualizar os resultados como porcentagens separadamente em três formulários.Use as colunas A a K para analisar a imagem horizontal da colonização, as colunas M a W para a imagem vertical da colonização e as colunas Y a AI para analisar a colonização transversal para cada um dos 15 10 por 10 quadrados e a colonização média final. Em seguida, aplique as definições e fórmulas específicas para cada parâmetro. Para produção e extração de mapas micorrízicos, visualize a imagem obtida a partir da conversão do código de estruturas micorrízicas em cores na segunda folha denominada Gráficos.Em seguida, exporte a imagem resultante na folha do gráfico como uma imagem e use o código de cores na legenda para analisar padrões micorrízicos. Para a análise do mapa micorrízico, identifique as estruturas mais importantes e sua montagem. Em seguida, descrever o padrão de colonização micorrízica observado nas raízes analisadas, seguido de uma estratégia de colonização baseada no desenvolvimento estrutural observado na raiz, no padrão de ramificação e no desenvolvimento da vesícula arbuscular.Este protocolo fornece os detalhes das estruturas micorrízicas com bom contraste entre as estruturas micorrízicas e as células radiculares de Zea mays e rubra festal. Os procedimentos malsucedidos de limpeza e coloração resultaram em imagens microscópicas pouco claras de estruturas micorrízicas em rubra festal e Zea mays. Os padrões de colonização micorrízica permitiram uma exploração completa do mecanismo de colonização, este método fornece uma exploração profunda e em pequena escala dos padrões e estratégias de colonização para Zea mays e Festuca rubra com uma expressão visual adicional dos parâmetros de colonização.Em Zea mays observou-se potencial de colonização altamente flutuante dependendo do estágio de desenvolvimento da planta, no entanto, em Festuca rubra, os processos de colonização ocorrem dentro das raízes e o desenvolvimento de redes hifais foi correlacionado com uma baixa velocidade de desenvolvimento das raízes. O MycoPatt é adequado para mapear a colonização micorrízica arbuscular em qualquer planta. Também é útil explorar completamente o mecanismo de colonização e avaliar a estratégia fúngica ao longo das raízes.

Research

JoVE Journal

Biology

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Biologia

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