Name: mycorrhizal maps as a tool to explore colonization patterns and fungal strategies in the roots of festuca rubra and zea mays
Uploaded: 2022-08-26T13:00:00
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Este artículo utiliza datos resultantes de dos estudios de doctorado en el área temática de "Patrones de micorrizas de maíz impulsados por insumos agronómicos", realizados por Victoria Pop-Moldovan, y "Estado de micorrizas y desarrollo de la colonización en especies dominantes de pastizales de montaña", realizado por Larisa Corcoz, bajo la coordinación de la Prof. Dra. Roxana Vidican.

1. Selección del material biológico, muestreo radicular y almacenamiento
<ol><li>Recoja toda la raíz de las plantas con una pala (Figura 1A) por separado para cada variante y replíquela. Retire suavemente, a mano, los grandes agregados de tierra de las raíces. Lave todo el sistema radicular y mídalo en una escala con células de 1 cm x 1 cm (Figura 1B). Corte las raíces por separado para cada planta y colóquelas en una bolsa de plásti...

<ol>
	<li>Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-microbiome+interactions:+From+community+assembly+to+plant+health.">Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health.</a> Nature Reviews Microbiology. 18 (11), 607-621 (2020).</li><li>Jeffries, P., Barea, J. M., Hock, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4+Arbuscular+Mycorrhiza:+A+Key+Component+of+Sustainable+Plant-Soil+Ecosystems.">4 Arbuscular Mycorrhiza: A Key Component of Sustainable Plant-Soil Ecosystems.</a> The Mycota. IX Fungal Associations. , 51-75 (2012).</li><li>Parniske, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbuscular+mycorrhiza:+the+mother+of+plant+root+endosymbioses.">Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (10), 763-775 (2008).</li><li>Gianinazzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroecology:+The+key+role+of+arbuscular+mycorrhizas+in+ecosystem+services.">Agroecology: The key role of arbuscular mycorrhizas in ecosystem services.</a> Mycorrhiza. 20 (8), 519-530 (2010).</li><li>Lee, E. -. H., Eo, J. -. K., Ka, K. -. H., Eom, A. -. 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Agriculture. 66 (1), 2009 (2009).</li><li>Prates J&#250;nior, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroecological+coffee+management+increases+arbuscular+mycorrhizal+fungi+diversity.">Agroecological coffee management increases arbuscular mycorrhizal fungi diversity.</a> PLoS One. 14 (1), 0209093 (2019).</li><li>Rillig, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+farmers+should+manage+the+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis.">Why farmers should manage the arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> New Phytologist. 222 (3), 1171-1175 (2019).</li><li>Rillig, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+integrated+mycorrhizal+technology:+Harnessing+mycorrhiza+for+sustainable+intensification+in+agriculture.">Towards an integrated mycorrhizal technology: Harnessing mycorrhiza for sustainable intensification in agriculture.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1625 (2016).</li><li>Bhale, U. N., Bansode, S. A., Singh, S., Gehlot, P., Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifactorial+Role+of+Arbuscular+Mycorrhizae+in+Agroecosystem.">Multifactorial Role of Arbuscular Mycorrhizae in Agroecosystem.</a> Fungi and their Role in Sustainable Development: Current Perspectives. , 205-220 (2018).</li><li>Khaliq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+control+of+dry+root+rot+of+chickpea+caused+by+Rhizoctonia+bataticola+under+the+natural+field+condition.">Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition.</a> Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).</li><li>Vaida, I., P&#259;curar, F., Rotar, I., Tomo&#537;, L., Stoian, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+diversity+due+to+long-term+management+in+a+high+natural+value+grassland.">Changes in diversity due to long-term management in a high natural value grassland.</a> Plants. 10 (4), 739 (2021).</li><li>. The International Collection of (Vesicular) Arbuscular Mycorrhizal Fungi Available from: <a target="_blank" href="https://invam.wvu.edu/collection">https://invam.wvu.edu/collection</a> (2022)</li><li>. The International Bank for the Glomeromycota Available from: <a target="_blank" href="https://www.i-beg.eu/">https://www.i-beg.eu/</a> (2022)</li></ol>

Los estudios sobre la colonización micorrízica son vitales para el desarrollo de nuevas estrategias en el campo agronómico. El potencial de múltiples plantas cultivadas para formar una asociación simbiótica con las micorrizas arbusculares las convirtió en un componente importante del desarrollo sostenible del agroecosistema y del mantenimiento de su salud 16,17,18,19,20.<sup c...

Los hongos micorrizas arbusculares (AM) son una categoría de endófitos transmitidos por el suelo que son constantemente un área de interés para los investigadores. Su presencia en las raíces de la mayoría de las plantas y su participación en los ciclos de nutrientes los convierte en componentes vitales en la estabilidad de todos los ecosistemas donde las plantas herbáceas están presentes 1,2. A través de su micelio extrarradicular, AM actúa como una extensión fúngica para las raíces de las plantas, especialmente en áreas de difícil acceso3. La actividad principal es en las raíces de la planta huésped, donde la AM desarrolla grandes redes de hifas y estructuras intracelulares específicas llamadas arbúsculos. La falta de especificidad del huésped permite que el simbionte colonice múltiples especies al mismo tiempo. Esta capacidad proporciona a la AM el papel de la asignación de recursos y la regulación de nutrientes en el ecosistema; El hongo también proporciona apoyo en la supervivencia de la planta y ayuda en el rendimiento de la planta 4,5,6,7. La reacción de las especies AM a las raíces huésped es visible en la extensión y localización del micelio intrarradicular y la presencia y forma de los arbúsculos desarrollados intracelularmente. Los arbúsculos intracelulares actúan como un punto de intercambio entre los dos simbiontes y representan áreas caracterizadas por procesos de transferencia rápida. Las estructuras que produce la AM dependen de la especie y, además de los arbúsculos, en las raíces, también desarrollan vesículas, esporas y células auxiliares.
Existen muchos desafíos en la evaluación de simbiontes AM en raíces de plantas 8,9. El primero es su desarrollo constante durante todo el período vegetativo de los huéspedes, lo que conduce a múltiples cambios en la estructura arbuscular hifal. Las diferentes etapas del crecimiento arbuscular, hasta su colapso, están claramente presentes en las raíces, pero las estructuras AM senescentes a veces se digieren, lo que las hace solo parcialmente visibles10. El segundo desafío está representado por el método y el protocolo de tinción, la gran diversidad de sistemas radiculares, la dimensión de sus células y las diferencias de grosor, que dificultan la propuesta de un método unificado. El último desafío está representado por la evaluación y puntuación de la colonización AM. Existen numerosos métodos que puntúan AM con diferentes grados de objetividad, y la mayoría de ellos todavía están restringidos a las técnicas de microscopía. Los simples se basan en la presencia/ausencia de estructuras en la corteza radicular, mientras que los más complejos se basan en la puntuación visual y el uso de clases de colonización, con la integración de la frecuencia e intensidad del fenómeno de colonización. Se han producido muchos datos en las últimas décadas sobre el estado micorrízico de múltiples especies, pero la mayoría de los métodos se limitan al valor observado de la colonización sin apuntar a la posición real de cada estructura en la corteza radicular. Como respuesta a la necesidad de resultados más precisos sobre la colonización de AM, se desarrolló un método basado en el análisis microscópico de patrones de micorrizas (MycoPatt) en raíces para ensamblar, en forma digital, los mapas micorrícicos detallados11. Además, el método permite el cálculo objetivo de los parámetros de colonización y la determinación de la posición real de cada estructura en la raíz.
La posición de las estructuras fúngicas AM puede ser importante para responder a las siguientes dos preguntas. El primero está relacionado con el análisis de la colonización en un momento específico del ciclo vegetativo de una planta. En este contexto, es muy útil observar la abundancia arbuscular/vesicular, informar cómo se ubican en la raíz y proporcionar una imagen y parámetros de colonización muy claros. El segundo está relacionado con la detección de la estrategia fúngica y su orientación e incluso la previsión de su desarrollo futuro. Una aplicación del MycoPatt puede ser para plantas analizadas diariamente, cada 2-3 días, semanalmente o durante varias etapas de crecimiento. En este contexto, la ubicación de las vesículas/arbúsculas es importante para comprender mejor el mecanismo biológico de la colonización AM. Estos parámetros y observaciones son muy útiles para complementar los parámetros matemáticos.
El objetivo de este artículo es demostrar la capacidad del sistema MycoPatt para explorar el potencial y la estrategia de colonización de hongos AM nativos en raíces de Zea mays (maíz) durante diferentes etapas de desarrollo y en raíces de Festuca rubra (festuca roja) bajo diferentes condiciones de fertilización a largo plazo. Para cumplir con el objetivo, se analizaron dos grandes bases de datos de dos experimentos. El experimento de maíz se estableció en Cojocna (46°44′56" lat. N y 23°50′0" de largo. E), en la Granja Didáctica Experimental de la Universidad de Ciencias Agrícolas y Veterinarias de Cluj sobre un feozión con un suelo de textura arcillosa12. El experimento de la festuca roja es parte de un sitio experimental más grande establecido en 2001 en Ghețari, montañas Apuseni (46 ° 49'064 "lat. N y 22 ° 81'418 '' de largo. E), sobre un suelo preluvosol (terra rossa) tipo13,14. El maíz se recolectó en cinco fenofases de crecimiento diferentes12: B1 = 2-4 hojas (como punto de control para el inicio de la colonización micorrízica); B2 = 6 hojas; B3 = 8-10 hojas; B4 = formación de mazorca; B5 = madurez fisiológica. A partir de la etapa de 2-4 hojas (A0), se aplicó un tratamiento orgánico, que resultó en un factor de dos graduación (A1 = control y A2 = tratado). Las raíces de festuca roja fueron recolectadas en la floración de un experimento con cinco fertilizaciones a largo plazo13,14: V1 = control, no fertilizada; V2 = 10 t·ha-1 estiércol; V3 = 10 t·ha-1 estiércol + N 50 kg·ha-1, P 2 O5 25 kg·ha-1, K2O 25 kg·ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1; V5 = 10 t·ha-1 estiércol + N 100 kg·ha-1, P 2 O5 50 kg·ha-1, K2O 50 kg·ha-1. Se recolectaron cinco plantas en cada etapa de desarrollo de cada variante de fertilización. Se analizaron los protocolos de tinción y su rendimiento en términos de tiempo de procesamiento de la muestra y calidad de la tinción. La relación entre el desarrollo de las hifas AM y la presencia de sus estructuras en las raíces se analizó por separado para cada especie y se continuó con la identificación de las raíces más permisivas para la colonización. Los patrones de colonización específicos de cada sistema radicular se analizaron en base a mapas de colonización y el valor de los parámetros AM.
El maíz es una planta anual, lo que implica un crecimiento continuo de las raíces, y esa fue la razón principal para aplicar el MycoPatt en las etapas de crecimiento. La festuca roja es una planta perenne de un pastizal tratada durante mucho tiempo con diferentes fertilizantes. Sus raíces tienen un desarrollo más corto de 1 año, y la antesis se considera como el punto de vegetación cuando la planta cambia su metabolismo de vegetativo a generativo. Para capturar estas plantas durante estos intensos períodos de actividad, se eligieron los puntos de tiempo mencionados anteriormente. El muestreo durante el período de vegetación es difícil para esta especie cuando se cultiva en pastizales naturales.

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		<tr>
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		</tr>
	</tbody>
</table>

mycorrhizal maps as a tool to explore colonization patterns and fungal strategies in the roots of festuca rubra and zea mays

Los hongos micorrízicos arbusculares son simbiontes en las raíces de las plantas. Su función es sostener el desarrollo del huésped y mantener el equilibrio nutricional en los ecosistemas. El proceso de colonización depende de varios factores como la ecología del suelo, la diversidad genética de los hongos y el huésped, y las prácticas agronómicas. Su acción sincronizada conduce al desarrollo de una compleja red hifal y conduce al desarrollo secundario de vesículas y arbúsculos en las células de la raíz. El objetivo de esta investigación fue analizar la eficiencia del método de patrones micorrícicos (MycoPatt) para el posicionamiento de estructuras fúngicas en las raíces de Festuca rubra y Zea mays. Otro objetivo fue explorar la estrategia de colonización fúngica revelada por los mapas micorrícicos de cada especie. La adquisición y ensamblaje de múltiples imágenes microscópicas permite la evaluación de la colonización micorrízica tanto en plantas de maíz como de festuca roja para proporcionar información sobre la posición realista de las estructuras desarrolladas. Los patrones micorrízicos observados resaltan la eficiencia variable de cada planta en términos de desarrollar conexiones con hongos simbióticos del suelo, causados por los tratamientos aplicados y la etapa de crecimiento. Los mapas detallados de micorrizas obtenidos a través del método MycoPatt son útiles para la detección temprana de la eficiencia de la planta en la adquisición simbiótica del suelo.

El uso correcto del método de trituración suave de las raíces después de los procedimientos de tinción proporciona buenos detalles de las estructuras micorrízicas, tanto para Zea mays (Figura 8A-C) como para Festuca rubra (Figura 9A-E), buen contraste entre las estructuras micorrízicas y las células radiculares, y una confirmación de la estela debido al color azul. Si ...

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Mycorrhizal Maps as a Tool to Explore Colonization Patterns and Fungal Strategies in the Roots of Festuca rubra and Zea mays

El protocolo aquí describe los métodos para la evaluación de los patrones de colonización de micorrizas arbusculares y la estrategia en raíces para dos especies: Zea mays y Festuca rubra. El uso del método MycoPatt permite el cálculo de parámetros, la conversión de estructuras micorrízicas en datos digitales y el mapeo de su posición real en raíces.

Mapas de micorrizas como herramienta para explorar patrones de colonización y estrategias fúngicas en las raíces de Festuca rubra y Zea mays

Arbuscular mycorrhizal fungi are symbionts in the roots of plants. Their role is to sustain host development and maintain the nutritional equilibrium in ...

El método MycoPatt permite una exploración en profundidad de la colonización micorrízica arbuscular en raíces. Los mapas de micorrizas apuntan a la expansión fúngica y presentan la posición real de cada estructura como un patrón específico. La colonización micorrízica se analiza objetivamente con una resolución del 1%.Cada segmento raíz se convierte automáticamente en una matriz digital y genera una extensa base de datos de parámetros de colonización. Para comenzar, retire las raíces del refrigerador y colóquelas en una plataforma de trabajo para descongelar a temperatura ambiente. Para realizar la limpieza de raíces, coloque todas las raíces de una planta en un frasco de 30 a 50 mililitros, luego prepare una solución de hidróxido de sodio al 10% con agua del grifo y viértala en el frasco hasta que cubra completamente las raíces.Agite el frasco vigorosamente durante uno o dos minutos para una dispersión homogénea de la solución de limpieza en las raíces. Permita que las raíces permanezcan en la solución de limpieza durante 48 horas. Para el enjuague de la raíz, pase el contenido del frasco a través de un tamiz.Enjuague las raíces varias veces con agua del grifo hasta que la solución de limpieza se elimine por completo. A continuación, coloque las raíces enjuagadas en un frasco limpio para teñir. Luego prepare una solución de vinagre de tinta de cinco a cinco por ciento con agua del grifo.Viértelo en el frasco hasta que cubra las raíces y agítalo durante uno o dos minutos. Después de 48 horas para la detinción parcial, enjuague las raíces manchadas en agua del grifo durante uno o dos minutos. Agite el frasco vigorosamente para eliminar la solución de tinción adicional.Repita el procedimiento hasta que las raíces estén claras para la evaluación microscópica. Para la segmentación de la raíz, coloque las raíces manchadas en una tabla de cortar a escala. Corta las raíces en segmentos de un centímetro.Elija 15 segmentos para cada variante. A continuación, extienda las raíces en un portaobjetos para la preparación del segmento, use una bolsa laminadora para cubrir las raíces y aplastarlas suavemente, comenzando desde un borde. Use una herramienta de plástico blando para mostrar las raíces en el portaobjetos.Retire con cuidado la bolsa laminadora y cubra la muestra con un cubreobjetos. Agregue agua a una esquina del tobogán con una pipeta y deje que el agua se extienda lentamente sobre el tobogán. Retire el exceso de agua con una toalla de papel.Para el análisis microscópico, utilice un microscopio equipado con una cámara de buena resolución. Analice las diapositivas a partir de una extremidad. Captura cada campo microscópico.Use un aumento de 10 o 40x para raíces gruesas y 40x para raíces delgadas. Después de la captura, cambie el nombre de cada imagen con un código que permita el post-ensamblaje real de las partes raíz. Utilice el software de presentación para diseñar un tablero de dibujo para el ensamblaje de imágenes, establezca el ancho de dos a tres centímetros más ancho que el ancho de la imagen.Después de capturar 15 imágenes, agregue todas las imágenes capturadas de un segmento en el orden de su captura, comenzando con una a 15, y reconstruya toda la longitud del segmento raíz. A continuación, use la alineación vertical para alinear las imágenes en el centro y asegúrese de que cada imagen siga a la anterior. Coloque una cuadrícula de 10 por 150 celdas en todas las imágenes para cubrir todo el segmento de la raíz.Además, coloque una cuadrícula de 10 por 10 en cada imagen y en cada celda de esta cuadrícula, inserte un número del uno al seis si una estructura arbuscular de micorrizas o AM es visible, o déjela en blanco si no hay estructura AM presente. Agregue una tabla para una cuadrícula de 10 celdas de ancho y 150 celdas de longitud. Cambie la tabla con dimensiones al ancho de las imágenes y, a continuación, cambie la longitud de la tabla para que comprenda todas las imágenes.Para calificar la colonización micorrízica, use el número único para calificar cada tipo de estructura como se describe en el método de patrón micorrízico. Use uno para hifas, dos para arbúsculos, tres para vesículas, cuatro para esporas, cinco para células auxiliares y seis para puntos de entrada. Puntúe cada estructura micorrízica observada de cada celda de las cuadrículas aplicadas anteriormente.Después de puntuar, inserte todas las puntuaciones obtenidas en la hoja de cálculo MycoPatt. Utilice la función de copiar y pegar para transferir todas las puntuaciones de la presentación a la primera hoja denominada Datos sin procesar. Para el análisis primario, utilice la tercera hoja denominada Parámetros para visualizar los resultados como porcentajes por separado en tres formas.Utilice las columnas A a K para analizar la imagen horizontal de la colonización, las columnas M a W para la imagen vertical de la colonización y las columnas Y a AI para analizar la colonización transversal para cada uno de los 15 cuadrados de 10 por 10 y la colonización promedio final. A continuación, aplique las definiciones y fórmulas específicas de cada parámetro. Para la producción y extracción de mapas micorrízicos, visualice la imagen obtenida de la conversión del código de estructuras micorrízicas en colores en la segunda hoja denominada Gráficos.A continuación, exporte la imagen resultante en la hoja gráfica como una imagen y utilice el código de color de la leyenda para analizar los patrones micorrízicos. Para el análisis de mapas micorrízicos, identifique las estructuras más importantes y su ensamblaje. Luego describa el patrón de colonización micorrízica observado en las raíces analizadas, seguido de una estrategia de colonización basada en el desarrollo estructural observado en la raíz, el patrón de ramificación y el desarrollo de vesículas arbusculares.Este protocolo proporciona los detalles de las estructuras micorrízicas con buen contraste entre las estructuras micorrízicas y las células radiculares para Zea mays y Festal rubra. Los procedimientos infructuosos de limpieza y tinción dieron como resultado imágenes microscópicas poco claras de estructuras micorrízicas en Festal rubra y Zea mays. Los patrones de colonización micorrízica permitieron una exploración completa del mecanismo de colonización, este método proporciona una exploración profunda y a pequeña escala de los patrones de colonización y las estrategias para Zea mays y Festuca rubra con una expresión visual adicional de los parámetros de colonización.En Zea mays se observó un potencial de colonización altamente fluctuante dependiendo de la etapa de desarrollo de la planta, sin embargo, en Festuca rubra, los procesos de colonización ocurren dentro de las raíces y el desarrollo de redes hifales se correlacionó con una baja velocidad de desarrollo de las raíces. MycoPatt es adecuado para mapear la colonización micorrízica arbuscular en cualquier planta. También es útil explorar completamente el mecanismo de colonización y evaluar la estrategia fúngica a lo largo de las raíces.

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

Biología

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