Name: zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis
Uploaded: 2022-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis at JoVE.com

يشكر المؤلفون بيرتي بانولا على الوصول إلى وحدة الزرد وهنري كويفولا على التوجيه والمساعدة في تجارب الزرد. تم دعم هذا البحث من قبل أكاديمية فنلندا ، ومؤسسة جين وأتوس إركو ، والمؤسسة الثقافية الفنلندية ، وبرنامج ATIP-Avenir. تم إجراء التصوير في وحدة المجهر الإلكتروني ووحدة المجهر الضوئي ، معهد التكنولوجيا الحيوية ، بدعم من HiLIFE و Biocenter Finland.

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل المجلس الوطني للتجارب على الحيوانات.
1. التحضيرات
<ol><li>قم بإعداد محلول مخزون التريكاين المستخدم في التخدير26 مقدما (محلول مخزون 0.4٪ المستخدم في هذا البروتوكول). استخدم القفازات واحتفظ بالمواد في غطاء الدخان كلما أمك...

<ol>
	<li>Baden, T., Euler, T., Berens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+retinal+basis+of+vision+across+species.">Understanding the retinal basis of vision across species.</a> Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).</li><li>Nishida, T., Saika, S., Morishige, N., Manis, M. J., Holland, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea+and+sclera:+Anatomy+and+physiology.">Cornea and sclera: Anatomy and physiology.</a> Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. , 1-22 (2017).</li><li>Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions+in+the+cornea.">Stromal-epithelial interactions in the cornea.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).</li><li>Wilson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+injury+induces+keratocyte+apoptosis:+hypothesized+role+for+the+interleukin-1+system+in+the+modulation+of+corneal+tissue+organization+and+wound+healing.">Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing.</a> Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).</li><li>Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+keratocyte+proliferation+in+response+to+epithelial+debridement.">Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement.</a> Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).</li><li>West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+keratocyte:+corneal+stromal+cell+with+variable+repair+phenotypes.">The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).</li><li>Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+abrasions+and+corneal+foreign+bodies.">Corneal abrasions and corneal foreign bodies.</a> Primary Care. 42 (3), 363-375 (2015).</li><li>Ben-Eli, H., Erdinest, N., Solomon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+complications+of+chronic+eye+rubbing+in+ocular+allergy.">Pathogenesis and complications of chronic eye rubbing in ocular allergy.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 19 (5), 526-534 (2019).</li><li>Wilson, S. A., Last, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+corneal+abrasions.">Management of corneal abrasions.</a> American Family Physician. 70 (1), 123-128 (2004).</li><li>Nagata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBP485+promotes+corneal+epithelial+wound+healing.">JBP485 promotes corneal epithelial wound healing.</a> Scientific Reports. 5, 14776 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MANF+promotes+diabetic+corneal+epithelial+wound+healing+and+nerve+regeneration+by+attenuating+hyperglycemia-induced+endoplasmic+reticulum+stress.">MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress.</a> Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).</li><li>Li, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+AlgerBrush+II+rotating+burr+as+a+tool+for+inducing+ocular+surface+failure+in+the+New+Zealand+White+rabbit.">Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit.</a> Experimental Eye Research. 147, 1-11 (2016).</li><li>Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+abrasion+with+ocular+burr+as+a+model+for+cornea+wound+healing.">Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (137), e58071 (2018).</li><li>Kalha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1++progenitor+cell+dynamics+in+murine+cornea+during+homeostasis+and+wound+healing.">Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing.</a> Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).</li><li>Park, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+contribution+of+keratin-14(+)+limbal+epithelial+precursors+in+corneal+wound+healing.">Visualizing the contribution of keratin-14(+) limbal epithelial precursors in corneal wound healing.</a> Stem Cell Reports. 12 (1), 14-28 (2019).</li><li>Kuony, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodysplasin-A+signaling+is+a+key+integrator+in+the+lacrimal+gland-cornea+feedback+loop.">Ectodysplasin-A signaling is a key integrator in the lacrimal gland-cornea feedback loop.</a> Development. 146 (14), (2019).</li><li>Farrelly, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+live+imaging+of+single+corneal+stem+cells+reveals+compartmentalized+organization+of+the+limbal+niche.">Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).</li><li>Ikkala, K., Michon, F., Stratoulias, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+Zebrafish+corneal+injury+induces+bilateral+cell+plasticity+supporting+wound+closure.">Unilateral Zebrafish corneal injury induces bilateral cell plasticity supporting wound closure.</a> Scientific Reports. , (2021).</li><li>Ormerod, L. D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+models+of+corneal+injury+using+alkali-immersed+filter+discs.">Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).</li><li>Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alkali-burn+injury+model+of+corneal+neovascularization+in+the+mouse.">An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159 (2014).</li><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+modeling+of+corneal+alkali+injury+in+the+rat+eye.">Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye.</a> Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).</li><li>Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+chemical+injuries+and+their+management.">Ocular chemical injuries and their management.</a> Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).</li><li>Pal-Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BALB/c+and+C57BL6+mouse+strains+vary+in+their+ability+to+heal+corneal+epithelial+debridement+wounds.">BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds.</a> Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).</li><li>Chen, J. J., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+corneal+epithelial+wound+healing+in+partial-thickness+removal+of+limbal+epithelium.">Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).</li><li>Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGTA+in+corneal+wound+healing+after+transepithelial+laser+ablation+in+a+rabbit+model:+a+randomized,+blinded,+placebo-controlled+study.">RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).</li><li>. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio Available from: <a target="_blank" href="https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html">https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> (2000)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+wound+closure+in+the+rabbit+cornea.+A+biphasic+process.">Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).</li><li>Parlanti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+debris+accumulates+in+corneal+epithelial+cells+after+intraepithelial+corneal+nerves+are+damaged:+A+focused+Ion+Beam+Scanning+Electron+Microscopy+(FIB-SEM)+study.">Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study.</a> Experimental Eye Research. 194, 107998 (2020).</li><li>Zhao, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+cornea:+structure+and+development.">The zebrafish cornea: structure and development.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).</li><li>Richardson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-epithelialization+of+cutaneous+wounds+in+adult+zebrafish+combines+mechanisms+of+wound+closure+in+embryonic+and+adult+mammals.">Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals.</a> Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).</li><li>van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+contraction+drives+the+3D+patterning+of+epithelial+cell+surfaces.">Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration+in+zebrafish.">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).</li><li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirt6+deficiency+impairs+corneal+epithelial+wound+healing.">Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing.</a> Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).</li><li>Ksander, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCB5+is+a+limbal+stem+cell+gene+required+for+corneal+development+and+repair.">ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair.</a> Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li></ol>

إصابات القرنية الجسدية هي السبب الأكثر شيوعا لزيارات مرضى العيون إلى المستشفى. لذلك ، من المهم إنشاء نماذج ذات صلة لدراسة الجوانب المختلفة لفيزيولوجيا القرنية المرضية. حتى الآن ، يعد الماوس هو النموذج الأكثر استخداما لدراسة التئام جروح القرنية. ومع ذلك ، فإن إضافة قطرات العين على العيون ?...

نظرا لأن معظم الظهارة على اتصال بالبيئة الخارجية ، فهي عرضة للإصابة الجسدية ، مما يجعلها مناسبة تماما لدراسة عمليات التئام الجروح. من بين الأنسجة المدروسة جيدا ، تعد القرنية نموذجا مفيدا للغاية في التحقيق في الجوانب الخلوية والجزيئية لالتئام الجروح. كسطح خارجي شفاف ، فإنه يوفر الحماية المادية للعين وهو العنصر الأول لتركيز الضوء على شبكية العين. في حين أن بنية وتكوين الخلية في شبكية العين تختلف بين الأنواع1 ، فإن هذه العناصر من القرنية متشابهة بشكل عام في جميع العيون من نوع الكاميرا ، بغض النظر عن الأنواع.
تتكون القرنية من ثلاث طبقات رئيسية2. الطبقة الأولى والخارجية هي الظهارة ، التي يتم تجديدها باستمرار لضمان شفافيتها. الطبقة الثانية هي السدى ، التي تحتوي على خلايا متناثرة ، تسمى الخلايا القرنية ، داخل طبقة سميكة من ألياف الكولاجين المنظمة بدقة. الطبقة الثالثة والأعمق هي البطانة ، والتي تسمح بانتشار المغذيات والسوائل من الغرفة الأمامية إلى الطبقات الخارجية. تتفاعل الخلايا الظهارية واللحمية عبر عوامل النمو والسيتوكينات3. يتم تسليط الضوء على هذا التفاعل من خلال موت الخلايا المبرمج السريع والانتشار اللاحق للخلايا القرنية بعد الإصابة الظهارية 4,5. في حالة وجود جرح أعمق ، مثل ثقب ، تلعب الخلايا القرنية دورا نشطا في عملية الشفاء6.
كونها على اتصال مع البيئة الخارجية ، والإصابات الجسدية القرنية شائعة. كثير منها ناتج عن أجسام غريبة صغيرة7 ، مثل الرمل أو الغبار. يمكن أن يؤدي رد فعل فرك العين إلى سحجات ظهارية واسعة النطاق وإعادة تشكيل القرنية8. وفقا لحجم الجرح وعمقه ، فإن هذه الإصابات الجسدية مؤلمة وتستغرق عدة أيام للشفاء9. تسهل الخصائص المثلى لالتئام الجروح للنموذج فهم الجوانب الخلوية والجزيئية لإغلاق الجروح. علاوة على ذلك ، أثبتت هذه النماذج أيضا فائدتها لاختبار جزيئات جديدة لديها القدرة على تسريع شفاء القرنية ، كما هو موضح سابقا10,11.
يهدف البروتوكول الموصوف هنا إلى استخدام أسماك الزرد كنموذج ذي صلة لدراسة الإصابة الجسدية للقرنية. هذا النموذج مناسب للغاية لدراسات الفحص الدوائي لأنه يسمح بإضافة الجزيئات مباشرة إلى ماء الخزان ، وبالتالي ، للتلامس مع قرنية الشفاء. ستساعد التفاصيل المقدمة هنا العلماء على إجراء دراساتهم على نموذج الزرد. يتم تنفيذ الإصابة في الجسم الحي مع لدغ العين باهتة. يمكن تحليل التأثير على الخلايا الظهارية المجاورة أو على مسافة منه عن طريق إزالة ظهارة القرنية المركزية على وجه التحديد. في السنوات الأخيرة ، ركزت العديد من التقارير على مثل هذه الطريقة على قرنية القوارض12،13،14،15،16،17. ومع ذلك ، حتى الآن ، طبق تقرير واحد فقط هذه الطريقة على الزرد18.
بسبب بساطته ، فإن الجرح المادي مفيد في تحديد دور الخلايا الظهارية في إغلاق الجرح. نموذج آخر راسخ لإصابة القرنية هو الحرق الكيميائي ، وخاصة حرق القلويات19،20،21. ومع ذلك ، فإن مثل هذا النهج يضر بشكل غير مباشر بسطح العين بأكمله ، بما في ذلك القرنية الطرفية وسدى القرنية19. في الواقع ، من المحتمل أن تحفز الحروق القلوية قرحة القرنية ، والثقوب ، والعتامة الظهارية ، والأوعية الدموية الجديدة السريعة22 ، والنتيجة التي لا يمكن السيطرة عليها للحروق القلوية تستبعد هذا النهج للدراسات العامة لالتئام الجروح. تستخدم العديد من الطرق الأخرى أيضا للتحقيق في التئام جروح القرنية وفقا للتركيز الخاص للدراسة المعنية (على سبيل المثال ، التنضير الظهاري الكامل23 ، والجمع بين الإصابة الكيميائية والميكانيكية للجرح ذي السماكة الجزئية 24 ، والاستئصال بالليزر الإكسيمر للجروح التي تمتد إلى السدى25). استخدام لدغ العين يحد من النقطة البؤرية إلى الاستجابة الظهارية للجرح ويوفر جرحا قابلا للتكرار للغاية.
كما هو الحال مع كل طريقة لإلحاق الجرح ، فإن استخدام نتوء العين له مزايا وعيوب. العيب الرئيسي هو أن الاستجابة تكون في الغالب ظهارية ، فهي لا تعكس تماما السحجات التي شوهدت في الإعداد السريري. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها العديد من المزايا ، بما في ذلك السهولة التي يمكن بها إعدادها وتنفيذها ، ودقتها ، وقابليتها للتكرار ، وحقيقة أنها غير غازية ، مما يجعلها طريقة جيدة التحمل من قبل الحيوانات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5mm burr tips</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BU-5S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1M Tris, pH 8.8</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >adhesive tabs</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Algerbrush burr, Complete instrument</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BR2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton swaps</td>
			<td >Heinz Herenz Hamburg</td>
			<td >1030128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting plate</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting tools</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >double-distilled water</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppedorf tubes, 2ml</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A5040</td>
			<td>Caution: causes irritation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G7651</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lidocaine hydrochloride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >L5647</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounts</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G301P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >101VR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pH indicator strips</td>
			<td >Macherey-Nagel</td>
			<td >92110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic spoons</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 15 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 50 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scanning electron microscope</td>
			<td >FEI</td>
			<td >Quanta 250 FEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Soft sponge</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sputter coater</td>
			<td >Quorum Technologies</td>
			<td >GQ150TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereomicroscope</td>
			<td >Leica</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis

باعتبارها السطح الشفاف للعين ، فإن القرنية مفيدة للرؤية الواضحة. بسبب موقعه ، هذا النسيج عرضة للإهانات البيئية. في الواقع ، فإن إصابات العين الأكثر شيوعا التي تتم مواجهتها سريريا هي تلك الموجودة في القرنية. في حين تمت دراسة التئام جروح القرنية على نطاق واسع في الثدييات الصغيرة (أي الفئران والجرذان والأرانب) ، فقد أهملت دراسات فسيولوجيا القرنية الأنواع الأخرى ، بما في ذلك الزرد ، على الرغم من أن أسماك الزرد هي نموذج بحثي كلاسيكي.
يصف هذا التقرير طريقة لإجراء تآكل القرنية على سمك الزرد. يتم تنفيذ الجرح في الجسم الحي على الأسماك المخدرة باستخدام نتوء العين. تسمح هذه الطريقة بجرح ظهاري قابل للتكرار ، تاركا بقية العين سليمة. بعد التآكل ، يتم مراقبة إغلاق الجرح على مدار 3 ساعات ، وبعد ذلك يتم إعادة ظهارة الجرح. باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ، متبوعا بمعالجة الصور ، يمكن التحقيق في شكل الخلية الظهارية ، والنتوءات القمية لدراسة الخطوات المختلفة أثناء إغلاق الجرح الظهاري القرنية.
تسمح خصائص نموذج الزرد بدراسة فسيولوجيا الأنسجة الظهارية والسلوك الجماعي للخلايا الظهارية عند تحدي الأنسجة. علاوة على ذلك ، فإن استخدام نموذج محروم من تأثير الفيلم المسيل للدموع يمكن أن ينتج إجابات جديدة فيما يتعلق باستجابة القرنية للإجهاد. وأخيرا، يسمح هذا النموذج أيضا بتحديد الأحداث الخلوية والجزيئية التي ينطوي عليها أي نسيج ظهاري يتعرض لجرح مادي. يمكن تطبيق هذه الطريقة على تقييم فعالية الدواء في الاختبارات قبل السريرية.

تصف هذه الدراسة طريقة تستخدم نتوء العين في تجارب التئام جروح القرنية الزردية. تم تعديل هذه الطريقة من الدراسات السابقة على الفئران ، حيث تبين أن اللدغ يزيل طبقات الخلايا الظهارية بكفاءة13. تشمل التحديات في جرح قرنية الزرد الحجم الصغير نسبيا للعين ، وفي حالة التجارب التي تستغر?...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis at JoVE.com

Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis

يركز هذا البروتوكول على إتلاف سطح العين لسمك الزرد من خلال التآكل لتقييم إغلاق الجرح اللاحق على المستوى الخلوي. يستغل هذا النهج نتوء العين لإزالة ظهارة القرنية جزئيا ويستخدم المجهر الإلكتروني الماسح لتتبع التغيرات في مورفولوجيا الخلية أثناء إغلاق الجرح.

التئام جروح قرنية الزرد: من التآكل إلى تحليل التصوير لإغلاق الجرح

As the transparent surface of the eye, the cornea is instrumental for clear sight. Due to its location, this tissue is prone to environmental insults. ...

شفافية القرنية مفيدة لوضوح البصر. في السياق المرضي ، يمكن أن تشكل هذه الشفافية تحديا. تتطلب دراسة آلية التسبب في المرض نماذج بسيطة لها تشابه كبير مع العضو البشري.في هذه الجوانب ، الزرد هو نموذج ممتاز. وهذا هو أول وصف مفصل لتآكل القرنية في أسماك الزرد. هذه التقنية هي طريقة بسيطة وسريعة للحث على دخول السطح إلى العين.يمكن متابعة إغلاق الجرح بسهولة بعد التآكل. أيضا ، يمكن إضافة المواد الكيميائية ، أو عوامل محددة ، إلى مياه الخزان لدراسة تأثيرها على إغلاق الجرح. نظرا لأن الجرح يتم إنشاؤه يدويا ، فإن الطريقة تتطلب بعض الممارسة للحصول على نتائج متسقة.قبل التجربة ، قم بإعداد حل عمل بنسبة 0.02٪ من التريكاين. إذابة 2 مل من محلول الأسهم 0.4 ٪. أضف إلى 40 مل من ماء النظام.ووضع الحل في حاوية صغيرة. اجعل لدغة العيون جاهزة عن طريق التحقق مما إذا كان طرف اللدغ نظيفا. وإذا لزم الأمر ، قم بإزالة حطام الخلايا باستخدام قطعة قطن رطبة.قم بعمل شق على جانب إسفنجة ناعمة. وترطيب الإسفنجة بماء النظام. ضع الإسفنجة على مسرح المجهر التشريحي.ضمان مساحة عمل كافية لاستخدام لدغ. وإضاءة كافية من الجانب وأعلى لرؤية سطح العين بشكل صحيح. ضع السمك المخدر بلطف بملعقة في الشق الموجود على الإسفنجة مع بروز الرأس من سطح الإسفنج.اقترب بعناية من سطح العين بطرف لدغ. وابدأ في تحريك الطرف على سطح العين بحركة دائرية. عند الانتهاء من التآكل ، ضع الأسماك بعناية في مياه النظام العذبة التي تحتوي على مسكن للتعافي.نظف النتوء مباشرة بعد الاستخدام باستخدام قطعة قطن رطبة. التقط السمك في النقطة الزمنية المطلوبة وضعه في محلول تريكاين 0.02٪. احتفظ بالحيوان في المحلول حتى تتوقف حركة التشغيل تماما ولا تتفاعل الأسماك مع اللمس.ضع السمك على طبق بتري بملعقة ، وأمسكه بملاقط. قطع رأس الأسماك بمقص تشريح. تجنب حدوث أي خدوش على سطح العين.ضع الأنسجة في أنبوب عينة يحتوي على 0.1 مليون فوسفات الصوديوم. وشطفه بمخزن مؤقت نظيف بحيث لا يبقى الدم في المحلول. إصلاح الأنسجة في 2.5 ٪ غلوتارالدهيد في 0.1 مليون فوسفات الصوديوم لمدة 24 ساعة في 4 درجة مئوية.إزالة محلول التثبيت وشطف العينة عدة مرات مع 0.1 متر فوسفات الصوديوم.تشريح العينة عن طريق وضعها على قطرة من 0.1 مليون فوسفات الصوديوم على لوحة تشريح. قطع عينة الرأس إلى قسمين باستخدام مقص تشريح دقيق. بدلا من ذلك ، اجمع العينين عن طريق وضع أطراف الملقط الدقيق بعناية في مآخذ العين من جانب العين.ثم اسحب العين من المقبس وأزل الأنسجة الإضافية. انقل العينة المشوهة إلى أنبوب يحتوي على 0.1 مليون فوسفات الصوديوم. تأكد من عدم وجود أنسجة إضافية في أنبوب العينة، لأنها قد تلتصق بالجزء العلوي من العين أثناء معالجة العينة.ضع الحامل مع علامة التبويب على حامل. وحامل إلى قاعدة المجهر تشريح. ضع عينة الأنسجة بلطف على الحامل باستخدام ملاقط دقيقة ، والقرنية متجهة لأعلى.قم بتغطية العينة بالبلاتين باستخدام الجهاز المناسب. وتخزين العينات في درجة حرارة الغرفة حتى التصوير. احصل على صور للتكبير المطلوب.واستخدم صور 2000 إلى 2500x للتحليل. اضبط السطوع والتباين لرؤية جميع حدود الخلايا والميكروريدج بوضوح. وتجنب المناطق المكشوفة بشكل مفرط في الصورة.افتح صورة TIFF باستخدام فيجي ImageJ 1.53. واستخدم شريط مقياس لتعيين المقياس. قم بإنشاء خط يساوي شريط المقياس باستخدام أداة الخط.حدد تحليل. ثم، تعيين المقياس. واكتب في المسافة المعروفة.ثم افتح مدير عائد الاستثمار باستخدام القائمة تحليل، أدوات. بالنسبة لحجم الخلية واستدارتها، حدد تحليل، تعيين القياسات، واصفات الشكل. واستخدم أداة العدسة المكبرة لرؤية الخلايا تحت التكبير.حدد الخلايا باستخدام أداة المضلع، وأضف كل تحديد إلى مدير عائد الاستثمار. وأخيرا، قم بقياس الخلايا المحددة، واحفظ القياس. للمضي قدما في تحليل microridge ، تأكد من أن الصورة بتنسيق 8 بت بالنقر فوق القائمة صورة ، نوع.ثم حدد الخلية باستخدام أداة المضلع. ومسح الخلفية بالنقر فوق تحرير، ثم مسح في الخارج. قم بتنعيم الصورة من مرة إلى ثلاث مرات عن طريق تحديد معالجة، سلسة.واضبط السطوع والتباين من الصورة ، اضبط ، السطوع / التباين ، بحيث تبرز microridges بأكبر قدر ممكن من الوضوح. قم بتجميع الصورة بالنقر فوق عملية ، فلاتر ، مشاركة. وقم بتحويله إلى ثنائي بالنقر فوق عملية ، ثنائي ، جعل ثنائي.ثم، قم بتهيئة الهيكل العظمي للصورة بالأبيض والأسود عن طريق تحديد عملية، ثنائي، هيكل عظمي. استخدم الدالة تحليل الهيكل العظمي لقياس معلمات microridge وحفظ القيم. يتم إغلاق منطقة الجرح في ثلاث ساعات بعد الجرح.لكن الموقع الذي يتم فيه ربط حدود الجرح لا يزال مرئيا. أظهرت النتائج أنه يمكن ملاحظة الميكروريدات الدقيقة في ظهارة القرنية المتآكلة في بعض الخلايا الممدودة بجوار موقع الجرح. في بعض المناطق الطرفية ، يتم فقدان microridges من وسط الخلية.أظهرت المقارنة بين منطقتي المناطق الطرفية خلايا ممدودة ذات متوسط ميكروريدج أقصر ، مما يشير إلى إعادة ترتيب الخلايا كرد فعل على الجرح. تشير هذه النتائج إلى أن التغيرات في شكل الخلية ترتبط بتعديل microridge وتؤكد على عدم التجانس داخل ظهارة القرنية في استجابة الجرح. تذكر أن العملية تتطلب تدريبا على إجراء جرح متجانس وقابل للتكرار.بالإضافة إلى المجهر الإلكتروني ، يمكن استخدام الأنسجة في علم الأنسجة والبقع المناعية والتهجين في الموقع. هذه سوف توفر المزيد من البصيرة في الخلايا والتغيرات الجزيئية أثناء التئام الجروح. استخدام الزرد يوسع معرفتنا في بيولوجيا القرنية.علاوة على ذلك ، هذا النموذج ممتاز للدراسات الدوائية ، ويمكن استخدامه لفهم المزيد عن تطور العين.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

عزل الحمض النووي الريبي من الجنينية التجميعي واسماك الزرد [كدنا] لتحليل الجينات

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

تطوير التصوير والتحليل الآلي للشاشات الكيميائية الزرد.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

إنتاج المعدلة وراثيا القيطم المورق عن طريق تقييد أنزيم التكامل وساطة وزرع النووية

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

يعيش التصوير من النتوء خلية من البشرة من اسماك الزرد النامية

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

الأيض تحليل الملف من الأجنة الزرد

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

تحليل الجنينية واليرقات الزرد الهيكل العظمي Myofibers من الاستعدادات فصلها

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

طرق للبشرة إصابة وفحوصات لالردود الجرح في<em&gt; C. ايليجانس</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...