Name: zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis
Uploaded: 2022-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis at JoVE.com

Forfatterne takker Pertti Panula for adgangen til Zebrafish-enheden og Henri Koivula for vejledning og hjælp til zebrafiskforsøgene. Denne forskning blev støttet af Finlands Akademi, Jane og Aatos Erkko Foundation, den finske kulturfond og ATIP-Avenir-programmet. Billeddannelse blev udført på Electron Microscopy Unit og Light Microscopy Unit, Institute of Biotechnology, støttet af HiLIFE og Biocenter Finland.

Alle forsøg blev godkendt af det nationale dyreforsøgsråd.
1. Præparater
<ol><li>Forbered tricain-stamopløsningen, der anvendes til anæstesi26 på forhånd (0,4% stamopløsning anvendt i denne protokol). Brug handsker og opbevar materialerne i en stinkhætte, når det er muligt.<ol>
<li>For 50 ml af en 0,4% opløsning vejes 200 mg tricainpulver i et 50 ml rør. Pulveret opløses i ca. 45 ml dobbeltdestilleret vand.</li>
		<li>Juster pH-værdien ...

<ol>
	<li>Baden, T., Euler, T., Berens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+retinal+basis+of+vision+across+species.">Understanding the retinal basis of vision across species.</a> Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).</li><li>Nishida, T., Saika, S., Morishige, N., Manis, M. J., Holland, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea+and+sclera:+Anatomy+and+physiology.">Cornea and sclera: Anatomy and physiology.</a> Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. , 1-22 (2017).</li><li>Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions+in+the+cornea.">Stromal-epithelial interactions in the cornea.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).</li><li>Wilson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+injury+induces+keratocyte+apoptosis:+hypothesized+role+for+the+interleukin-1+system+in+the+modulation+of+corneal+tissue+organization+and+wound+healing.">Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing.</a> Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).</li><li>Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+keratocyte+proliferation+in+response+to+epithelial+debridement.">Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement.</a> Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).</li><li>West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+keratocyte:+corneal+stromal+cell+with+variable+repair+phenotypes.">The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).</li><li>Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+abrasions+and+corneal+foreign+bodies.">Corneal abrasions and corneal foreign bodies.</a> Primary Care. 42 (3), 363-375 (2015).</li><li>Ben-Eli, H., Erdinest, N., Solomon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+complications+of+chronic+eye+rubbing+in+ocular+allergy.">Pathogenesis and complications of chronic eye rubbing in ocular allergy.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 19 (5), 526-534 (2019).</li><li>Wilson, S. A., Last, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+corneal+abrasions.">Management of corneal abrasions.</a> American Family Physician. 70 (1), 123-128 (2004).</li><li>Nagata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBP485+promotes+corneal+epithelial+wound+healing.">JBP485 promotes corneal epithelial wound healing.</a> Scientific Reports. 5, 14776 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MANF+promotes+diabetic+corneal+epithelial+wound+healing+and+nerve+regeneration+by+attenuating+hyperglycemia-induced+endoplasmic+reticulum+stress.">MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress.</a> Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).</li><li>Li, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+AlgerBrush+II+rotating+burr+as+a+tool+for+inducing+ocular+surface+failure+in+the+New+Zealand+White+rabbit.">Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit.</a> Experimental Eye Research. 147, 1-11 (2016).</li><li>Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+abrasion+with+ocular+burr+as+a+model+for+cornea+wound+healing.">Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (137), e58071 (2018).</li><li>Kalha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1++progenitor+cell+dynamics+in+murine+cornea+during+homeostasis+and+wound+healing.">Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing.</a> Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).</li><li>Park, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+contribution+of+keratin-14(+)+limbal+epithelial+precursors+in+corneal+wound+healing.">Visualizing the contribution of keratin-14(+) limbal epithelial precursors in corneal wound healing.</a> Stem Cell Reports. 12 (1), 14-28 (2019).</li><li>Kuony, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodysplasin-A+signaling+is+a+key+integrator+in+the+lacrimal+gland-cornea+feedback+loop.">Ectodysplasin-A signaling is a key integrator in the lacrimal gland-cornea feedback loop.</a> Development. 146 (14), (2019).</li><li>Farrelly, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+live+imaging+of+single+corneal+stem+cells+reveals+compartmentalized+organization+of+the+limbal+niche.">Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).</li><li>Ikkala, K., Michon, F., Stratoulias, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+Zebrafish+corneal+injury+induces+bilateral+cell+plasticity+supporting+wound+closure.">Unilateral Zebrafish corneal injury induces bilateral cell plasticity supporting wound closure.</a> Scientific Reports. , (2021).</li><li>Ormerod, L. D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+models+of+corneal+injury+using+alkali-immersed+filter+discs.">Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).</li><li>Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alkali-burn+injury+model+of+corneal+neovascularization+in+the+mouse.">An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159 (2014).</li><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+modeling+of+corneal+alkali+injury+in+the+rat+eye.">Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye.</a> Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).</li><li>Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+chemical+injuries+and+their+management.">Ocular chemical injuries and their management.</a> Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).</li><li>Pal-Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BALB/c+and+C57BL6+mouse+strains+vary+in+their+ability+to+heal+corneal+epithelial+debridement+wounds.">BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds.</a> Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).</li><li>Chen, J. J., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+corneal+epithelial+wound+healing+in+partial-thickness+removal+of+limbal+epithelium.">Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).</li><li>Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGTA+in+corneal+wound+healing+after+transepithelial+laser+ablation+in+a+rabbit+model:+a+randomized,+blinded,+placebo-controlled+study.">RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).</li><li>. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio Available from: <a target="_blank" href="https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html">https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> (2000)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+wound+closure+in+the+rabbit+cornea.+A+biphasic+process.">Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).</li><li>Parlanti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+debris+accumulates+in+corneal+epithelial+cells+after+intraepithelial+corneal+nerves+are+damaged:+A+focused+Ion+Beam+Scanning+Electron+Microscopy+(FIB-SEM)+study.">Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study.</a> Experimental Eye Research. 194, 107998 (2020).</li><li>Zhao, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+cornea:+structure+and+development.">The zebrafish cornea: structure and development.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).</li><li>Richardson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-epithelialization+of+cutaneous+wounds+in+adult+zebrafish+combines+mechanisms+of+wound+closure+in+embryonic+and+adult+mammals.">Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals.</a> Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).</li><li>van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+contraction+drives+the+3D+patterning+of+epithelial+cell+surfaces.">Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration+in+zebrafish.">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).</li><li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirt6+deficiency+impairs+corneal+epithelial+wound+healing.">Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing.</a> Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).</li><li>Ksander, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCB5+is+a+limbal+stem+cell+gene+required+for+corneal+development+and+repair.">ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair.</a> Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li></ol>

Hornhinde fysiske skader er den mest almindelige årsag til oftalmologi patientbesøg på hospitalet. Derfor er det vigtigt at etablere relevante modeller til undersøgelse af forskellige aspekter af hornhindepatofysiologi. Indtil videre er musen den mest anvendte model til undersøgelse af hornhindesårheling. Det kan dog være svært at tilføje øjendråber på murine sårede øjne for at validere virkningen af specifikke lægemidler på hornhindesårheling. I den forbindelse er zebrafiskemodellen særlig nyttig til f...

Da de fleste epiteler er i kontakt med det ydre miljø, er de tilbøjelige til fysisk skade, hvilket gør dem velegnede til undersøgelse af sårhelingsprocesser. Blandt de velundersøgte væv er hornhinden en yderst nyttig model i undersøgelsen af de cellulære og molekylære aspekter af sårheling. Som en gennemsigtig ydre overflade giver den fysisk beskyttelse til øjet og er det første element, der fokuserer lyset på nethinden. Mens nethindens struktur og cellesammensætning varierer mellem art1, er disse elementer i hornhinden generelt ens i alle kamera-type øjne, uanset art.
Hornhinden består af tre hovedlag2. Det første og yderste lag er epitelet, som konstant fornyes for at sikre dets gennemsigtighed. Det andet lag er stroma, som indeholder spredte celler, kaldet keratocytter, inden for et tykt lag af strengt organiserede kollagenfibre. Det tredje og inderste lag er endotelet, som tillader næringsstof- og væskediffusion fra det forreste kammer til de ydre lag. Epitel- og stromalcellerne interagerer via vækstfaktorer og cytokiner3. Denne interaktion fremhæves af den hurtige apoptose og efterfølgende spredning af keratocytter efter epitelskade 4,5. I tilfælde af et dybere sår, såsom en punktering, tager keratocytter en aktiv rolle i helingsprocessen6.
At være i kontakt med det ydre miljø er hornhinde fysiske skader almindelige. Mange af dem er forårsaget af små fremmedlegemer7, såsom sand eller støv. Refleksen af øjengnidning kan føre til omfattende epitelafskrabninger og hornhinde ombygning8. Ifølge sårstørrelse og dybde er disse fysiske skader smertefulde og tager flere dage at helbrede9. De optimale sårhelingsegenskaber ved en model letter forståelsen af de cellulære og molekylære aspekter af sårlukning. Desuden har sådanne modeller også vist sig nyttige til test af nye molekyler med potentiale til at fremskynde hornhindeheling, som tidligere påvist10,11.
Protokollen beskrevet her har til formål at bruge zebrafisk som en relevant model til at studere hornhinde fysisk skade. Denne model er yderst praktisk til farmakologiske screeningsundersøgelser, da den gør det muligt at tilsætte molekyler direkte til tankvandet og derfor komme i kontakt med en helbredende hornhinde. Detaljerne her vil hjælpe forskere med at udføre deres undersøgelser af zebrafiskmodellen. In vivo-skaden udføres med en sløvet okulær burr. Virkningen på epitelceller, der støder op til eller i en afstand fra den, kan analyseres ved specifikt at fjerne det centrale hornhindeepitel. I de senere år har talrige rapporter fokuseret på en sådan metode på gnaverhornhinde 12,13,14,15,16,17; Indtil videre har kun en enkelt rapport imidlertid anvendt denne metode på zebrafisk18.
På grund af sin enkelhed er det fysiske sår nyttigt til at afgrænse epitelcellernes rolle i sårlukning. En anden veletableret model af hornhindeskade er den kemiske forbrænding, især alkaliforbrændingen 19,20,21. En sådan tilgang beskadiger imidlertid indirekte hele øjenoverfladen, herunder den perifere hornhinde og hornhinde stroma19. Faktisk inducerer alkaliforbrændinger potentielt hornhindesår, perforeringer, epiteloacificering og hurtig neovaskularisering22, og det ukontrollable resultat af alkaliforbrændinger diskvalificerer denne tilgang til generelle sårhelingsundersøgelser. Talrige andre metoder anvendes også til at undersøge hornhindesårheling i henhold til det pågældende undersøgelses særlige fokus (f.eks. Fuldstændig epiteldebridering23, kombinationen af kemisk og mekanisk skade for delvis tykkelse sår24, excimerlaserablation for sår, der strækker sig til stroma25). Brugen af en okulær burr begrænser fokuspunktet til epitelresponset på såret og giver et meget reproducerbart sår.
Som med hver metode til sårpåføring har brugen af en okulær burr fordele og ulemper. Den største ulempe er, at responsen for det meste er epitel, det afspejler ikke perfekt de slid, der ses i den kliniske indstilling. Denne metode har imidlertid mange fordele, herunder den lethed, hvormed den kan oprettes og udføres, dens præcision, dens reproducerbarhed og det faktum, at den er ikke-invasiv, hvilket gør den til en metode, der tolereres godt af dyr.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5mm burr tips</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BU-5S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1M Tris, pH 8.8</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >adhesive tabs</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Algerbrush burr, Complete instrument</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BR2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton swaps</td>
			<td >Heinz Herenz Hamburg</td>
			<td >1030128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting plate</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting tools</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >double-distilled water</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppedorf tubes, 2ml</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A5040</td>
			<td>Caution: causes irritation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G7651</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lidocaine hydrochloride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >L5647</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounts</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G301P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >101VR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pH indicator strips</td>
			<td >Macherey-Nagel</td>
			<td >92110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic spoons</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 15 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 50 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scanning electron microscope</td>
			<td >FEI</td>
			<td >Quanta 250 FEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Soft sponge</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sputter coater</td>
			<td >Quorum Technologies</td>
			<td >GQ150TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereomicroscope</td>
			<td >Leica</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis

Som øjets gennemsigtige overflade er hornhinden medvirkende til klart syn. På grund af sin placering er dette væv tilbøjeligt til miljømæssige fornærmelser. Faktisk er de øjenskader, der oftest opstår klinisk, dem til hornhinden. Mens hornhindesårheling er blevet grundigt undersøgt hos små pattedyr (dvs. mus, rotter og kaniner), har hornhindefysiologistudier forsømt andre arter, herunder zebrafisk, på trods af at zebrafisk er en klassisk forskningsmodel.
Denne rapport beskriver en metode til at udføre en hornhinde slid på zebrafisk. Såret udføres in vivo på anæstesiiseret fisk ved hjælp af en okulær burr. Denne metode giver mulighed for et reproducerbart epitelsår, der efterlader resten af øjet intakt. Efter slid overvåges sårlukning i løbet af 3 timer, hvorefter såret reepitheialiseres. Ved hjælp af scanning elektronmikroskopi, efterfulgt af billedbehandling, kan epitelcelleformen og apikale fremspring undersøges for at studere de forskellige trin under hornhindeepitelsårlukning.
Zebrafiskmodellens karakteristika gør det muligt at studere epitelvævets fysiologi og epitelcellernes kollektive opførsel, når vævet udfordres. Desuden kan brugen af en model, der er berøvet tårefilmens indflydelse, give nye svar vedrørende hornhinderespons på stress. Endelig tillader denne model også afgrænsning af de cellulære og molekylære hændelser, der er involveret i ethvert epitelvæv, der udsættes for et fysisk sår. Denne metode kan anvendes til evaluering af lægemiddeleffektivitet i præklinisk testning.

Denne undersøgelse beskriver en metode ved hjælp af en oftalmisk burr i zebrafisk hornhinde sårheling eksperimenter. Metoden er modificeret fra tidligere studier på mus, hvor graten viste sig at fjerne epitelcellelagene effektivt13. Udfordringerne ved zebrafisk hornhindesår omfatter øjets relativt lille størrelse og i tilfælde af tidskrævende eksperimenter behovet for at opretholde en konstant vandstrøm gennem gællerne (som beskrevet af Xu og kolleger28). De vigt...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis at JoVE.com

Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis

Denne protokol fokuserer på at beskadige zebrafiskens okulære overflade gennem slid for at vurdere den efterfølgende sårlukning på celleniveau. Denne tilgang udnytter en okulær burr til delvist at fjerne hornhindeepitelet og bruger scanningselektronmikroskopi til at spore ændringer i cellemorfologi under sårlukning.

Zebrafisk hornhinde sårheling: Fra slid til sårlukning billeddannelsesanalyse

As the transparent surface of the eye, the cornea is instrumental for clear sight. Due to its location, this tissue is prone to environmental insults. ...

Hornhindegennemsigtighed er medvirkende til at klare synet. I patologisk sammenhæng kan denne gennemsigtighed være en udfordring. Undersøgelse af patogenesemekanisme kræver enkle modeller med stor lighed med humant organ.I disse aspekter er zebrafisk en fremragende model. Og dette er den første detaljerede beskrivelse af hornhinde slid i zebrafisk. Denne teknik er en enkel og hurtig måde at fremkalde overfladeindtrængning til øjet.Sårlukningen kan let følges efter slid. Kemikalier eller specifikke faktorer kan også tilsættes til tankvandet for at undersøge deres indvirkning på sårlukning. Da såret oprettes manuelt, kræver metoden en vis øvelse for at opnå konsistente resultater.Før eksperimentet skal du forberede en 0,02% arbejdsløsning af tricain. Optø 2 ml 0,4% stamopløsning. Tilsæt til 40 ml systemvand.Og læg opløsningen i en lille beholder. Hav den oftalmiske grater klar ved at kontrollere, om gratspidsen er ren. Og fjern om nødvendigt celleaffald med en fugtig vatpind.Lav et snit på siden af en blød svamp. Og fugt svampen med systemvand. Placer svampen på scenen i et dissekerende mikroskop.Sørg for tilstrækkelig arbejdsplads til brug af burren. Og nok belysning fra siden og ovenover til at se øjenoverfladen korrekt. Placer forsigtigt den bedøvelsesfulde fisk med en ske i snittet på svampen med hovedet fremspringende fra svampeoverfladen.Gå forsigtigt hen til øjenoverfladen med burrspidsen. Og begynd at flytte spidsen på øjenoverfladen med en cirkulær bevægelse. Når sliddet er færdigt, skal du forsigtigt placere fisken i det friske systemvand, der indeholder smertestillende middel til genopretning.Rengør burr umiddelbart efter brug med en fugtig vatpind. Pick up fisken på det ønskede tidspunkt og læg den i 0,02% tricainopløsning. Hold dyret i opløsningen, indtil den operkulære bevægelse er ophørt helt, og fisken reagerer ikke på berøring.Læg fisken på en petriskål med en ske, og hold den med en pincet. Halshug fisken med dissekerende saks. Undgå at lave ridser på øjenoverfladen.Vævet kom i et prøverør indeholdende 0,1 M natriumphosphat. Og skyl det med en ren buffer, så der ikke er blod tilbage i opløsningen. Fastgør vævet i 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumphosphat i 24 timer ved 4 C.Fjern fikseringsopløsningen og skyl prøven flere gange med 0,1 M natriumphosphat.Dissekere prøven ved at anbringe den på en dråbe 0,1 M natriumphosphat på en dissekeringsplade. Skær hovedprøven i to med fin dissekeringssaks. Alternativt kan du samle øjnene ved forsigtigt at placere spidserne af fine pincet i øjenhulerne fra siden af øjet.Træk derefter øjet ud af stikkontakten og fjern ekstra væv. Overfør den dissekerede prøve til et rør indeholdende 0,1 M natriumphosphat. Sørg for, at der ikke er ekstra væv i prøverøret, da det kan klæbe til toppen af øjet under prøvebehandlingen.Placer holderen med tappen på en holder. Og holderen til bunden af et dissekerende mikroskop. Læg forsigtigt vævsprøven på holderen med en fin pincet, hornhinden vender op.Belæg prøven med platin ved hjælp af den relevante anordning. Og opbevar prøverne ved stuetemperatur indtil billeddannelse. Erhverv billeder af den ønskede forstørrelse.Og brug 2000 til 2500x billeder til analyse. Juster lysstyrken og kontrasten for tydeligt at se alle cellegrænser og mikroridges. Og undgå overeksponerede områder i billedet.Åbn TIFF-billedet med Fiji ImageJ 1.53. Og brug en skalalinje til at indstille skalaen. Opret en linje, der er lig med skalalinjen, med linjeværktøjet.Vælg Analysér. Indstil derefter skala. Og indtast den kendte afstand.Åbn derefter ROI-manageren ved hjælp af menuen Analyser, Værktøjer. For cellestørrelse og rundhed skal du vælge Analysér, Indstil målinger, Formbeskrivelser. Og brug værktøjet Forstørrelsesglas til at se cellerne under forstørrelse.Markér celler med Polygon-værktøjet, og føj hver markering til ROI-manageren. Til sidst skal du måle de valgte celler og gemme målingen. For at fortsætte med mikroridge-analyse skal du sikre dig, at billedet er i 8-bit format ved at klikke på menuen Billede, Type.Vælg derefter cellen med Polygon-værktøjet. Og ryd baggrunden ved at klikke på Rediger og derefter Ryd udenfor. Udjævn billedet en til tre gange ved at vælge Proces, Glat.Og juster lysstyrken og kontrasten fra Billede, Juster, Lysstyrke/Kontrast, så mikrohønsene skiller sig ud så tydeligt som muligt. Konvolve billedet ved at klikke på Proces, Filtre, Konvolut. Og gør det til binært ved at klikke på Process, Binary, Make Binary.Skeletiser derefter det sort-hvide billede ved at vælge Process, Binary, Skeletonize. Brug funktionen Analyseret skelet til at måle mikroridge-parametrene og gemme værdierne. Sårområdet lukkes tre timer efter såret.Men stedet, hvor sårgrænserne er forbundet, forbliver synlige. Resultaterne viste, at der på slibet hornhindeepitel kan observeres mikroridges i nogle aflange celler ved siden af sårstedet. I nogle perifere områder går mikroridges tabt fra midten af cellen.En sammenligning mellem de to af perifere regioner viste aflange celler med kortere gennemsnitlige mikroridges, hvilket indikerer celleomlejringer som en reaktion på såring. Disse resultater tyder på, at celleformændringer korrelerer med mikroridge-modifikation og understreger heterogeniteten i hornhindeepitelet i sårrespons. Husk, at operationen kræver træning for at udføre et homogent og reproducerbart sår.Ud over elektronmikroskopi kan vævet anvendes til histologi, immunologiske farvninger og in situ-hybridisering. Disse vil give yderligere indsigt i celle- og molekylære ændringer under sårheling. Brug af zebrafisk udvider vores viden om hornhindebiologi.Desuden er denne model fremragende til farmakologiske undersøgelser og kan bruges til at forstå mere om øjenudvikling.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Metaboliske profil Analyse af zebrafisk embryoner

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analyse af embryonale og larvestadiet Zebrafisk Skeletal myofibre fra Dissocierede Forberedelser

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder til Hud sårbarhed og Analyser for Wound Svar i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Mikroinjektion i zebrafisk til model akut nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...