Name: zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis
Uploaded: 2022-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis at JoVE.com

Die Autoren danken Pertti Panula für den Zugang zur Zebrafischeinheit und Henri Koivula für die Anleitung und Hilfe bei den Zebrafischexperimenten. Diese Forschung wurde von der Akademie von Finnland, der Jane und Aatos Erkko Foundation, der Finnish Cultural Foundation und dem ATIP-Avenir-Programm unterstützt. Die Bildgebung wurde an der Elektronenmikroskopie-Einheit und der Light Microscopy Unit, Institute of Biotechnology, durchgeführt, unterstützt von HiLIFE und Biocenter Finland.

Alle Experimente wurden vom nationalen Tierversuchsausschuss genehmigt.
1. Vorbereitungen
<ol><li>Bereiten Sie die für die Anästhesie verwendete Tricain-Stammlösung26 im Voraus vor (0,4% ige Stammlösung, die in diesem Protokoll verwendet wird). Verwenden Sie Handschuhe und bewahren Sie die Materialien wann immer möglich in einem Abzug auf.<ol>
<li>Für 50 ml einer 0,4% igen Lösung wiegen Sie 200 mg Tricainpulver in ein 50-ml-Röhrchen. Lösen Si...

<ol>
	<li>Baden, T., Euler, T., Berens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+retinal+basis+of+vision+across+species.">Understanding the retinal basis of vision across species.</a> Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).</li><li>Nishida, T., Saika, S., Morishige, N., Manis, M. J., Holland, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea+and+sclera:+Anatomy+and+physiology.">Cornea and sclera: Anatomy and physiology.</a> Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. , 1-22 (2017).</li><li>Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions+in+the+cornea.">Stromal-epithelial interactions in the cornea.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).</li><li>Wilson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+injury+induces+keratocyte+apoptosis:+hypothesized+role+for+the+interleukin-1+system+in+the+modulation+of+corneal+tissue+organization+and+wound+healing.">Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing.</a> Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).</li><li>Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. 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D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+models+of+corneal+injury+using+alkali-immersed+filter+discs.">Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).</li><li>Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alkali-burn+injury+model+of+corneal+neovascularization+in+the+mouse.">An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+chemical+injuries+and+their+management.">Ocular chemical injuries and their management.</a> Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).</li><li>Pal-Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BALB/c+and+C57BL6+mouse+strains+vary+in+their+ability+to+heal+corneal+epithelial+debridement+wounds.">BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds.</a> Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).</li><li>Chen, J. J., Tseng, S. 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A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio Available from: <a target="_blank" href="https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html">https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> (2000)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. 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R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirt6+deficiency+impairs+corneal+epithelial+wound+healing.">Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing.</a> Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).</li><li>Ksander, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCB5+is+a+limbal+stem+cell+gene+required+for+corneal+development+and+repair.">ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair.</a> Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li></ol>

Hornhautverletzungen sind die häufigste Ursache für ophthalmologische Patientenbesuche im Krankenhaus. Daher ist es wichtig, relevante Modelle für die Untersuchung verschiedener Aspekte der Pathophysiologie der Hornhaut zu erstellen. Bisher ist die Maus das am häufigsten verwendete Modell für das Studium der Hornhautwundheilung. Das Hinzufügen von Augentropfen auf murinen verwundeten Augen, um die Auswirkungen bestimmter Medikamente auf die Wundheilung der Hornhaut zu validieren, kann jedoch schwierig sein. In dies...

Da die meisten Epithel in Kontakt mit der äußeren Umgebung stehen, sind sie anfällig für körperliche Verletzungen, was sie gut für das Studium von Wundheilungsprozessen geeignet macht. Unter den gut untersuchten Geweben ist die Hornhaut ein äußerst nützliches Modell bei der Untersuchung der zellulären und molekularen Aspekte der Wundheilung. Als transparente Außenfläche schützt es das Auge physisch und ist das erste Element, das das Licht auf die Netzhaut fokussiert. Während sich die Struktur und die Zellzusammensetzung der Netzhaut zwischen Spezies1 unterscheiden, sind diese Elemente der Hornhaut im Allgemeinen in allen kameraartigen Augen ähnlich, unabhängig von der Art.
Die Hornhaut besteht aus drei Hauptschichten2. Die erste und äußerste Schicht ist das Epithel, das ständig erneuert wird, um seine Transparenz zu gewährleisten. Die zweite Schicht ist das Stroma, das verstreute Zellen, Keratozyten genannt, in einer dicken Schicht streng organisierter Kollagenfasern enthält. Die dritte und innerste Schicht ist das Endothel, das eine Nährstoff- und Flüssigkeitsdiffusion von der Vorderkammer zu den äußeren Schichten ermöglicht. Die Epithel- und Stromazellen interagieren über Wachstumsfaktoren und Zytokine3. Diese Wechselwirkung wird durch die schnelle Apoptose und die anschließende Proliferation von Keratozyten nach Epithelverletzunghervorgehoben 4,5. Bei einer tieferen Wunde, wie z.B. einer Punktion, nehmen Keratozyten aktiv am Heilungsprozessteil 6.
In Kontakt mit der äußeren Umgebung sind körperliche Verletzungen der Hornhaut häufig. Viele von ihnen werden durch kleine Fremdkörperverursacht 7, wie Sand oder Staub. Der Reflex des Augenreibens kann zu ausgedehnten Epithelabschürfungen und Hornhautumbauführen 8. Je nach Wundgröße und -tiefe sind diese körperlichen Verletzungen schmerzhaft und dauern mehrere Tage,um 9 zu heilen. Die optimalen wundheilenden Eigenschaften eines Modells erleichtern das Verständnis der zellulären und molekularen Aspekte des Wundverschlusses. Darüber hinaus haben sich solche Modelle auch als nützlich erwiesen, um neue Moleküle mit dem Potenzial zur Beschleunigung der Hornhautheilung zu testen, wie bereits gezeigtwurde 10,11.
Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, Zebrafische als relevantes Modell zur Untersuchung der körperlichen Verletzung der Hornhaut zu verwenden. Dieses Modell ist sehr praktisch für pharmakologische Screening-Studien, da es ermöglicht, Moleküle direkt in das Tankwasser zu geben und somit mit einer heilenden Hornhaut in Kontakt zu kommen. Die hier bereitgestellten Details werden den Wissenschaftlern helfen, ihre Studien am Zebrafischmodell durchzuführen. Die in vivo Verletzung wird mit einem stumpfen Augengrat durchgeführt. Die Auswirkungen auf Epithelzellen, die an sie angrenzen oder sich in einiger Entfernung davon befinden, können analysiert werden, indem das zentrale Hornhautepithel gezielt entfernt wird. In den letzten Jahren konzentrierten sich zahlreiche Berichte auf eine solche Methode bei Nagetierhornhaut 12,13,14,15,16,17; Bisher hat jedoch nur ein einziger Bericht diese Methode auf Zebrafisch18 angewendet.
Aufgrund ihrer Einfachheit ist die physische Wunde nützlich, um die Rolle von Epithelzellen beim Wundverschluss zu beschreiben. Ein weiteres etabliertes Modell der Hornhautverletzung ist die chemische Verbrennung, insbesondere die Alkaliverbrennung 19,20,21. Ein solcher Ansatz schädigt jedoch indirekt die gesamte Augenoberfläche, einschließlich der peripheren Hornhaut und des Hornhautstromas19. Tatsächlich induzieren Alkaliverbrennungen möglicherweise Hornhautgeschwüre, Perforationen, epitheliale Trübung und schnelle Neovaskularisation22, und das unkontrollierbare Ergebnis von Alkaliverbrennungen disqualifiziert diesen Ansatz für allgemeine Wundheilungsstudien. Zahlreiche andere Methoden werden auch verwendet, um die Hornhautwundheilung entsprechend dem besonderen Schwerpunkt der jeweiligen Studie zu untersuchen (z. B. vollständiges Epitheldebridement23, die Kombination von chemischer und mechanischer Verletzung bei Teildickenwunden 24, Excimer-Laserablation für Wunden, die sich bis zum Stroma25 erstrecken). Die Verwendung eines Augengrats beschränkt den Fokus auf die epitheliale Reaktion auf die Wunde und sorgt für eine hochgradig reproduzierbare Wunde.
Wie bei jeder Methode der Wundzufügung hat die Verwendung eines Augengrats Vor- und Nachteile. Der Hauptnachteil ist, dass die Reaktion meist epithelisch ist und die Abschürfungen im klinischen Umfeld nicht perfekt widerspiegelt. Diese Methode hat jedoch zahlreiche Vorteile, einschließlich der Leichtigkeit, mit der sie eingerichtet und durchgeführt werden kann, ihrer Präzision, ihrer Reproduzierbarkeit und der Tatsache, dass sie nicht-invasiv ist, was sie zu einer Methode macht, die von Tieren gut vertragen wird.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5mm burr tips</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BU-5S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1M Tris, pH 8.8</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >adhesive tabs</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Algerbrush burr, Complete instrument</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BR2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton swaps</td>
			<td >Heinz Herenz Hamburg</td>
			<td >1030128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting plate</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting tools</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >double-distilled water</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppedorf tubes, 2ml</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A5040</td>
			<td>Caution: causes irritation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G7651</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lidocaine hydrochloride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >L5647</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounts</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G301P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >101VR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pH indicator strips</td>
			<td >Macherey-Nagel</td>
			<td >92110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic spoons</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 15 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 50 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scanning electron microscope</td>
			<td >FEI</td>
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zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis

Als transparente Oberfläche des Auges ist die Hornhaut für eine klare Sicht von entscheidender Bedeutung. Aufgrund seiner Lage ist dieses Gewebe anfällig für Umweltbeleidigungen. In der Tat sind die Augenverletzungen, die klinisch am häufigsten auftreten, die der Hornhaut. Während die Wundheilung der Hornhaut bei kleinen Säugetieren (dh Mäusen, Ratten und Kaninchen) ausführlich untersucht wurde, haben Studien zur Hornhautphysiologie andere Arten, einschließlich Zebrafische, vernachlässigt, obwohl Zebrafische ein klassisches Forschungsmodell sind.
Dieser Bericht beschreibt eine Methode zur Durchführung eines Hornhautabriebs an Zebrafischen. Die Wunde wird in vivo an betäubten Fischen mit einem Augengrat durchgeführt. Diese Methode ermöglicht eine reproduzierbare Epithelwunde, wobei der Rest des Auges intakt bleibt. Nach dem Abrieb wird der Wundverschluss im Laufe von 3 h überwacht, danach wird die Wunde reepithelialisiert. Mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie, gefolgt von der Bildverarbeitung, können die Epithelzellform und apikale Vorsprünge untersucht werden, um die verschiedenen Schritte während des Hornhautepithel-Wundverschlusses zu untersuchen.
Die Eigenschaften des Zebrafischmodells erlauben es, die Epithelgewebephysiologie und das kollektive Verhalten der Epithelzellen zu untersuchen, wenn das Gewebe herausgefordert wird. Darüber hinaus kann die Verwendung eines Modells, das des Einflusses des Tränenfilms beraubt ist, neue Antworten auf die Reaktion der Hornhaut auf Stress liefern. Schließlich ermöglicht dieses Modell auch die Abgrenzung der zellulären und molekularen Ereignisse, die an jedem Epithelgewebe beteiligt sind, das einer physischen Wunde ausgesetzt ist. Diese Methode kann auf die Bewertung der Arzneimittelwirksamkeit in präklinischen Tests angewendet werden.

Diese Studie beschreibt eine Methode mit einem ophthalmologischen Grat in Zebrafisch-Hornhaut-Wundheilungsexperimenten. Die Methode ist modifiziert gegenüber früheren Studien an Mäusen, bei denen gezeigt wurde, dass der Grat die Epithelzellschichten effizient13 entfernt. Zu den Herausforderungen bei der Hornhautverletzung von Zebrafischen gehören die relativ geringe Größe des Auges und im Falle zeitaufwendiger Experimente die Notwendigkeit, einen konstanten Wasserfluss durch die Kiemen aufre...

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Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Schädigung der Augenoberfläche von Zebrafischen durch Abrieb, um den anschließenden Wundverschluss auf zellulärer Ebene zu beurteilen. Dieser Ansatz nutzt einen Augengrat, um das Hornhautepithel teilweise zu entfernen, und verwendet Rasterelektronenmikroskopie, um Veränderungen in der Zellmorphologie während des Wundverschlusses zu verfolgen.

Zebrafisch-Hornhautwundheilung: Von der Abrieb- bis zur Wundverschluss-Bildgebungsanalyse

As the transparent surface of the eye, the cornea is instrumental for clear sight. Due to its location, this tissue is prone to environmental insults. ...

Die Transparenz der Hornhaut ist für eine klare Sicht von entscheidender Bedeutung. Im pathologischen Kontext kann diese Transparenz eine Herausforderung sein. Die Untersuchung des Pathogenesemechanismus erfordert einfache Modelle mit einer hohen Ähnlichkeit mit dem menschlichen Organ.In diesen Aspekten ist der Zebrafisch ein hervorragendes Modell. Und dies ist die erste detaillierte Beschreibung des Hornhautabriebs bei Zebrafischen. Diese Technik ist eine einfache und schnelle Möglichkeit, den Oberflächeneintritt in das Auge zu induzieren.Der Wundverschluss kann nach dem Abrieb leicht nachverfolgt werden. Auch Chemikalien oder spezifische Faktoren können dem Tankwasser hinzugefügt werden, um ihre Auswirkungen auf den Wundverschluss zu untersuchen. Da die Wunde manuell erstellt wird, erfordert die Methode etwas Übung, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.Bereiten Sie vor dem Experiment eine 0,02% ige Arbeitslösung von Tricain vor. Tauen Sie 2 ml 0,4%ige Lagerlösung auf. Fügen Sie zu 40 ml Systemwasser hinzu.Und legen Sie die Lösung in einen kleinen Behälter. Halten Sie den Augengrat bereit, indem Sie überprüfen, ob die Gratspitze sauber ist. Und wenn nötig, entfernen Sie Zellablagerungen mit einem feuchten Wattestäbchen.Machen Sie einen Schnitt an der Seite eines weichen Schwammes. Und befeuchten Sie den Schwamm mit Systemwasser. Legen Sie den Schwamm auf den Tisch eines Seziermikroskops.Stellen Sie sicher, dass genügend Arbeitsraum für die Verwendung des Grats vorhanden ist. Und genug Beleuchtung von der Seite und von oben, um die Augenoberfläche richtig zu sehen. Legen Sie den betäubten Fisch vorsichtig mit einem Löffel in den Schnitt auf dem Schwamm, wobei der Kopf aus der Schwammoberfläche herausragt.Nähern Sie sich vorsichtig der Augenoberfläche mit der Gratspitze. Und fangen Sie an, die Spitze auf der Augenoberfläche mit einer kreisförmigen Bewegung zu bewegen. Wenn der Abrieb abgeschlossen ist, legen Sie den Fisch vorsichtig in das frische Systemwasser, das Analgetika zur Erholung enthält.Reinigen Sie den Grat sofort nach Gebrauch mit einem feuchten Wattestäbchen. Nehmen Sie den Fisch zum gewünschten Zeitpunkt auf und legen Sie ihn in 0,02% ige Tricain-Lösung. Halten Sie das Tier in der Lösung, bis die operkuläre Bewegung vollständig aufgehört hat und der Fisch nicht auf Berührungen reagiert.Legen Sie den Fisch mit einem Löffel auf eine Petrischale und halten Sie ihn mit einer Pinzette. Enthaupten Sie den Fisch mit einer Sezierschere. Vermeiden Sie Kratzer auf der Augenoberfläche.Geben Sie das Gewebe in ein Probenröhrchen, das 0,1 M Natriumphosphat enthält. Und spülen Sie es mit einem sauberen Puffer ab, damit kein Blut in der Lösung verbleibt. Fixieren Sie das Gewebe in 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumphosphat für 24 Stunden bei 4 ° C. Entfernen Sie die Fixierlösung und spülen Sie die Probe mehrmals mit 0,1 M Natriumphosphat.Sezieren Sie die Probe, indem Sie sie auf einen Tropfen 0,1 M Natriumphosphat auf einer Sezierplatte legen. Schneiden Sie die Kopfprobe mit einer feinen Sezierschere in zwei Teile. Alternativ können Sie die Augen einsammeln, indem Sie die Spitzen einer feinen Pinzette von der Seite des Auges vorsichtig in die Augenhöhlen legen.Ziehen Sie dann das Auge aus der Augenhöhle und entfernen Sie zusätzliches Gewebe. Die sezierte Probe wird in ein Röhrchen mit 0,1 M Natriumphosphat überführt. Stellen Sie sicher, dass sich kein zusätzliches Gewebe im Probenröhrchen befindet, da es während der Probenverarbeitung an der Oberseite des Auges haften bleiben kann.Platzieren Sie die Halterung mit der Lasche auf einer Halterung. Und der Halter an der Basis eines Seziermikroskops. Legen Sie die Gewebeprobe vorsichtig mit einer feinen Pinzette auf die Montierung, die Hornhaut nach oben.Beschichten Sie die Probe mit dem entsprechenden Gerät mit Platin. Und lagern Sie die Proben bei Raumtemperatur bis zur Bildgebung. Erfassen Sie Bilder der gewünschten Vergrößerung.Und verwenden Sie 2000 bis 2500x Bilder für die Analyse. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast an, um alle Zellränder und Mikrokamme deutlich zu sehen. Und vermeiden Sie überbelichtete Bereiche im Bild.Öffnen Sie das TIFF-Bild mit Fiji ImageJ 1.53. Und verwenden Sie eine Skalierungsleiste, um die Skala einzustellen. Erstellen Sie mit dem Linienwerkzeug eine Linie, die der Maßstabsleiste entspricht.Wählen Sie Analysieren aus. Legen Sie dann die Skalierung fest. Und geben Sie in der bekannten Entfernung ein.Öffnen Sie dann den ROI-Manager über das Menü Analysieren, Extras. Für Zellgröße und Rundheit wählen Sie Analysieren, Messungen festlegen, Formdeskriptoren. Und verwenden Sie das Lupenwerkzeug, um die Zellen unter Vergrößerung zu sehen.Markieren Sie Zellen mit dem Polygon-Werkzeug und fügen Sie jede Auswahl dem ROI-Manager hinzu. Messen Sie abschließend die ausgewählten Zellen und speichern Sie die Messung. Um mit der Mikrokammanalyse fortzufahren, stellen Sie sicher, dass das Bild im 8-Bit-Format vorliegt, indem Sie auf das Menü Bild eingeben klicken.Wählen Sie dann die Zelle mit dem Polygon-Werkzeug aus. Und löschen Sie den Hintergrund, indem Sie auf Bearbeiten und dann auf Außerhalb löschen klicken. Glätten Sie das Bild ein- bis dreimal, indem Sie Verarbeiten, Glätten auswählen.Und passen Sie die Helligkeit und den Kontrast von Bild, Anpassen, Helligkeit / Kontrast an, so dass die Mikrokämme so deutlich wie möglich hervorstechen. Verdrehen Sie das Bild, indem Sie auf Verarbeiten, Filtern, Volvieren klicken. Und verwandeln Sie es in binär, indem Sie auf Prozess, Binär, Binär erstellen klicken.Skelettieren Sie dann das Schwarz-Weiß-Bild, indem Sie Verarbeiten, Binär, Skelettieren auswählen. Verwenden Sie die Funktion Analysiertes Skelett, um die Mikrokammparameter zu messen und die Werte zu speichern. Der Wundbereich ist drei Stunden nach der Wunde geschlossen.Aber die Stelle, an der die Wundgrenzen verbunden sind, bleibt sichtbar. Die Ergebnisse zeigten, dass auf abgeschliffenem Hornhautepithel Mikrokamme in einigen länglichen Zellen neben der Wundstelle beobachtet werden können. In einigen peripheren Regionen gehen die Mikrokämme aus dem Zentrum der Zelle verloren.Ein Vergleich zwischen den beiden peripheren Regionen zeigte längliche Zellen mit kürzeren durchschnittlichen Mikrokämmen, was auf Zellumlagerungen als Reaktion auf Wunden hinweist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Zellformänderungen mit der Mikrokammmodifikation korrelieren und die Heterogenität innerhalb des Hornhautepithels in der Wundreaktion betonen. Denken Sie daran, dass die Operation Training erfordert, um eine homogene und reproduzierbare Wunde durchzuführen.Neben der Elektronenmikroskopie kann das Gewebe für die Histologie, immunologische Färbungen und die In-situ-Hybridisierung verwendet werden. Diese werden weitere Einblicke in die Zelle und molekulare Veränderungen während der Wundheilung liefern. Die Verwendung von Zebrafisch erweitert unser Wissen über die Hornhautbiologie.Darüber hinaus eignet sich dieses Modell hervorragend für pharmakologische Studien und kann verwendet werden, um mehr über die Entwicklung der Augen zu erfahren.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

RNA Isolation aus embryonalen Zebrafisch und cDNA-Synthese für die Genexpressionsanalyse

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Forschung

Biologie

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Entwicklung von automatisierten Imaging und Analyse für Zebrafisch chemische Bildschirme.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Herstellung transgener Xenopus laevis Durch Restriktionsenzym-vermittelte Integration und Reaktorsicherheit Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Metabolic-Profil-Analyse von Zebrafischembryonen

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Verfahren zur Haut Verwundung und Assays für Wound Antworten in<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...