Name: zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis
Uploaded: 2022-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis at JoVE.com

המחברים מודים לפרטי פנולה על הגישה ליחידת דגי הזברה ולהנרי קויבולה על ההדרכה והעזרה בניסויי דגי הזברה. מחקר זה נתמך על ידי האקדמיה של פינלנד, קרן ג'יין ואטוס ארקו, קרן התרבות הפינית ותוכנית ATIP-Avenir. ההדמיה בוצעה ביחידת מיקרוסקופיית האלקטרונים וביחידת מיקרוסקופיית האור, המכון לביוטכנולוגיה, בתמיכת HiLIFE וביו סנטר פינלנד.

כל הניסויים אושרו על ידי המועצה הלאומית לניסויים בבעלי חיים.
1. הכנות
<ol><li>הכן את פתרון מניית tricaine המשמש להרדמה26 מראש (פתרון מלאי 0.4% המשמש בפרוטוקול זה). השתמש כפפות ולשמור את החומרים בברדס אדים במידת האפשר.<ol>
<li>עבור 50 מ"ל של פתרון 0.4%, לשקול 200 מ"ג של אבקת ...

<ol>
	<li>Baden, T., Euler, T., Berens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+retinal+basis+of+vision+across+species.">Understanding the retinal basis of vision across species.</a> Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).</li><li>Nishida, T., Saika, S., Morishige, N., Manis, M. J., Holland, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea+and+sclera:+Anatomy+and+physiology.">Cornea and sclera: Anatomy and physiology.</a> Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. , 1-22 (2017).</li><li>Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions+in+the+cornea.">Stromal-epithelial interactions in the cornea.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).</li><li>Wilson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+injury+induces+keratocyte+apoptosis:+hypothesized+role+for+the+interleukin-1+system+in+the+modulation+of+corneal+tissue+organization+and+wound+healing.">Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing.</a> Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).</li><li>Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+keratocyte+proliferation+in+response+to+epithelial+debridement.">Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement.</a> Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).</li><li>West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+keratocyte:+corneal+stromal+cell+with+variable+repair+phenotypes.">The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).</li><li>Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+abrasions+and+corneal+foreign+bodies.">Corneal abrasions and corneal foreign bodies.</a> Primary Care. 42 (3), 363-375 (2015).</li><li>Ben-Eli, H., Erdinest, N., Solomon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+complications+of+chronic+eye+rubbing+in+ocular+allergy.">Pathogenesis and complications of chronic eye rubbing in ocular allergy.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 19 (5), 526-534 (2019).</li><li>Wilson, S. A., Last, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+corneal+abrasions.">Management of corneal abrasions.</a> American Family Physician. 70 (1), 123-128 (2004).</li><li>Nagata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBP485+promotes+corneal+epithelial+wound+healing.">JBP485 promotes corneal epithelial wound healing.</a> Scientific Reports. 5, 14776 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MANF+promotes+diabetic+corneal+epithelial+wound+healing+and+nerve+regeneration+by+attenuating+hyperglycemia-induced+endoplasmic+reticulum+stress.">MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress.</a> Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).</li><li>Li, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+AlgerBrush+II+rotating+burr+as+a+tool+for+inducing+ocular+surface+failure+in+the+New+Zealand+White+rabbit.">Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit.</a> Experimental Eye Research. 147, 1-11 (2016).</li><li>Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+abrasion+with+ocular+burr+as+a+model+for+cornea+wound+healing.">Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (137), e58071 (2018).</li><li>Kalha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1++progenitor+cell+dynamics+in+murine+cornea+during+homeostasis+and+wound+healing.">Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing.</a> Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).</li><li>Park, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+contribution+of+keratin-14(+)+limbal+epithelial+precursors+in+corneal+wound+healing.">Visualizing the contribution of keratin-14(+) limbal epithelial precursors in corneal wound healing.</a> Stem Cell Reports. 12 (1), 14-28 (2019).</li><li>Kuony, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodysplasin-A+signaling+is+a+key+integrator+in+the+lacrimal+gland-cornea+feedback+loop.">Ectodysplasin-A signaling is a key integrator in the lacrimal gland-cornea feedback loop.</a> Development. 146 (14), (2019).</li><li>Farrelly, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+live+imaging+of+single+corneal+stem+cells+reveals+compartmentalized+organization+of+the+limbal+niche.">Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).</li><li>Ikkala, K., Michon, F., Stratoulias, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+Zebrafish+corneal+injury+induces+bilateral+cell+plasticity+supporting+wound+closure.">Unilateral Zebrafish corneal injury induces bilateral cell plasticity supporting wound closure.</a> Scientific Reports. , (2021).</li><li>Ormerod, L. D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+models+of+corneal+injury+using+alkali-immersed+filter+discs.">Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).</li><li>Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alkali-burn+injury+model+of+corneal+neovascularization+in+the+mouse.">An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159 (2014).</li><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+modeling+of+corneal+alkali+injury+in+the+rat+eye.">Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye.</a> Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).</li><li>Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+chemical+injuries+and+their+management.">Ocular chemical injuries and their management.</a> Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).</li><li>Pal-Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BALB/c+and+C57BL6+mouse+strains+vary+in+their+ability+to+heal+corneal+epithelial+debridement+wounds.">BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds.</a> Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).</li><li>Chen, J. J., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+corneal+epithelial+wound+healing+in+partial-thickness+removal+of+limbal+epithelium.">Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).</li><li>Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGTA+in+corneal+wound+healing+after+transepithelial+laser+ablation+in+a+rabbit+model:+a+randomized,+blinded,+placebo-controlled+study.">RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).</li><li>. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio Available from: <a target="_blank" href="https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html">https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> (2000)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+wound+closure+in+the+rabbit+cornea.+A+biphasic+process.">Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).</li><li>Parlanti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+debris+accumulates+in+corneal+epithelial+cells+after+intraepithelial+corneal+nerves+are+damaged:+A+focused+Ion+Beam+Scanning+Electron+Microscopy+(FIB-SEM)+study.">Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study.</a> Experimental Eye Research. 194, 107998 (2020).</li><li>Zhao, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+cornea:+structure+and+development.">The zebrafish cornea: structure and development.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).</li><li>Richardson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-epithelialization+of+cutaneous+wounds+in+adult+zebrafish+combines+mechanisms+of+wound+closure+in+embryonic+and+adult+mammals.">Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals.</a> Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).</li><li>van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+contraction+drives+the+3D+patterning+of+epithelial+cell+surfaces.">Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration+in+zebrafish.">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).</li><li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirt6+deficiency+impairs+corneal+epithelial+wound+healing.">Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing.</a> Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).</li><li>Ksander, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCB5+is+a+limbal+stem+cell+gene+required+for+corneal+development+and+repair.">ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair.</a> Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li></ol>

פציעות גופניות בקרנית הן הגורם הנפוץ ביותר לביקורי חולי עיניים בבית החולים. לכן, חשוב להקים מודלים רלוונטיים לחקר היבטים שונים של פתולוגיה הקרנית. עד כה, העכבר הוא המודל הנפוץ ביותר לחקר ריפוי פצעי הקרנית. עם זאת, הוספת טיפות עיניים על עיניים פגועות מורין כדי לאמת את ההשפעה של תרופות ספציפ?...

כמו רוב האפיתליה נמצאים במגע עם הסביבה החיצונית, הם נוטים לפגיעה גופנית, מה שהופך אותם מתאימים היטב לחקר תהליכי ריפוי הפצע. בין הרקמות הנחקרות היטב, הקרנית היא מודל שימושי ביותר בחקירת ההיבטים התאיים והמולקולריים של ריפוי פצעים. כמשטח חיצוני שקוף, הוא מספק הגנה פיזית לעין והוא האלמנט הראשון שממקד את האור ברשתית. בעוד המבנה והרכב התאים של הרשתית שונים בין מינים1, יסודות אלה של הקרנית דומים בדרך כלל בכל העיניים מסוג המצלמה, ללא קשר למינים.
הקרנית מורכבת משלוש שכבות עיקריות2. השכבה הראשונה והחיצונית ביותר היא האפיתל, המתחדש כל הזמן כדי להבטיח את שקיפותו. השכבה השנייה היא הסטרומה, המכילה תאים מפוזרים, הנקראים קרטוציטים, בתוך שכבה עבה של סיבי קולגן מאורגנים בקפדנות. השכבה השלישית והפנימית ביותר היא האנדותל, המאפשרת דיפוזיה תזונתית ונוזלית מהתא הקדמי לשכבות החיצוניות. תאי האפיתל והסטרומליים מתקשרים באמצעות גורמי גדילה וציטוקינים3. אינטראקציה זו מודגשת על ידי אפופטוזיס מהירה והתפשטות עוקבת של קרטוציטים לאחר פגיעה אפיתל 4,5. במקרה של פצע עמוק יותר, כגון ניקוב, קרטוציטים לוקחים חלק פעיל בתהליך הריפוי6.
להיות במגע עם הסביבה החיצונית, פציעות פיזיות הקרנית שכיחות. רבים מהם נגרמים על ידי חפצים זרים קטנים7, כגון חול או אבק. הרפלקס של שפשוף העיניים יכול להוביל לשריטות אפיתל נרחבות ושיפוץ הקרנית8. על פי גודל הפצע ועומקו, פציעות פיזיות אלה כואבות ולוקח כמה ימים לרפא9. מאפייני ריפוי הפצע האופטימליים של מודל מקלים על הבנת ההיבטים התאיים והמולקולריים של סגירת הפצע. יתר על כן, מודלים כאלה הוכיחו גם שימושי לבדיקת מולקולות חדשות עם פוטנציאל להאיץ את ריפוי הקרנית, כפי שהוכח בעבר10,11.
הפרוטוקול המתואר כאן נועד להשתמש בדגי זברה כמודל רלוונטי לחקר פגיעה גופנית בקרנית. מודל זה נוח מאוד למחקרי סינון פרמקולוגיים שכן הוא מאפשר להוסיף מולקולות ישירות למי הטנק, ולכן, לבוא במגע עם קרנית מרפאת. הפרטים המפורטים כאן יסייעו למדענים לבצע את מחקריהם על מודל דגי הזברה. הפציעה in vivo מבוצעת עם בר עיני קהה. ניתן לנתח את ההשפעה על תאי האפיתל הסמוכים או במרחק ממנו על ידי הסרה ספציפית של אפיתל הקרנית המרכזי. בשנים האחרונות, דיווחים רבים התמקדו בשיטה כזו על קרנית מכרסמים 12,13,14,15,16,17; עם זאת, עד כה, רק דו"ח אחד יישם שיטה זו על דגי זברה18.
בגלל הפשטות שלה, הפצע הפיזי שימושי בתיחום התפקיד של תאי אפיתל בסגירת הפצע. מודל מבוסס נוסף של פגיעה בקרנית הוא הכוויה הכימית, במיוחד לשרוף אלקלי 19,20,21. עם זאת, גישה כזו פוגעת בעקיפין בכל פני השטח של העין, כולל הקרנית ההיקפית וסטרומה הקרנית19. ואכן, כוויות אלקלי עלולות לגרום לכיבים בקרנית, ניקובים, אטימות אפיתל וניאווסקולריזציה מהירה22, והתוצאה הבלתי נשלטת של כוויות אלקליות פוסלת גישה זו למחקרי ריפוי פצעים כלליים. שיטות רבות אחרות משמשות גם כדי לחקור ריפוי פצעי קרנית על פי המוקד המסוים של המחקר המדובר (למשל, פסולת אפיתל מלאה23, שילוב של פגיעה כימית ומכאנית עבור פצעבעובי חלקי 24, אבלציה לייזר excimer עבור פצעים המשתרעים על סטרומה25). השימוש בבר עיני מגביל את המוקד לתגובת האפיתל לפצע ומספק פצע רב לשחזור.
כמו בכל שיטה של גרימת פצע, השימוש בר עינית יש יתרונות וחסרונות. החיסרון העיקרי הוא כי התגובה להיות בעיקר אפיתל, זה לא משקף באופן מושלם את השריטות לראות בסביבה הקלינית. עם זאת, לשיטה זו יש יתרונות רבים, כולל הקלות שבה ניתן להגדיר ולבצע אותה, הדיוק שלה, הרבייה שלה, והעובדה שהיא לא פולשנית, מה שהופך אותה לשיטה נסבלת היטב על ידי בעלי חיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5mm burr tips</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BU-5S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1M Tris, pH 8.8</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >adhesive tabs</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Algerbrush burr, Complete instrument</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BR2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton swaps</td>
			<td >Heinz Herenz Hamburg</td>
			<td >1030128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting plate</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting tools</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >double-distilled water</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppedorf tubes, 2ml</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A5040</td>
			<td>Caution: causes irritation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G7651</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lidocaine hydrochloride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >L5647</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounts</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G301P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >101VR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pH indicator strips</td>
			<td >Macherey-Nagel</td>
			<td >92110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic spoons</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 15 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 50 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scanning electron microscope</td>
			<td >FEI</td>
			<td >Quanta 250 FEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Soft sponge</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sputter coater</td>
			<td >Quorum Technologies</td>
			<td >GQ150TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereomicroscope</td>
			<td >Leica</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis

כמשטח השקוף של העין, הקרנית היא אינסטרומנטלית לראייה ברורה. בשל מיקומו, רקמה זו נוטה עלבונות סביבתיים. ואכן, פציעות העיניים הנתקלות לעתים קרובות ביותר מבחינה קלינית הן אלה לקרנית. בעוד שריפוי פצעי קרנית נחקר בהרחבה ביונקים קטנים (כלומר, עכברים, חולדות וארנבות), מחקרים בפיזיולוגיה של הקרנית הזניחו מינים אחרים, כולל דגי זברה, למרות שדגי זברה הם מודל מחקר קלאסי.
דו"ח זה מתאר שיטה לביצוע שחיקה בקרנית על דגי זברה. הפצע מבוצע ב vivo על דגים מרדימים באמצעות בר עינית. שיטה זו מאפשרת פצע אפיתל לשחזור, משאיר את שאר העין ללא פגע. לאחר שחיקה, סגירת הפצע מנוטרת במהלך 3 שעות, ולאחר מכן הפצע הוא reepithelialized. באמצעות סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, ואחריו עיבוד תמונה, צורת תא האפיתל, בליטות apical ניתן לחקור כדי לחקור את השלבים השונים במהלך סגירת פצע אפיתל הקרנית.
המאפיינים של מודל דגי הזברה מאפשרים לחקור את הפיזיולוגיה של רקמת האפיתל ואת ההתנהגות הקולקטיבית של תאי האפיתל כאשר הרקמה מאותגרת. יתר על כן, השימוש במודל שנמנע מהשפעת סרט הדמעות יכול לייצר תשובות חדשות לגבי תגובת הקרנית ללחץ. לבסוף, מודל זה מאפשר גם את התיחום של האירועים התאיים והמולקולריים המעורבים בכל רקמת אפיתל הנתונה לפצע פיזי. שיטה זו יכולה להיות מיושמת להערכה של יעילות התרופה בבדיקות פרה קליניות.

מחקר זה מתאר שיטה באמצעות בר עיניים בניסויי ריפוי פצעי קרנית דגי זברה. השיטה משתנה ממחקרים קודמים על עכברים, שם הוכח כי הבר מסיר את שכבות תאי האפיתל ביעילות13. האתגרים בפציעת קרנית דגי הזברה כוללים את גודלה הקטן יחסית של העין, ובמקרה של ניסויים הגוזלים זמן רב, הצורך לשמור על זרי?...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis at JoVE.com

Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis

פרוטוקול זה מתמקד בפגיעה במשטח העין של דגי הזברה באמצעות שחיקה כדי להעריך את סגירת הפצעים הבאים ברמה התאית. גישה זו מנצלת בר עיני כדי להסיר חלקית את אפיתל הקרנית ומשתמשת במיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת כדי לעקוב אחר שינויים במורפולוגיה של התא במהלך סגירת הפצע.

ריפוי פצעים בקרנית דגי זברה: משחיקה לניתוח הדמיה לסגירת פצעים

As the transparent surface of the eye, the cornea is instrumental for clear sight. Due to its location, this tissue is prone to environmental insults. ...

שקיפות קרנית היא אינסטרומנטלית כדי לנקות את הראייה. בהקשר פתולוגי, שקיפות זו יכולה להיות אתגר. לימוד מנגנון פתוגנזה דורש מודלים פשוטים בעלי דמיון גבוה לאיבר האנושי.בהיבטים אלה, דגי זברה הם מודל מצוין. וזה התיאור המפורט הראשון של שחיקה בקרנית בדגי זברה. טכניקה זו היא דרך פשוטה ומהירה לגרום לכניסה לפני השטח לעין.ניתן לעקוב אחר סגירת הפצע בקלות לאחר שחיקה. כמו כן, כימיקלים, או גורמים ספציפיים, ניתן להוסיף למי הטנק כדי ללמוד את השפעתם על סגירת הפצע. כמו הפצע נוצר באופן ידני, השיטה דורשת קצת תרגול כדי להשיג תוצאות עקביות.לפני הניסוי, הכן פתרון עבודה של 0.02%. להפשיר 2 מ"ל של 0.4% פתרון מניות. מוסיפים ל-40 מ"ל של מי מערכת.ומניחים את הפתרון במיכל קטן. הכינו את בר העיניים על ידי בדיקה אם קצה הבר נקי. ואם יש צורך, להסיר פסולת תאים עם צמר גפן לח.בצע חתך בצד של ספוג רך. ולהרטיב את הספוג עם מי מערכת. מניחים את הספוג על הבמה של מיקרוסקופ מנתח.ודאו מספיק מקום עבודה לשימוש בבר. ומספיק הארה מהצד ומעלה כדי לראות את פני השטח של העין בצורה נכונה. מניחים בעדינות את הדג מרדים עם כף לתוך החתך על הספוג עם הראש בולט מפני השטח ספוג.בזהירות להתקרב לפני השטח של העין עם קצה הבר. ולהתחיל להזיז את הקצה על פני השטח של העין בתנועה מעגלית. כאשר השחיקה נעשית, בזהירות למקם את הדגים במי המערכת הטריים המכילים משכך כאבים להתאוששות.יש לנקות את הבר מיד לאחר השימוש עם צמר גפן לח. הרם את הדג בנקודת הזמן הרצויה ומקם אותו בתמיסת 0.02%tricaine. שמור על החיה בתמיסה עד שהתנועה האופרקולרית תיפסק לחלוטין והדגים לא יגיבו למגע.מניחים את הדג על צלחת פטרי עם כפית, ומחזיקים אותו עם פינצטה. לערוף את ראשם של הדגים עם מספריים מנתחים. הימנע ביצוע שריטות על פני השטח של העין.שים את הרקמה לתוך צינור מדגם המכיל 0.1 M נתרן פוספט. ולשטוף אותו עם חיץ נקי, כך שאין דם נשאר בתמיסה. לתקן את הרקמה ב 2.5% glutaraldehyde ב 0.1 M נתרן פוספט במשך 24 שעות ב 4 C.הסר את פתרון התיקון ולשטוף את המדגם מספר פעמים עם 0.1 M נתרן פוספט.לנתח את המדגם על ידי הצבתו על טיפה של 0.1 M נתרן פוספט על צלחת ניתוח. חותכים את דגימת הראש לשניים עם מספריים מנתחים עדינים. לחלופין, לאסוף את העיניים על ידי הצבת בזהירות את קצות פינצטה בסדר לתוך ארובות העין מצד העין.לאחר מכן, לשלוף את העין מן השקע ולהסיר רקמה נוספת. העבר את הדגימה המנותחת לתוך צינור המכיל 0.1 M נתרן פוספט. ודא שאין רקמה נוספת בצינור המדגם, כפי שהוא עשוי לדבוק בחלק העליון של העין במהלך עיבוד מדגם.מקם את הטעינה עם הכרטיסייה על מחזיק. והמחזיק בבסיס של מיקרוסקופ מנתח. מניחים בעדינות את דגימת הרקמה על ההר עם פינצטה עדינה, קרנית פונה כלפי מעלה.מצופה את הדגימה בפלטינה באמצעות המכשיר המתאים. ולאחסן את הדגימות בטמפרטורת החדר עד הדמיה. השג תמונות של ההגדלה הרצויה.ולהשתמש תמונות 2000 עד 2500x לניתוח. התאם את הבהירות והניגודיות כדי לראות בבירור את כל גבולות התא והמיקרו-רידג'ים. והימנעו מחשיפת יתר של אזורים בתמונה.פתח את תמונת TIFF עם פיג'י ImageJ 1.53. והשתמש בסרגל קנה מידה כדי להגדיר את קנה המידה. צרו קו השווה לסרגל קנה המידה בעזרת הכלי קו.בחר נתח. לאחר מכן, הגדר קנה מידה. והקלד את המרחק הידוע.לאחר מכן, פתח את מנהל ההחזר על ההשקעה באמצעות תפריט ניתוח, כלים. עבור גודל התא והעגלות, בחר נתח, הגדר מידות, מתארי צורה. והשתמשו בכלי זכוכית מגדלת כדי לראות את התאים תחת הגדלה.בחרו תאים בעזרת הכלי מצולע והוסיפו כל בחירה למנהל ההחזר על ההשקעה. לבסוף, מדוד את התאים שנבחרו ושמור את המדידה. כדי להמשיך בניתוח microridge, ודא שהתמונה היא בתבנית של 8 סיביות על-ידי לחיצה על תפריט תמונה, סוג.לאחר מכן, בחרו בתא בעזרת הכלי מצולע. ונקה את הרקע על-ידי לחיצה על ערוך ולאחר מכן נקה בחוץ. החלק את התמונה פעם עד שלוש פעמים על-ידי בחירה באפשרות 'תהליך', 'החלק'.והתאמו את הבהירות והניגודיות מ-Image, Adjust, Brightness/Contrast, כך שהמיקרו-רידג'ים יבלטו בצורה ברורה ככל האפשר. סובב את התמונה על ידי לחיצה על תהליך, מסננים, סובבים. ולהפוך אותו בינארי על ידי לחיצה על תהליך, בינארי, הפוך בינארי.לאחר מכן, שלד את התמונה בשחור לבן על-ידי בחירת תהליך, בינארי, שלד. השתמש בפונקציה שלד מנותח כדי למדוד את הפרמטרים microridge ולשמור את הערכים. אזור הפצע סגור בשלוש שעות לאחר הפציעה.אבל האתר שבו גבולות הפצע מחוברים נשאר גלוי. התוצאות הראו כי על מיקרורידיום אפיתל הקרנית משופשף ניתן לראות בכמה תאים מוארכים ליד אתר הפצע. באזורים היקפיים מסוימים, המיקרורכסים הולכים לאיבוד ממרכז התא.השוואה בין שני האזורים ההיקפיים, הראתה תאים מוארכים עם מיקרורידג'ים ממוצעים קצרים יותר, מה שמצביע על סידור מחדש של תאים כתגובה לפציעה. תוצאות אלה מצביעות על כך ששינויים בצורת התא מתואמים עם שינוי מיקרורידג ' ומדגישים את ההטרוגניות בתוך אפיתל הקרנית בתגובת הפצע. זכור כי הניתוח דורש אימון כדי לבצע פצע הומוגני לשחזור.בנוסף למיקרוסקופיה אלקטרונית, הרקמה יכולה לשמש להיסטולוגיה, כתמים אימונולוגיים והכלבה במקום. אלה יספקו תובנה נוספת בתא ושינויים מולקולריים במהלך ריפוי הפצע. שימוש בדגי זברה מרחיב את הידע שלנו בביולוגיה של הקרנית.יתר על כן, מודל זה מצוין למחקרים פרמקולוגיים, וניתן להשתמש בו כדי להבין יותר על התפתחות העין.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

RNA סינתזה ניתוק מן דג הזברה cDNA עובריים עבור ניתוח ביטוי גנים

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

הדמיה חיה של שחול Cell מן האפידרמיס של דג הזברה פיתוח

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

ניתוח של עוברי וזחל myofibers שלד דג הזברה מהכנות ניתקו

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

שיטות לעור פציעה ומבחנים לתגובות פצע ב<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...