Name: zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis
Uploaded: 2022-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis at JoVE.com

Gli autori ringraziano Pertti Panula per l'accesso all'unità Zebrafish e Henri Koivula per la guida e l'aiuto con gli esperimenti di zebrafish. Questa ricerca è stata sostenuta dall'Accademia di Finlandia, dalla Fondazione Jane e Aatos Erkko, dalla Fondazione culturale finlandese e dal programma ATIP-Avenir. L'imaging è stato eseguito presso l'unità di microscopia elettronica e l'unità di microscopia ottica, Istituto di biotecnologia, supportato da HiLIFE e Biocenter Finland.

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal consiglio nazionale per gli esperimenti sugli animali.
1. Preparativi
<ol><li>Preparare in anticipo la soluzione madre di tricaina utilizzata per l'anestesia26 (soluzione madre allo 0,4% utilizzata in questo protocollo). Utilizzare guanti e tenere i materiali in una cappa aspirante quando possibile.<ol>
<li>Per 50 ml di una soluzione allo 0,4%, pesare 200 mg di polvere di tricaina in un tubo da 50 ml. Sci...

<ol>
	<li>Baden, T., Euler, T., Berens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+retinal+basis+of+vision+across+species.">Understanding the retinal basis of vision across species.</a> Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).</li><li>Nishida, T., Saika, S., Morishige, N., Manis, M. J., Holland, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea+and+sclera:+Anatomy+and+physiology.">Cornea and sclera: Anatomy and physiology.</a> Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. , 1-22 (2017).</li><li>Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. 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D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+models+of+corneal+injury+using+alkali-immersed+filter+discs.">Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).</li><li>Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alkali-burn+injury+model+of+corneal+neovascularization+in+the+mouse.">An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159 (2014).</li><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+modeling+of+corneal+alkali+injury+in+the+rat+eye.">Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye.</a> Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).</li><li>Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+corneal+epithelial+wound+healing+in+partial-thickness+removal+of+limbal+epithelium.">Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).</li><li>Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGTA+in+corneal+wound+healing+after+transepithelial+laser+ablation+in+a+rabbit+model:+a+randomized,+blinded,+placebo-controlled+study.">RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).</li><li>. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio Available from: <a target="_blank" href="https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html">https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> (2000)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+cornea:+structure+and+development.">The zebrafish cornea: structure and development.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).</li><li>Richardson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-epithelialization+of+cutaneous+wounds+in+adult+zebrafish+combines+mechanisms+of+wound+closure+in+embryonic+and+adult+mammals.">Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals.</a> Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).</li><li>van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration+in+zebrafish.">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).</li><li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirt6+deficiency+impairs+corneal+epithelial+wound+healing.">Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing.</a> Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).</li><li>Ksander, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCB5+is+a+limbal+stem+cell+gene+required+for+corneal+development+and+repair.">ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair.</a> Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li></ol>

Le lesioni fisiche corneali sono la causa più comune di visite dei pazienti oftalmologici in ospedale. Pertanto, è importante stabilire modelli pertinenti per lo studio di diversi aspetti della fisiopatologia corneale. Finora, il topo è il modello più comunemente usato per lo studio della guarigione delle ferite corneali. Tuttavia, l'aggiunta di colliri sugli occhi feriti murini per convalidare l'impatto di farmaci specifici sulla guarigione delle ferite corneali può essere difficile. A questo proposito, il modello ...

Poiché la maggior parte degli epiteli sono a contatto con l'ambiente esterno, sono soggetti a lesioni fisiche, rendendoli adatti per lo studio dei processi di guarigione delle ferite. Tra i tessuti ben studiati, la cornea è un modello estremamente utile nello studio degli aspetti cellulari e molecolari della guarigione delle ferite. Come superficie esterna trasparente, fornisce protezione fisica all'occhio ed è il primo elemento a focalizzare la luce sulla retina. Mentre la struttura e la composizione cellulare della retina differiscono tra la specie1, questi elementi della cornea sono generalmente simili in tutti gli occhi di tipo camera, indipendentemente dalla specie.
La cornea è composta da tre strati principali2. Il primo e più esterno strato è l'epitelio, che viene costantemente rinnovato per garantirne la trasparenza. Il secondo strato è lo stroma, che contiene cellule sparse, chiamate cheratociti, all'interno di uno spesso strato di fibre di collagene rigorosamente organizzate. Il terzo e più interno strato è l'endotelio, che consente la diffusione di nutrienti e liquidi dalla camera anteriore agli strati esterni. Le cellule epiteliali e stromali interagiscono attraverso fattori di crescita e citochine3. Questa interazione è evidenziata dalla rapida apoptosi e dalla successiva proliferazione dei cheratociti dopo danno epiteliale 4,5. In caso di una ferita più profonda, come una puntura, i cheratociti prendono parte attiva al processo di guarigione6.
Essendo a contatto con l'ambiente esterno, le lesioni fisiche corneali sono comuni. Molti di loro sono causati da piccoli oggetti estranei7, come sabbia o polvere. Il riflesso dello sfregamento degli occhi può portare a estese abrasioni epiteliali e rimodellamento corneale8. Secondo le dimensioni e la profondità della ferita, queste lesioni fisiche sono dolorose e richiedono diversi giorni per guarire9. Le caratteristiche ottimali di guarigione delle ferite di un modello facilitano la comprensione degli aspetti cellulari e molecolari della chiusura della ferita. Inoltre, tali modelli si sono dimostrati utili anche per testare nuove molecole con il potenziale di accelerare la guarigione corneale, come precedentemente dimostrato10,11.
Il protocollo qui descritto mira a utilizzare il pesce zebra come modello rilevante per studiare le lesioni fisiche corneali. Questo modello è molto conveniente per gli studi di screening farmacologico in quanto consente di aggiungere molecole direttamente all'acqua del serbatoio e, quindi, di entrare in contatto con una cornea curativa. I dettagli forniti qui aiuteranno gli scienziati a eseguire i loro studi sul modello di zebrafish. La lesione in vivo viene eseguita con una bava oculare opaca. L'impatto sulle cellule epiteliali adiacenti o a distanza da esso può essere analizzato rimuovendo specificamente l'epitelio corneale centrale. Negli ultimi anni, numerosi rapporti si sono concentrati su tale metodo sulla cornea dei roditori 12,13,14,15,16,17; tuttavia, ad oggi, solo un singolo rapporto ha applicato questo metodo al pesce zebra18.
A causa della sua semplicità, la ferita fisica è utile per delineare il ruolo delle cellule epiteliali nella chiusura della ferita. Un altro modello ben consolidato di danno corneale è l'ustione chimica, in particolare l'ustione alcalina 19,20,21. Tuttavia, un tale approccio danneggia indirettamente l'intera superficie oculare, compresa la cornea periferica e lo stroma corneale19. In effetti, le ustioni alcaline potenzialmente inducono ulcere corneali, perforazioni, opacizzazione epiteliale e rapida neovascolarizzazione22, e l'esito incontrollabile delle ustioni alcaline squalifica tale approccio per gli studi generali di guarigione delle ferite. Numerosi altri metodi sono utilizzati anche per studiare la guarigione delle ferite corneali secondo il particolare focus dello studio in questione (ad esempio, debridement epiteliale completo23, la combinazione di lesioni chimiche e meccaniche per ferite a spessore parziale24, ablazione laser ad eccimeri per ferite che si estendono allo stroma25). L'uso di una bava oculare limita il punto focale alla risposta epiteliale alla ferita e fornisce una ferita altamente riproducibile.
Come con ogni metodo di inflizione della ferita, l'uso di una bava oculare presenta vantaggi e svantaggi. Lo svantaggio principale è che la risposta essendo per lo più epiteliale, non riflette perfettamente le abrasioni osservate in ambito clinico. Tuttavia, questo metodo presenta numerosi vantaggi, tra cui la facilità con cui può essere impostato ed eseguito, la sua precisione, la sua riproducibilità e il fatto che non sia invasivo, rendendolo un metodo ben tollerato dagli animali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5mm burr tips</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BU-5S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1M Tris, pH 8.8</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >adhesive tabs</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Algerbrush burr, Complete instrument</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BR2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton swaps</td>
			<td >Heinz Herenz Hamburg</td>
			<td >1030128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting plate</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting tools</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >double-distilled water</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppedorf tubes, 2ml</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A5040</td>
			<td>Caution: causes irritation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G7651</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lidocaine hydrochloride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >L5647</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounts</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G301P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >101VR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pH indicator strips</td>
			<td >Macherey-Nagel</td>
			<td >92110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic spoons</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 15 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 50 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >227261</td>
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			<td >Scanning electron microscope</td>
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zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis

Come la superficie trasparente dell'occhio, la cornea è strumentale per la visione chiara. A causa della sua posizione, questo tessuto è soggetto a insulti ambientali. In effetti, le lesioni oculari più frequentemente riscontrate clinicamente sono quelle alla cornea. Mentre la guarigione delle ferite corneali è stata ampiamente studiata nei piccoli mammiferi (cioè topi, ratti e conigli), gli studi di fisiologia corneale hanno trascurato altre specie, incluso il pesce zebra, nonostante il pesce zebra sia un classico modello di ricerca.
Questo rapporto descrive un metodo per eseguire un'abrasione corneale sul pesce zebra. La ferita viene eseguita in vivo su pesci anestetizzati utilizzando una bava oculare. Questo metodo consente una ferita epiteliale riproducibile, lasciando intatto il resto dell'occhio. Dopo l'abrasione, la chiusura della ferita viene monitorata nel corso di 3 ore, dopo di che la ferita viene rielettileializzata. Utilizzando la microscopia elettronica a scansione, seguita dall'elaborazione delle immagini, la forma della cellula epiteliale e le protrusioni apicali possono essere studiate per studiare i vari passaggi durante la chiusura della ferita epiteliale corneale.
Le caratteristiche del modello zebrafish consentono lo studio della fisiologia del tessuto epiteliale e del comportamento collettivo delle cellule epiteliali quando il tessuto viene sfidato. Inoltre, l'uso di un modello privato dell'influenza del film lacrimale può produrre nuove risposte per quanto riguarda la risposta corneale allo stress. Infine, questo modello permette anche la delineazione degli eventi cellulari e molecolari coinvolti in qualsiasi tessuto epiteliale sottoposto ad una ferita fisica. Questo metodo può essere applicato alla valutazione dell'efficacia del farmaco nei test preclinici.

Questo studio descrive un metodo che utilizza una bava oftalmica in esperimenti di guarigione delle ferite corneali zebrafish. Il metodo è stato modificato da studi precedenti sui topi, dove la bava ha dimostrato di rimuovere gli strati cellulari epiteliali in modo efficiente13. Le sfide nel ferimento corneale del pesce zebra includono le dimensioni relativamente piccole dell'occhio e, nel caso di esperimenti che richiedono tempo, la necessità di mantenere un flusso d'acqua costante attraverso l...

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Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis

Questo protocollo si concentra sul danneggiamento della superficie oculare del pesce zebra attraverso l'abrasione per valutare la successiva chiusura della ferita a livello cellulare. Questo approccio sfrutta una bava oculare per rimuovere parzialmente l'epitelio corneale e utilizza la microscopia elettronica a scansione per tracciare i cambiamenti nella morfologia cellulare durante la chiusura della ferita.

Zebrafish Corneal Wound Healing: dall'abrasione all'analisi di imaging della chiusura della ferita

As the transparent surface of the eye, the cornea is instrumental for clear sight. Due to its location, this tissue is prone to environmental insults. ...

La trasparenza corneale è strumentale alla visione chiara. In un contesto patologico, questa trasparenza può essere una sfida. Studiare il meccanismo di patogenesi richiede modelli semplici che abbiano un'elevata somiglianza con l'organo umano.In questi aspetti, il pesce zebra è un modello eccellente. E questa è la prima descrizione dettagliata dell'abrasione corneale nel pesce zebra. Questa tecnica è un modo semplice e veloce per indurre l'ingresso superficiale all'occhio.La chiusura della ferita può essere seguita facilmente dopo l'abrasione. Inoltre, sostanze chimiche, o fattori specifici, possono essere aggiunti all'acqua del serbatoio per studiare il loro impatto sulla chiusura della ferita. Poiché la ferita viene creata manualmente, il metodo richiede un po 'di pratica per ottenere risultati coerenti.Prima dell'esperimento, preparare una soluzione di lavoro allo 0,02% di tricaina. Scongelare 2 ml di soluzione madre allo 0,4%. Aggiungere a 40 ml di acqua di sistema.E metti la soluzione in un piccolo contenitore. Avere la bava oftalmica pronta controllando se la punta della bava è pulita. E se necessario, rimuovere i detriti cellulari con un batuffolo di cotone umido.Fai un'incisione sul lato di una spugna morbida. E inumidire la spugna con acqua di sistema. Posizionare la spugna sul palco di un microscopio di dissezione.Garantire uno spazio di lavoro sufficiente per l'utilizzo della bava. E abbastanza illuminazione dal lato e sopra per vedere correttamente la superficie dell'occhio. Posizionare delicatamente il pesce anestetizzato con un cucchiaio nell'incisione sulla spugna con la testa sporgente dalla superficie della spugna.Avvicinarsi con attenzione alla superficie dell'occhio con la punta della bava. E inizia a muovere la punta sulla superficie dell'occhio con un movimento circolare. Quando l'abrasione è fatta, posizionare con cura il pesce nell'acqua del sistema fresco contenente analgesico per il recupero.Pulire la bava immediatamente dopo l'uso con un batuffolo di cotone umido. Raccogliere il pesce nel punto temporale desiderato e metterlo in soluzione di tricaina allo 0,02%. Tenere l'animale nella soluzione fino a quando il movimento opercolare non è cessato completamente e il pesce non reagisce al tatto.Metti il pesce su una capsula di Petri con un cucchiaio e tienilo con una pinzetta. Decapitare il pesce con le forbici sezionanti. Evitare di fare graffi sulla superficie dell'occhio.Mettere il tessuto in una provetta contenente 0,1 M fosfato di sodio. E risciacquarlo con un tampone pulito in modo che non rimanga sangue nella soluzione. Fissare il tessuto in glutaraldeide al 2,5% in 0,1 M di fosfato di sodio per 24 ore a 4 C.Rimuovere la soluzione fissante e risciacquare il campione più volte con 0,1 M di fosfato di sodio.Sezionare il campione posizionandolo su una goccia di 0,1 M di fosfato di sodio su una piastra di dissezione. Tagliare il campione di testa in due con forbici da dissezione fine. In alternativa, raccogliere gli occhi posizionando con cura le punte delle pinzette sottili nelle orbite oculari dal lato dell'occhio.Quindi, estrarre l'occhio dall'orbita e rimuovere il tessuto extra. Trasferire il campione sezionato in un tubo contenente 0,1 M fosfato di sodio. Assicurarsi che non vi sia tessuto extra nella provetta del campione, in quanto potrebbe aderire alla parte superiore dell'occhio durante l'elaborazione del campione.Posizionare il supporto con la linguetta su un supporto. E il supporto alla base di un microscopio sezionante. Posizionare delicatamente il campione di tessuto sul supporto con una pinzetta fine, la cornea rivolta verso l'alto.Rivestire il campione con platino utilizzando il dispositivo appropriato. E conservare i campioni a temperatura ambiente fino all'imaging. Acquisisci immagini dell'ingrandimento desiderato.E usa immagini da 2000 a 2500x per l'analisi. Regola la luminosità e il contrasto per vedere chiaramente tutti i bordi delle celle e le microridge. Ed evita le aree sovraesposte nell'immagine.Aprire l'immagine TIFF con Fiji ImageJ 1.53. E usa una barra della scala per impostare la scala. Create una linea uguale alla barra di scala con lo strumento linea.Seleziona Analizza. Quindi, imposta la scala. E digita la distanza nota.Quindi, apri il ROI manager utilizzando il menu Analizza, Strumenti. Per le dimensioni e la rotondità della cella, selezionate Analizza (Analyze), Imposta misure (Set Measurements), Descrittori forma (Shape desintors). E usa lo strumento Lente di ingrandimento per vedere le celle sotto ingrandimento.Selezionare le celle con lo strumento Poligono e aggiungere ogni selezione al gestore del ROI. Infine, misurare le celle selezionate e salvare la misurazione. Per procedere con l'analisi microridge, assicurarsi che l'immagine sia in formato a 8 bit facendo clic sul menu Immagine, Tipo.Quindi, selezionate la cella con lo strumento Poligono. E cancella lo sfondo facendo clic su Modifica, quindi su Cancella all'esterno. Smussate l'immagine da una a tre volte selezionando Elabora, Liscia .E regola la luminosità e il contrasto da Immagine, Regola, Luminosità / Contrasto, in modo che le microridge si distinguano nel modo più chiaro possibile. Convolvere l'immagine cliccando su Processo, Filtri, Convolve. E trasformalo in binario facendo clic su Processo, Binario, Crea binario.Quindi, scheletrare l'immagine in bianco e nero selezionando Elabora, Binario, Scheletra. Utilizzare la funzione Scheletro analizzato per misurare i parametri microridge e salvare i valori. L'area della ferita è chiusa a tre ore dopo la ferita.Ma il sito in cui si uniscono i bordi delle ferite rimane visibile. I risultati hanno mostrato che sull'epitelio corneale abraso le microridge possono essere osservate in alcune cellule allungate vicino al sito della ferita. In alcune regioni periferiche, le microridge vengono perse dal centro della cellula.Un confronto tra le due regioni periferiche, ha mostrato cellule allungate con microridge medie più corte, indicando riarrangiamenti cellulari come reazione alla ferita. Questi risultati suggeriscono che i cambiamenti della forma cellulare sono correlati alla modifica della microridge e sottolineano l'eterogeneità all'interno dell'epitelio corneale nella risposta della ferita. Ricorda che l'operazione richiede un allenamento per eseguire una ferita omogenea e riproducibile.Oltre alla microscopia elettronica, il tessuto può essere utilizzato per l'istologia, le colorazioni immunologiche e l'ibridazione in situ. Questi forniranno ulteriori informazioni sui cambiamenti cellulari e molecolari durante la guarigione delle ferite. L'uso di zebrafish amplia le nostre conoscenze sulla biologia corneale.Inoltre, questo modello è eccellente per gli studi farmacologici e può essere utilizzato per capire di più sull'evoluzione degli occhi.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Isolamento RNA da embrionali Sintesi Zebrafish e cDNA per l&#39;analisi di espressione genica

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Ricerca

Biologia

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Sviluppo di imaging automatizzati e analisi chimiche per gli schermi zebrafish.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Produzione di transgenici Xenopus laevis Integrazione mediata da enzima di restrizione e trapianto nucleare

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Immagini dal vivo di estrusione in cella dal Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Analisi Profilo metabolico di embrioni di zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analisi delle embrionali e larvali Zebrafish scheletriche miofibre da Preparazioni dissociata

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metodi per la pelle Ferimento e saggi per risposte ferita<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...