Name: zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis
Uploaded: 2022-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis at JoVE.com

著者らは、ゼブラフィッシュユニットへのアクセスについてPertti Panulaに感謝し、ゼブラフィッシュ実験の指導と支援についてHenri Koivulaに感謝している。この研究は、フィンランドアカデミー、ジェーン・アンド・アートス・エルッコ財団、フィンランド文化財団、ATIP-Avenirプログラムの支援を受けました。イメージングは、HiLIFEとBiocenter Finlandの支援を受けて、バイオテクノロジー研究所の電子顕微鏡ユニットと光顕微鏡ユニットで行われました。

すべての実験は、国家動物実験委員会によって承認された。
1. 準備
<ol><li>麻酔26 に用いるトリカイン原液を予め用意しておく(このプロトコールで用いる0.4%原液)。手袋を着用し、可能な限り材料をヒュームフードに入れてください。<ol>
<li>50 mLの0.4%溶液の場合、200 mgのトリカイン粉末を50 mLチューブに秤量する。粉末を約45mLの二重蒸留水?...

<ol>
	<li>Baden, T., Euler, T., Berens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+retinal+basis+of+vision+across+species.">Understanding the retinal basis of vision across species.</a> Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).</li><li>Nishida, T., Saika, S., Morishige, N., Manis, M. J., Holland, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea+and+sclera:+Anatomy+and+physiology.">Cornea and sclera: Anatomy and physiology.</a> Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. , 1-22 (2017).</li><li>Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions+in+the+cornea.">Stromal-epithelial interactions in the cornea.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).</li><li>Wilson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+injury+induces+keratocyte+apoptosis:+hypothesized+role+for+the+interleukin-1+system+in+the+modulation+of+corneal+tissue+organization+and+wound+healing.">Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing.</a> Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).</li><li>Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+keratocyte+proliferation+in+response+to+epithelial+debridement.">Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement.</a> Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).</li><li>West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+keratocyte:+corneal+stromal+cell+with+variable+repair+phenotypes.">The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).</li><li>Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+abrasions+and+corneal+foreign+bodies.">Corneal abrasions and corneal foreign bodies.</a> Primary Care. 42 (3), 363-375 (2015).</li><li>Ben-Eli, H., Erdinest, N., Solomon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+complications+of+chronic+eye+rubbing+in+ocular+allergy.">Pathogenesis and complications of chronic eye rubbing in ocular allergy.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 19 (5), 526-534 (2019).</li><li>Wilson, S. A., Last, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+corneal+abrasions.">Management of corneal abrasions.</a> American Family Physician. 70 (1), 123-128 (2004).</li><li>Nagata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBP485+promotes+corneal+epithelial+wound+healing.">JBP485 promotes corneal epithelial wound healing.</a> Scientific Reports. 5, 14776 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MANF+promotes+diabetic+corneal+epithelial+wound+healing+and+nerve+regeneration+by+attenuating+hyperglycemia-induced+endoplasmic+reticulum+stress.">MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress.</a> Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).</li><li>Li, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+AlgerBrush+II+rotating+burr+as+a+tool+for+inducing+ocular+surface+failure+in+the+New+Zealand+White+rabbit.">Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit.</a> Experimental Eye Research. 147, 1-11 (2016).</li><li>Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+abrasion+with+ocular+burr+as+a+model+for+cornea+wound+healing.">Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (137), e58071 (2018).</li><li>Kalha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1++progenitor+cell+dynamics+in+murine+cornea+during+homeostasis+and+wound+healing.">Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing.</a> Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).</li><li>Park, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+contribution+of+keratin-14(+)+limbal+epithelial+precursors+in+corneal+wound+healing.">Visualizing the contribution of keratin-14(+) limbal epithelial precursors in corneal wound healing.</a> Stem Cell Reports. 12 (1), 14-28 (2019).</li><li>Kuony, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodysplasin-A+signaling+is+a+key+integrator+in+the+lacrimal+gland-cornea+feedback+loop.">Ectodysplasin-A signaling is a key integrator in the lacrimal gland-cornea feedback loop.</a> Development. 146 (14), (2019).</li><li>Farrelly, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+live+imaging+of+single+corneal+stem+cells+reveals+compartmentalized+organization+of+the+limbal+niche.">Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).</li><li>Ikkala, K., Michon, F., Stratoulias, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+Zebrafish+corneal+injury+induces+bilateral+cell+plasticity+supporting+wound+closure.">Unilateral Zebrafish corneal injury induces bilateral cell plasticity supporting wound closure.</a> Scientific Reports. , (2021).</li><li>Ormerod, L. D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+models+of+corneal+injury+using+alkali-immersed+filter+discs.">Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).</li><li>Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alkali-burn+injury+model+of+corneal+neovascularization+in+the+mouse.">An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159 (2014).</li><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+modeling+of+corneal+alkali+injury+in+the+rat+eye.">Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye.</a> Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).</li><li>Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+chemical+injuries+and+their+management.">Ocular chemical injuries and their management.</a> Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).</li><li>Pal-Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BALB/c+and+C57BL6+mouse+strains+vary+in+their+ability+to+heal+corneal+epithelial+debridement+wounds.">BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds.</a> Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).</li><li>Chen, J. J., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+corneal+epithelial+wound+healing+in+partial-thickness+removal+of+limbal+epithelium.">Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).</li><li>Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGTA+in+corneal+wound+healing+after+transepithelial+laser+ablation+in+a+rabbit+model:+a+randomized,+blinded,+placebo-controlled+study.">RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).</li><li>. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio Available from: <a target="_blank" href="https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html">https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> (2000)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+wound+closure+in+the+rabbit+cornea.+A+biphasic+process.">Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).</li><li>Parlanti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+debris+accumulates+in+corneal+epithelial+cells+after+intraepithelial+corneal+nerves+are+damaged:+A+focused+Ion+Beam+Scanning+Electron+Microscopy+(FIB-SEM)+study.">Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study.</a> Experimental Eye Research. 194, 107998 (2020).</li><li>Zhao, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+cornea:+structure+and+development.">The zebrafish cornea: structure and development.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).</li><li>Richardson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-epithelialization+of+cutaneous+wounds+in+adult+zebrafish+combines+mechanisms+of+wound+closure+in+embryonic+and+adult+mammals.">Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals.</a> Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).</li><li>van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+contraction+drives+the+3D+patterning+of+epithelial+cell+surfaces.">Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration+in+zebrafish.">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).</li><li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirt6+deficiency+impairs+corneal+epithelial+wound+healing.">Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing.</a> Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).</li><li>Ksander, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCB5+is+a+limbal+stem+cell+gene+required+for+corneal+development+and+repair.">ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair.</a> Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li></ol>

角膜の身体的傷害は、眼科患者が病院を訪れる最も一般的な原因である。したがって、角膜病態生理学のさまざまな側面の研究に関連するモデルを確立することが重要です。これまでのところ、マウスは角膜創傷治癒の研究に最も一般的に使用されるモデルである。しかし、角膜創傷治癒に対する特定の薬物の影響を検証するために、マウスの創傷眼に点眼剤を添加することは困難な場合が?...

上皮のほとんどは外部環境と接触しているため、身体的な損傷を受けやすく、創傷治癒プロセスの研究に適しています。よく研究された組織の中で、角膜は創傷治癒の細胞的および分子的側面の調査において非常に有用なモデルである。透明な外面として、それは目に物理的な保護を提供し、網膜に光を集中させる最初の要素です。網膜の構造と細胞組成は種1によって異なるが、角膜のこれらの要素は、種に関係なく、すべてのカメラタイプの目で一般的に類似している。
角膜は、3つの主要な層2から構成される。最初で最外層は上皮であり、その透明性を確保するために絶えず更新されています。第2の層は間質であり、厳密に組織化されたコラーゲン線維の厚い層内に、角化細胞と呼ばれる散在細胞を含む。第3および最内層は内皮であり、これは前房から外層への栄養素および液体拡散を可能にする。上皮細胞と間質細胞は、成長因子とサイトカインを介して相互作用する3。この相互作用は、上皮損傷後の急速なアポトーシスおよびその後の角化細胞の増殖によって強調される4,5。穿刺などのより深い創傷の場合、角化細胞は治癒過程6において積極的な役割を果たす。
外部環境と接触しているため、角膜の身体的傷害が一般的です。それらの多くは、砂やほこりなどの小さな異物7によって引き起こされます。眼の擦れの反射は、広範な上皮擦過傷および角膜リモデリングにつながる可能性がある8。創傷の大きさと深さに応じて、これらの身体的傷害は痛みを伴い、治癒に数日かかる9。モデルの最適な創傷治癒特性は、創傷閉鎖の細胞的および分子的側面の理解を容易にする。さらに、このようなモデルは、以前に実証したように、角膜治癒を促進する可能性のある新しい分子の試験にも有用であることが証明されている10,11。
ここで説明するプロトコルは、角膜の物理的損傷を研究するための関連モデルとしてゼブラフィッシュを使用することを目的としています。このモデルは、分子をタンク水に直接添加し、治癒角膜と接触させることができるため、薬理学的スクリーニング研究に非常に便利です。ここで提供される詳細は、科学者がゼブラフィッシュモデルに関する研究を行うのに役立ちます。インビボ傷害は、鈍い眼のバリで行われる。隣接する、またはそれから離れている上皮細胞への影響は、角膜上皮の中心を特異的に除去することによって分析することができる。近年、げっ歯類角膜に関するこのような方法に焦点を当てた多数の報告12、13、14、15、16、17;しかし、今日まで、この方法をゼブラフィッシュ18に適用した報告は1つだけです。
その単純さのために、物理的創傷は、創傷閉鎖における上皮細胞の役割を描写するのに有用である。角膜損傷の別の十分に確立されたモデルは、化学火傷、特にアルカリ火傷19、20、21である。しかしながら、このようなアプローチは、末梢角膜および角膜間質19を含む眼表面全体を間接的に損傷する。実際、アルカリ火傷は角膜潰瘍、穿孔、上皮不透明化、および迅速な新生血管形成を誘発する可能性があり22、アルカリ火傷の制御不能な結果は、一般的な創傷治癒研究のためのそのアプローチを失格にする。多数の他の方法もまた、問題となっている研究の特定の焦点に従って角膜創傷治癒を調査するために使用される(例えば、完全な上皮デブリードマン23、部分厚創傷24に対する化学的および機械的損傷の組み合わせ、間質25に延びる創傷に対するエキシマレーザーアブレーション)。眼バリの使用は、焦点を創傷に対する上皮反応に制限し、再現性の高い創傷を提供する。
創傷を与える各方法と同様に、眼垢の使用には長所と短所がある。主な欠点は、応答が主に上皮的であり、臨床現場で見られる擦過傷を完全に反映していないことである。しかし、この方法には、セットアップと実行の容易さ、その精度、再現性、および非侵襲的であるという事実など、多くの利点があり、動物によって十分に許容される方法となっています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5mm burr tips</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BU-5S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1M Tris, pH 8.8</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >adhesive tabs</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Algerbrush burr, Complete instrument</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BR2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton swaps</td>
			<td >Heinz Herenz Hamburg</td>
			<td >1030128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting plate</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting tools</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >double-distilled water</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppedorf tubes, 2ml</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A5040</td>
			<td>Caution: causes irritation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G7651</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lidocaine hydrochloride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >L5647</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounts</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G301P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >101VR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pH indicator strips</td>
			<td >Macherey-Nagel</td>
			<td >92110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic spoons</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 15 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 50 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scanning electron microscope</td>
			<td >FEI</td>
			<td >Quanta 250 FEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Soft sponge</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sputter coater</td>
			<td >Quorum Technologies</td>
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zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis

目の透明な表面として、角膜は明確な視力のために役立ちます。その場所のために、この組織は環境侮辱を受けやすいです。実際、臨床的に最も頻繁に遭遇する眼の損傷は、角膜に対するものである。角膜創傷治癒は小型哺乳類(すなわち、マウス、ラット、ウサギ)で広く研究されてきたが、ゼブラフィッシュは古典的な研究モデルであるにもかかわらず、角膜生理学研究はゼブラフィッシュを含む他の種を無視してきた。
この報告は、ゼブラフィッシュに角膜擦過傷を行う方法について記載する。創傷は、眼のバリを用いて麻酔をかけた魚に インビボで 行われる。この方法は、再現性のある上皮創傷を可能にし、眼の残りの部分を無傷のままにする。擦過傷後、創傷閉鎖を3時間にわたって監視し、その後、創傷を再上皮化する。走査型電子顕微鏡法を用いて、続いて画像処理することにより、上皮細胞形状、および頂端突起を調査して、角膜上皮創傷閉鎖中の様々なステップを研究することができる。
ゼブラフィッシュモデルの特徴は、上皮組織の生理機能および組織が挑戦されたときの上皮細胞の集団的挙動の研究を可能にする。さらに、涙液膜の影響を奪われたモデルの使用は、ストレスに対する角膜応答に関する新しい答えを生み出すことができる。最後に、このモデルはまた、物理的創傷に供される任意の上皮組織に関与する細胞および分子事象の描写を可能にする。この方法は、前臨床試験における薬剤有効性の評価に適用することができる。

この研究は、ゼブラフィッシュ角膜創傷治癒実験において眼科バリを用いる方法を記載する。この方法は、バリが上皮細胞層を効率的に除去することが示されたマウスに関する以前の研究から改変された13。ゼブラフィッシュの角膜創傷における課題には、眼のサイズが比較的小さいこと、および時間のかかる実験の場合、えらを通る一定の水流を維持する必要性が含まれ?...

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Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis

このプロトコルは、細胞レベルでのその後の創傷閉鎖を評価するために、擦過傷によってゼブラフィッシュの眼表面を損傷することに焦点を当てている。このアプローチは、眼のバリを利用して角膜上皮を部分的に除去し、走査型電子顕微鏡を使用して創傷閉鎖中の細胞形態の変化を追跡する。

ゼブラフィッシュ角膜創傷治癒:擦過傷から創傷閉鎖画像分析まで

As the transparent surface of the eye, the cornea is instrumental for clear sight. Due to its location, this tissue is prone to environmental insults. ...

角膜の透明度は、視力をクリアするのに役立ちます。病理学的文脈では、この透明性は挑戦的であり得る。病因メカニズムを研究するには、ヒトの臓器と高い類似性を有する単純なモデルが必要である。これらの側面において、ゼブラフィッシュは優れたモデルである。そして、これはゼブラフィッシュの角膜擦過傷の最初の詳細な説明です。この技術は、眼への表面侵入を誘導する簡単で迅速な方法である。創傷閉鎖は、擦過傷後に容易に追跡することができる。また、化学物質、または特定の要因をタンク水に追加して、創傷閉鎖への影響を調べることができます。創傷は手動で作成されるので、この方法は一貫した結果を得るためにいくらかの練習を必要とする。実験の前に、トリカインの0.02%作業溶液を調製する。0.4%ストック溶液2mLを解凍する。40mLのシステム水を加える。そして、溶液を小さな容器に入れます。バリの先端がきれいかどうかを確認して、眼科用バリを準備します。そして必要に応じて、湿った綿棒で細胞の破片を取り除きます。柔らかいスポンジの側面に切開を行います。そして、スポンジをシステム水で湿らせます。スポンジを解剖顕微鏡のステージに置きます。バリを使用するための十分な作業スペースを確保します。そして、目の表面を正しく見るために側面と上からの十分な照明。頭をスポンジ表面から突き出した状態で、スプーンで麻酔した魚をスポンジの切開部にそっと置きます。バリの先端で目元に慎重に近づきます。そして眼面上の先端を円運動で動かし始める。擦り傷が終わったら、回復のために鎮痛剤を含む淡水に魚を慎重に置きます。使用後すぐにバリを湿った綿棒で拭いてください。目的の時点で魚を拾い上げ、0.02%トリカイン溶液に入れます。操作の動きが完全に止まり、魚が触れることに反応しなくなるまで、動物を溶液に入れたままにします。魚をスプーンでペトリ皿の上に置き、ピンセットで保持します。解剖ハサミで魚を斬首する。目の表面に傷をつけないでください。0.1 Mリン酸ナトリウムを含むサンプル管に組織を入れます。そして、溶液中に血液が残らないように、きれいな緩衝液ですすいでください。組織を0.1 Mリン酸ナトリウム中の2.5%グルタルアルデヒドで4 Cで24時間固定し、固定溶液を除去し、0.1 Mリン酸ナトリウムでサンプルを数回すすいでください。解剖プレート上の0.1 Mリン酸ナトリウムの滴の上に置くことによってサンプルを解剖する。細かい解剖はさみでヘッドサンプルを2つに切ります。あるいは、細かいピンセットの先端を目の側面から眼窩に慎重に入れて、目を集めてください。次に、ソケットから目を引き出し、余分な組織を取り除きます。解剖した試料を0.1 Mリン酸ナトリウムを含むチューブに移す。サンプル処理中に目の上部に付着する可能性があるため、サンプルチューブに余分な組織がないことを確認してください。タブ付きのマウントをホルダーの上に置きます。そして、ホルダーを解剖顕微鏡の基部とする。組織サンプルを細かいピンセットでマウントの上にそっと置き、角膜を上向きにします。適切な装置を用いて試料を白金でコーティングする。試料を撮像するまで室温で保存した。所望の倍率の画像を取得する。また、分析には2000〜2500倍の画像を使用します。明るさとコントラストを調整して、すべてのセルの境界線とマイクロリッジをはっきりと確認します。また、画像内の露出過多の領域は避けてください。フィジー ImageJ 1.53 で TIFF イメージを開きます。スケールバーを使用してスケールを設定します。線ツールでスケールバーに等しい線を作成します。[分析] を選択します。次に、スケールを設定します。そして、既知の距離で入力します。次に、[分析]、[ツール]メニューを使用してROIマネージャを開きます。セルのサイズと真円度については、[解析]、[測定値の設定]、[形状記述子] の順に選択します。拡大鏡ツールを使用して、拡大鏡の下で細胞を確認します。ポリゴンツールでセルを選択し、各選択範囲をROIマネージャに追加します。最後に、選択したセルを測定し、測定値を保存します。マイクロリッジ解析を続行するには、[画像]、[タイプ]メニューをクリックして、画像が8ビット形式であることを確認します。次に、ポリゴンツールでセルを選択します。そして、[編集]をクリックして背景をクリアし、[外側をクリア]をクリックします。プロセスを選択、スムーズを選択して、画像を 1 ~ 3 回滑らかにします。また、画像、調整、明るさ/コントラストから明るさとコントラストを調整して、マイクロリッジができるだけはっきりと目立つようにします。プロセス、フィルター、畳み込みをクリックして画像を畳み込みます。そして、プロセス、バイナリ、バイナリの作成をクリックしてバイナリに変換します。次に、プロセス、バイナリ、スケルトン化を選択して白黒画像をスケルトン化します。分析されたスケルトン機能を使用して、マイクロリッジパラメータを測定し、値を保存します。創傷領域は、創傷後3時間で閉鎖される。しかし、創傷の境界が結合されている部位は目に見えるままである。結果は、擦過した角膜上皮マイクロリッジ上に、創傷部位の隣にあるいくつかの細長い細胞において観察され得ることを示した。いくつかの周辺領域では、マイクロリッジは細胞の中心から失われる。2つの末梢領域間の比較により、より短い平均マイクロリッジを有する細長い細胞を示し、創傷に対する反応としての細胞再構成を示す。これらの結果は、細胞形状の変化がマイクロリッジ修飾と相関し、創傷応答における角膜上皮内の不均一性を強調することを示唆している。手術には、均質で再現性のある創傷を行うための訓練が必要であることを忘れないでください。電子顕微鏡法に加えて、組織は、組織学、免疫学的染色およびin situハイブリダイゼーションに使用することができる。これらは、創傷治癒中の細胞および分子変化におけるさらなる洞察を提供するであろう。ゼブラフィッシュを使うことで、角膜生物学の知識が広がります。さらに、このモデルは薬理学的研究に優れており、目の進化についてもっと理解するために使用することができます。

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

遺伝子発現解析のための胚ゼブラフィッシュとcDNA合成からのRNA分離

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

ゼブラフィッシュの化学スクリーンのための自動化された画像と解析の開発。

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

トランスジェニックの生産アフリカツメガエル制限酵素を介した統合と核移植によって

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

開発ゼブラフィッシュの表皮から細胞の押出のライブイメージング

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ胚の代謝プロファイル解析

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

解離調製物から胚および幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋線維の分析

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

創傷応答のためのスキン傷つけ処理のための方法およびアッセイ<em&gt; C。エレガンス</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...