Name: zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis
Uploaded: 2022-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis at JoVE.com

저자들은 Zebrafish 유닛에 대한 접근에 대해 Pertti Panula와 Henri Koivula에게 제브라 피쉬 실험에 대한 지침과 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 핀란드 아카데미, Jane and Aatos Erkko Foundation, Finnish Cultural Foundation 및 ATIP-Avenir Program의 지원을 받았습니다. 이미징은 HiLIFE 및 Biocenter Finland가 지원하는 Electron Microscopy 유닛과 생명 공학 연구소의 Light Microscopy Unit에서 수행되었습니다.

모든 실험은 국가 동물 실험위원회에 의해 승인되었다.
1. 준비
<ol><li>마취26 에 사용되는 트리카인 원액을 미리 준비하십시오 (이 프로토콜에 사용 된 0.4 % 원액). 가능한 한 장갑을 착용하고 재료를 흄 후드에 보관하십시오.<ol>
<li>0.4% 용액 50 mL의 경우, 트리카인 분말 200 mg을 50 mL 튜브에 넣었다. 분말을 약 45 mL의 이중 증류수에 녹인다.</li>
		<li>?...

<ol>
	<li>Baden, T., Euler, T., Berens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+retinal+basis+of+vision+across+species.">Understanding the retinal basis of vision across species.</a> Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).</li><li>Nishida, T., Saika, S., Morishige, N., Manis, M. J., Holland, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea+and+sclera:+Anatomy+and+physiology.">Cornea and sclera: Anatomy and physiology.</a> Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. , 1-22 (2017).</li><li>Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+keratocyte+proliferation+in+response+to+epithelial+debridement.">Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement.</a> Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).</li><li>West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+keratocyte:+corneal+stromal+cell+with+variable+repair+phenotypes.">The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).</li><li>Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. 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D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+models+of+corneal+injury+using+alkali-immersed+filter+discs.">Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).</li><li>Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alkali-burn+injury+model+of+corneal+neovascularization+in+the+mouse.">An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+corneal+epithelial+wound+healing+in+partial-thickness+removal+of+limbal+epithelium.">Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).</li><li>Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGTA+in+corneal+wound+healing+after+transepithelial+laser+ablation+in+a+rabbit+model:+a+randomized,+blinded,+placebo-controlled+study.">RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).</li><li>. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio Available from: <a target="_blank" href="https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html">https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> (2000)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+wound+closure+in+the+rabbit+cornea.+A+biphasic+process.">Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).</li><li>Parlanti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+debris+accumulates+in+corneal+epithelial+cells+after+intraepithelial+corneal+nerves+are+damaged:+A+focused+Ion+Beam+Scanning+Electron+Microscopy+(FIB-SEM)+study.">Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study.</a> Experimental Eye Research. 194, 107998 (2020).</li><li>Zhao, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+cornea:+structure+and+development.">The zebrafish cornea: structure and development.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).</li><li>Richardson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-epithelialization+of+cutaneous+wounds+in+adult+zebrafish+combines+mechanisms+of+wound+closure+in+embryonic+and+adult+mammals.">Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals.</a> Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).</li><li>van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+contraction+drives+the+3D+patterning+of+epithelial+cell+surfaces.">Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration+in+zebrafish.">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).</li><li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirt6+deficiency+impairs+corneal+epithelial+wound+healing.">Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing.</a> Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).</li><li>Ksander, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCB5+is+a+limbal+stem+cell+gene+required+for+corneal+development+and+repair.">ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair.</a> Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li></ol>

각막 신체 상해는 안과 환자가 병원을 방문하는 가장 흔한 원인입니다. 따라서 각막 병리 생리학의 다양한 측면에 대한 연구를위한 관련 모델을 수립하는 것이 중요합니다. 지금까지, 마우스는 각막 상처 치유의 연구에 가장 일반적으로 사용되는 모델이다. 그러나 각막 상처 치유에 대한 특정 약물의 영향을 검증하기 위해 뮤린 상처 입은 눈에 점안액을 추가하는 것은 어려울 수 있습니다. 이러한...

대부분의 상피는 외부 환경과 접촉하기 때문에 신체적 상해가 발생하기 쉽기 때문에 상처 치유 과정 연구에 매우 적합합니다. 잘 연구 된 조직 중에서 각막은 상처 치유의 세포 및 분자 측면을 조사하는 데 매우 유용한 모델입니다. 투명한 외부 표면으로서, 그것은 눈에 물리적 보호를 제공하고 망막에 빛을 집중시키는 첫 번째 요소입니다. 망막의 구조와 세포 구성은 종1에 따라 다르지만, 각막의 이러한 요소는 종에 관계없이 모든 카메라 형 눈에서 일반적으로 유사합니다.
각막은 세 개의 주요 층2로 구성되어 있습니다. 첫 번째와 가장 바깥 쪽 층은 상피이며, 상피는 투명성을 보장하기 위해 끊임없이 갱신됩니다. 두 번째 층은 엄격하게 조직 된 콜라겐 섬유의 두꺼운 층 내에 각질 세포라고 불리는 흩어져있는 세포를 포함하는 스트로마입니다. 세 번째이자 가장 안쪽에있는 층은 내피이며, 이는 영양소와 액체가 전방 챔버에서 바깥 층으로 확산 될 수있게합니다. 상피 및 기질 세포는 성장 인자 및 사이토카인을 통해 상호작용한다3. 이러한 상호작용은 상피 손상 후 각질세포의 신속한 아폽토시스 및 후속 증식에 의해 강조된다4,5. 펑크와 같은 더 깊은 상처의 경우, 각질세포는 치유 과정6에서 적극적으로 참여합니다.
외부 환경과 접촉하기 때문에 각막의 신체적 부상이 흔합니다. 이들 중 다수는 모래나 먼지와 같은 작은 이물질(7)에 의해 발생한다. 눈 마찰의 반사는 광범위한 상피 찰과상과 각막 리모델링으로 이어질 수 있습니다8. 상처의 크기와 깊이에 따르면, 이러한 신체적 상해는 고통스럽고 치유하는 데 며칠이 걸립니다9. 모델의 최적 상처 치유 특성은 상처 폐쇄의 세포 및 분자 측면에 대한 이해를 촉진한다. 또한, 이러한 모델은 이전에 입증 된 바와 같이 각막 치유를 가속화 할 수있는 잠재력을 가진 새로운 분자를 테스트하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다10,11.
여기에 설명 된 프로토콜은 각막 신체 손상을 연구하기위한 관련 모델로 제브라 피쉬를 사용하는 것을 목표로합니다. 이 모델은 분자를 탱크 물에 직접 첨가 할 수 있으므로 치유 각막과 접촉 할 수 있으므로 약리학 적 스크리닝 연구에 매우 편리합니다. 여기에 제공된 세부 사항은 과학자들이 제브라 피쉬 모델에 대한 연구를 수행하는 데 도움이 될 것입니다. 생체내 손상은 둔화된 안구 버로 수행된다. 인접한 상피 세포에 대한 영향 또는 그것으로부터 멀리 떨어진 곳에서 중앙 각막 상피를 특이적으로 제거함으로써 분석될 수 있다. 최근 몇 년 동안, 설치류 각막 12,13,14,15,16,17에 대한 그러한 방법에 초점을 맞춘 수많은 보고서; 그러나 현재까지 단 하나의 보고서 만이 제브라 피쉬18에이 방법을 적용했습니다.
그것의 단순성 때문에, 육체적 상처는 상처 폐쇄에서 상피 세포의 역할을 묘사하는데 유용하다. 각막 손상의 또 다른 잘 정립 된 모델은 화학 화상, 특히 알칼리 화상 19,20,21입니다. 그러나, 이러한 접근법은 말초 각막 및 각막 스트로마(19)를 포함하는 전체 눈 표면을 간접적으로 손상시킨다. 실제로, 알칼리 화상은 잠재적으로 각막 궤양, 천공, 상피 혼탁 및 신속한 신생혈관화22를 유도하며, 알칼리 화상의 통제 할 수없는 결과는 일반적인 상처 치유 연구를위한 접근 방식을 실격시킵니다. 문제의 연구의 특정 초점에 따라 각막 상처 치유를 조사하기 위해 수많은 다른 방법들이 또한 사용된다(예를 들어, 완전한 상피 탈지23, 부분-두께 상처(24)에 대한 화학적 및 기계적 손상의 조합, 스트로마(25)로 연장되는 상처에 대한 엑시머 레이저 절제). 안구 버의 사용은 상처에 대한 상피 반응에 초점을 제한하고 재현성이 높은 상처를 제공합니다.
상처 가해의 각 방법과 마찬가지로, 안구 버의 사용은 장단점이 있습니다. 가장 큰 단점은 반응이 대부분 상피적이며, 임상 환경에서 볼 수있는 찰과상을 완벽하게 반영하지 못한다는 것입니다. 그러나이 방법은 설정 및 수행 할 수있는 용이성, 정밀도, 재현성 및 비 침습적이라는 사실을 포함하여 많은 장점을 가지고 있으므로 동물이 잘 견딜 수있는 방법입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5mm burr tips</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BU-5S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1M Tris, pH 8.8</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >adhesive tabs</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Algerbrush burr, Complete instrument</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BR2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton swaps</td>
			<td >Heinz Herenz Hamburg</td>
			<td >1030128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting plate</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting tools</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >double-distilled water</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppedorf tubes, 2ml</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A5040</td>
			<td>Caution: causes irritation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G7651</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lidocaine hydrochloride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >L5647</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounts</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G301P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >101VR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pH indicator strips</td>
			<td >Macherey-Nagel</td>
			<td >92110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic spoons</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 15 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 50 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scanning electron microscope</td>
			<td >FEI</td>
			<td >Quanta 250 FEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Soft sponge</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sputter coater</td>
			<td >Quorum Technologies</td>
			<td >GQ150TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereomicroscope</td>
			<td >Leica</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis

눈의 투명한 표면으로서 각막은 맑은 시력을 위해 도움이됩니다. 그것의 위치 때문에,이 조직은 환경 모욕을 받기 쉽습니다. 사실, 임상적으로 가장 자주 발생하는 눈 부상은 각막에 대한 부상입니다. 각막 상처 치유는 작은 포유류 (즉, 생쥐, 쥐 및 토끼)에서 광범위하게 연구되었지만 각막 생리학 연구는 제브라 피쉬가 고전적인 연구 모델임에도 불구하고 제브라 피쉬를 포함한 다른 종을 무시했습니다.
이 보고서는 제브라 피쉬에서 각막 찰과상을 수행하는 방법을 설명합니다. 상처는 안구 버를 사용하여 마취 된 물고기에서 생체 내에서 수행됩니다. 이 방법은 재현 가능한 상피 상처를 허용하여 나머지 눈을 그대로 유지합니다. 찰과상 후, 상처 폐쇄는 3 시간 동안 모니터링되고, 그 후에 상처는 재상피화됩니다. 주사 전자 현미경을 사용하여, 화상 처리, 상피 세포 형상, 및 정점 돌출부를 조사하여 각막 상피 상처 폐쇄 동안 다양한 단계를 연구할 수 있다.
제브라 피쉬 모델의 특성은 조직이 도전받을 때 상피 조직 생리학 및 상피 세포의 집단 행동에 대한 연구를 허용합니다. 또한, 눈물막의 영향을 박탈당한 모델을 사용하면 스트레스에 대한 각막 반응에 관한 새로운 해답을 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 이 모델은 또한 물리적 상처를 입은 임의의 상피 조직에 관여하는 세포 및 분자 사건의 묘사를 허용한다. 이 방법은 전임상 시험에서 약물 효과의 평가에 적용될 수 있다.

본 연구는 제브라피쉬 각막 상처 치유 실험에서 안과 버를 사용하는 방법을 설명한다. 이 방법은 마우스에 대한 이전의 연구로부터 변형되었으며, 여기서 버는 상피 세포층을 효율적으로 제거하는 것으로 나타났다13. 제브라피쉬 각막 상처의 문제점은 눈의 비교적 작은 크기를 포함하며, 시간이 많이 걸리는 실험의 경우, 아가미를 통한 일정한 물 흐름을 유지할 필요가 있습니다...

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Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis

이 프로토콜은 세포 수준에서 후속 상처 폐쇄를 평가하기 위해 마모를 통해 제브라 피쉬의 안구 표면을 손상시키는 데 중점을 둡니다. 이 접근법은 안구 버를 이용하여 각막 상피를 부분적으로 제거하고 주사 전자 현미경을 사용하여 상처 폐쇄 중 세포 형태의 변화를 추적합니다.

제브라피쉬 각막 상처 치유: 마모에서 상처 폐쇄 영상 분석까지

As the transparent surface of the eye, the cornea is instrumental for clear sight. Due to its location, this tissue is prone to environmental insults. ...

각막 투명성은 시력을 맑게하는 데 도움이됩니다. 병리학 적 맥락에서이 투명성은 도전이 될 수 있습니다. 병인 메커니즘을 연구하려면 인간 장기와 높은 유사성을 갖는 간단한 모델이 필요합니다.이러한 측면에서 제브라 피쉬는 훌륭한 모델입니다. 그리고 이것은 제브라 피쉬의 각막 마모에 대한 첫 번째 자세한 설명입니다. 이 기술은 눈에 표면 진입을 유도하는 간단하고 빠른 방법입니다.상처 폐쇄는 마모 후 쉽게 따라갈 수 있습니다. 또한 화학 물질 또는 특정 요인을 탱크 물에 추가하여 상처 폐쇄에 미치는 영향을 연구 할 수 있습니다. 상처가 수동으로 생성되기 때문에이 방법은 일관된 결과를 얻기 위해 몇 가지 연습이 필요합니다.실험 전에 트리카인의 0.02 % 작업 용액을 준비하십시오. 0.4% 원액 2mL를 해동한다. 시스템 물 40 mL에 첨가하십시오.그리고 용액을 작은 용기에 넣으십시오. 버 팁이 깨끗한지 확인하여 안과 버를 준비하십시오. 필요한 경우 촉촉한 면봉으로 세포 파편을 제거하십시오.부드러운 스폰지의 측면을 절개하십시오. 그리고 스폰지를 시스템 물로 적셔주십시오. 스폰지를 해부 현미경의 무대에 놓습니다.버 사용을위한 충분한 작업 공간을 확보하십시오. 그리고 눈 표면을 올바르게 볼 수있는 측면과 위의 조명이 충분합니다. 숟가락으로 마취 된 생선을 스폰지 표면에서 튀어 나온 머리로 스폰지의 절개에 부드럽게 놓습니다.버 팁으로 눈 표면에 조심스럽게 접근하십시오. 그리고 원형 동작으로 눈 표면의 팁을 움직이기 시작하십시오. 찰과상이 끝나면 회복을 위해 진통제가 들어있는 신선한 시스템 물에 생선을 조심스럽게 넣으십시오.촉촉한 면봉으로 사용 직후에 버를 청소하십시오. 원하는 시점에서 물고기를 집어 들고 0.02 % 트리카인 용액에 넣으십시오. 난관 운동이 완전히 멈추고 물고기가 만지는 것에 반응하지 않을 때까지 동물을 용액에 보관하십시오.숟가락으로 페트리 접시에 물고기를 놓고 핀셋으로 잡으십시오. 해부하는 가위로 물고기를 감금하십시오. 눈 표면에 긁힌 자국을 피하십시오.조직을 0.1 M 인산나트륨을 함유하는 샘플 튜브에 넣는다. 그리고 깨끗한 완충액으로 헹구어 용액에 혈액이 남지 않도록하십시오. 조직을 4C에서 24시간 동안 0.1 M 인산나트륨 중의 2.5%글루타르알데히드에 고정시키고 고정액을 제거하고 0.1 M 인산나트륨으로 샘플을 여러 번 헹구었다.샘플을 해부 플레이트 상의 0.1 M 인산나트륨 방울 상에 놓아 해부한다. 미세한 해부 가위로 머리 샘플을 두 개로 자릅니다. 또는 미세한 핀셋의 끝을 눈의 측면에서 눈 소켓에 조심스럽게 배치하여 눈을 모으십시오.그런 다음 소켓에서 눈을 뽑아 여분의 조직을 제거하십시오. 해부된 샘플을 0.1 M 인산나트륨을 함유하는 튜브로 옮긴다. 샘플 처리 중에 눈 꼭대기에 부착 될 수 있으므로 샘플 튜브에 여분의 조직이 없는지 확인하십시오.탭이 있는 마운트를 홀더에 놓습니다. 및 해부 현미경의 기저부에 홀더를 포함한다. 미세한 핀셋으로 조직 샘플을 마운트에 부드럽게 올려 놓고 각막이 위를 향하게하십시오.적절한 장치를 사용하여 시편을 백금으로 코팅하십시오. 샘플을 이미징할 때까지 실온에서 보관한다. 원하는 배율의 이미지를 가져옵니다.그리고 분석을 위해 2000 ~ 2500x 이미지를 사용하십시오. 밝기와 대비를 조정하여 모든 셀 테두리와 마이크로 리지를 명확하게 볼 수 있습니다. 그리고 이미지에서 과다 노출 된 영역을 피하십시오.피지 ImageJ 1.53으로 TIFF 이미지를 엽니다. 그리고 스케일 바를 사용하여 스케일을 설정하십시오. 선 도구를 사용하여 배율 표시줄과 같은 선을 만듭니다.분석을 선택합니다. 그런 다음 배율을 설정합니다. 그리고 알려진 거리를 입력하십시오.그런 다음 분석, 도구 메뉴를 사용하여 ROI 관리자를 엽니다. 셀 크기 및 원형성에서 분석, 측정 설정, 모양 설명자를 선택합니다. 그리고 돋보기 도구를 사용하여 배율 아래 세포를 볼 수 있습니다.Polygon 도구를 사용하여 셀을 선택하고 각 선택 항목을 ROI 관리자에 추가합니다. 마지막으로, 선택된 세포를 측정하고, 측정을 저장한다. 마이크로리지 분석을 진행하려면 이미지, 유형 메뉴를 클릭하여 이미지가 8비트 형식인지 확인합니다.그런 다음 Polygon 도구를 사용하여 셀을 선택합니다. 그리고 편집을 클릭 한 다음 외부 지우기를 클릭하여 배경을 지우십시오. [프로세스], [매끄럽게]를 선택하여 이미지를 한 세 번 매끄럽게 만듭니다.그리고 이미지, 조정, 밝기 / 대비에서 밝기와 대비를 조정하여 마이크로 리지가 가능한 한 명확하게 눈에 띄도록하십시오. 프로세스, 필터, 컨볼브를 클릭하여 이미지를 컨볼브합니다. 그리고 프로세스, 바이너리, 바이너리 만들기를 클릭하여 바이너리로 변환하십시오.그런 다음 프로세스, 바이너리, 스켈레네이션을 선택하여 흑백 이미지를 골격화합니다. 분석된 골격 함수를 사용하여 마이크로리지 파라미터를 측정하고 값을 저장합니다. 상처 부위는 상처 후 세 시간에 닫힙니다.그러나 상처 경계가 결합 된 부위는 여전히 보입니다. 결과는 절제된 각막 상피 마이크로리지에서 상처 부위 옆의 일부 길쭉한 세포에서 관찰될 수 있음을 보여주었다. 일부 주변 영역에서, 마이크로리지는 세포의 중심으로부터 손실된다.두 개의 주변 영역 사이의 비교는, 더 짧은 평균 마이크로리지를 갖는 길쭉한 세포를 나타냈으며, 이는 상처에 대한 반응으로서 세포 재배열을 나타낸다. 이러한 결과는 세포 형태 변화가 마이크로리지 변형과 상관관계가 있고 상처 반응에서 각막 상피 내의 이질성을 강조한다는 것을 시사한다. 수술은 균질하고 재현 가능한 상처를 수행하기 위해 훈련이 필요하다는 것을 기억하십시오.전자 현미경 검사 외에도 조직은 조직학, 면역학 염색 및 계내 혼성화에 사용될 수 있습니다. 이들은 상처 치유 동안 세포 및 분자 변화에 대한 더 많은 통찰력을 제공 할 것입니다. 제브라피쉬를 사용하면 각막 생물학에 대한 우리의 지식이 넓어집니다.또한,이 모델은 약리학 적 연구에 탁월하며 눈 진화에 대해 더 많이 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

유전자 발현 분석을위한 배아 Zebrafish 및 cDNA 합성에서 RNA 격리

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

연구

생물학

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

zebrafish 화학 화면을위한 자동화 이미징 및 분석의 개발.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

트렌스 제닉 생산 Xenopus laevis 제한 효소 중재 통합 및 핵 이식에 의해

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

개발 Zebrafish의 표피에서 세포 압출의 라이브 영상

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Zebrafish 태아의 대사 프로필 분석

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험<em&gt; C. 엘레</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...