Name: zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis
Uploaded: 2022-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis at JoVE.com

Os autores agradecem a Pertti Panula pelo acesso à unidade de Zebrafish e Henri Koivula pela orientação e ajuda nos experimentos com zebrafish. Esta pesquisa foi apoiada pela Academia da Finlândia, pela Fundação Jane e Aatos Erkko, pela Fundação Cultural Finlandesa e pelo Programa ATIP-Avenir. A imagem foi realizada na unidade de Microscopia eletrônica e na Unidade de Microscopia Leve, Instituto de Biotecnologia, com apoio da HiLIFE e Biocenter Finlândia.

Todos os experimentos foram aprovados pelo conselho nacional de experimentos com animais.
1. Preparativos
<ol><li>Prepare a solução de estoque tricaine utilizada para anestesia26 antecipadamente (solução de estoque de 0,4% utilizada neste protocolo). Use luvas e mantenha os materiais em um capô de fumaça sempre que possível.<ol>
<li>Para 50 mL de uma solução de 0,4%, pesar 200 mg de pó tricaine em um tubo de 50 mL. Dissolva o pó em aproxima...

<ol>
	<li>Baden, T., Euler, T., Berens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+retinal+basis+of+vision+across+species.">Understanding the retinal basis of vision across species.</a> Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).</li><li>Nishida, T., Saika, S., Morishige, N., Manis, M. J., Holland, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea+and+sclera:+Anatomy+and+physiology.">Cornea and sclera: Anatomy and physiology.</a> Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. , 1-22 (2017).</li><li>Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions+in+the+cornea.">Stromal-epithelial interactions in the cornea.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).</li><li>Wilson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+injury+induces+keratocyte+apoptosis:+hypothesized+role+for+the+interleukin-1+system+in+the+modulation+of+corneal+tissue+organization+and+wound+healing.">Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing.</a> Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).</li><li>Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+keratocyte+proliferation+in+response+to+epithelial+debridement.">Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement.</a> Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).</li><li>West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+keratocyte:+corneal+stromal+cell+with+variable+repair+phenotypes.">The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).</li><li>Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+abrasions+and+corneal+foreign+bodies.">Corneal abrasions and corneal foreign bodies.</a> Primary Care. 42 (3), 363-375 (2015).</li><li>Ben-Eli, H., Erdinest, N., Solomon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+complications+of+chronic+eye+rubbing+in+ocular+allergy.">Pathogenesis and complications of chronic eye rubbing in ocular allergy.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 19 (5), 526-534 (2019).</li><li>Wilson, S. A., Last, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+corneal+abrasions.">Management of corneal abrasions.</a> American Family Physician. 70 (1), 123-128 (2004).</li><li>Nagata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBP485+promotes+corneal+epithelial+wound+healing.">JBP485 promotes corneal epithelial wound healing.</a> Scientific Reports. 5, 14776 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MANF+promotes+diabetic+corneal+epithelial+wound+healing+and+nerve+regeneration+by+attenuating+hyperglycemia-induced+endoplasmic+reticulum+stress.">MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress.</a> Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).</li><li>Li, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+AlgerBrush+II+rotating+burr+as+a+tool+for+inducing+ocular+surface+failure+in+the+New+Zealand+White+rabbit.">Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit.</a> Experimental Eye Research. 147, 1-11 (2016).</li><li>Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+abrasion+with+ocular+burr+as+a+model+for+cornea+wound+healing.">Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (137), e58071 (2018).</li><li>Kalha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1++progenitor+cell+dynamics+in+murine+cornea+during+homeostasis+and+wound+healing.">Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing.</a> Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).</li><li>Park, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+contribution+of+keratin-14(+)+limbal+epithelial+precursors+in+corneal+wound+healing.">Visualizing the contribution of keratin-14(+) limbal epithelial precursors in corneal wound healing.</a> Stem Cell Reports. 12 (1), 14-28 (2019).</li><li>Kuony, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodysplasin-A+signaling+is+a+key+integrator+in+the+lacrimal+gland-cornea+feedback+loop.">Ectodysplasin-A signaling is a key integrator in the lacrimal gland-cornea feedback loop.</a> Development. 146 (14), (2019).</li><li>Farrelly, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+live+imaging+of+single+corneal+stem+cells+reveals+compartmentalized+organization+of+the+limbal+niche.">Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).</li><li>Ikkala, K., Michon, F., Stratoulias, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+Zebrafish+corneal+injury+induces+bilateral+cell+plasticity+supporting+wound+closure.">Unilateral Zebrafish corneal injury induces bilateral cell plasticity supporting wound closure.</a> Scientific Reports. , (2021).</li><li>Ormerod, L. D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+models+of+corneal+injury+using+alkali-immersed+filter+discs.">Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).</li><li>Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alkali-burn+injury+model+of+corneal+neovascularization+in+the+mouse.">An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159 (2014).</li><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+modeling+of+corneal+alkali+injury+in+the+rat+eye.">Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye.</a> Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).</li><li>Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+chemical+injuries+and+their+management.">Ocular chemical injuries and their management.</a> Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).</li><li>Pal-Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BALB/c+and+C57BL6+mouse+strains+vary+in+their+ability+to+heal+corneal+epithelial+debridement+wounds.">BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds.</a> Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).</li><li>Chen, J. J., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+corneal+epithelial+wound+healing+in+partial-thickness+removal+of+limbal+epithelium.">Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).</li><li>Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGTA+in+corneal+wound+healing+after+transepithelial+laser+ablation+in+a+rabbit+model:+a+randomized,+blinded,+placebo-controlled+study.">RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).</li><li>. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio Available from: <a target="_blank" href="https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html">https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> (2000)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+wound+closure+in+the+rabbit+cornea.+A+biphasic+process.">Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).</li><li>Parlanti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+debris+accumulates+in+corneal+epithelial+cells+after+intraepithelial+corneal+nerves+are+damaged:+A+focused+Ion+Beam+Scanning+Electron+Microscopy+(FIB-SEM)+study.">Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study.</a> Experimental Eye Research. 194, 107998 (2020).</li><li>Zhao, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+cornea:+structure+and+development.">The zebrafish cornea: structure and development.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).</li><li>Richardson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-epithelialization+of+cutaneous+wounds+in+adult+zebrafish+combines+mechanisms+of+wound+closure+in+embryonic+and+adult+mammals.">Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals.</a> Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).</li><li>van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+contraction+drives+the+3D+patterning+of+epithelial+cell+surfaces.">Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration+in+zebrafish.">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).</li><li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirt6+deficiency+impairs+corneal+epithelial+wound+healing.">Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing.</a> Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).</li><li>Ksander, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCB5+is+a+limbal+stem+cell+gene+required+for+corneal+development+and+repair.">ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair.</a> Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li></ol>

Lesões físicas da córnea são a causa mais comum de visitas de pacientes oftalmológicos ao hospital. Por isso, é importante estabelecer modelos relevantes para o estudo de diferentes aspectos da fisiopatologia da córnea. Até agora, o rato é o modelo mais usado para o estudo da cicatrização de feridas córneas. No entanto, adicionar colírios nos olhos murinos feridos para validar o impacto de drogas específicas na cicatrização de feridas córneas pode ser difícil. A este respeito, o modelo de zebrafish é p...

Como a maioria da epitélio está em contato com o ambiente externo, elas são propensas a lesões físicas, tornando-as adequadas para o estudo dos processos de cicatrização de feridas. Entre os tecidos bem estudados, a córnea é um modelo extremamente útil na investigação dos aspectos celulares e moleculares da cicatrização de feridas. Como uma superfície externa transparente, fornece proteção física ao olho e é o primeiro elemento a focar a luz na retina. Embora a estrutura e a composição celular da retina diferem entre as espécies1, esses elementos da córnea são geralmente semelhantes em todos os olhos do tipo câmera, independentemente das espécies.
A córnea é composta por três camadas principais2. A primeira e mais externa camada é o epitélio, que é constantemente renovado para garantir sua transparência. A segunda camada é o estroma, que contém células dispersas, chamadas queratócitos, dentro de uma espessa camada de fibras de colágeno estritamente organizadas. A terceira e mais interna camada é o endotélio, que permite a difusão de nutrientes e líquidos da câmara anterior para as camadas externas. As células epiteliais e estromal interagem através de fatores de crescimento e citocinas3. Esta interação é destacada pela rápida apoptose e posterior proliferação de ceratocitos após lesão epitelial 4,5. No caso de uma ferida mais profunda, como uma punção, os ceratocitos participam ativamente do processo de cura6.
Estando em contato com o ambiente externo, lesões físicas da córnea são comuns. Muitos deles são causados por pequenos objetos estranhos7, como areia ou poeira. O reflexo da esfregação dos olhos pode levar a extensas escoriações epiteliais e remodelação corneal8. De acordo com o tamanho e a profundidade da ferida, essas lesões físicas são dolorosas e levam vários dias para curar9. As características ideais de cicatrização da ferida de um modelo facilitam a compreensão dos aspectos celulares e moleculares do fechamento da ferida. Além disso, tais modelos também se mostraram úteis para testar novas moléculas com potencial para acelerar a cura da córnea, como demonstrado anteriormente10,11.
O protocolo descrito aqui visa usar o zebrafish como um modelo relevante para estudar lesões físicas na córnea. Este modelo é altamente conveniente para estudos de triagem farmacológica, pois permite que as moléculas sejam adicionadas diretamente à água do tanque e, portanto, entre em contato com uma córnea curativa. Os detalhes aqui fornecidos ajudarão os cientistas a realizar seus estudos sobre o modelo de zebrafish. A lesão in vivo é realizada com uma rebarba ocular embotada. O impacto nas células epiteliais adjacentes ou à distância dela pode ser analisado removendo especificamente o epitélio córnea central. Nos últimos anos, inúmeros relatos focaram nesse método na córnea de roedores 12,13,14,15,16,17; no entanto, até o momento, apenas um único relatório aplicou este método ao zebrafish18.
Devido à sua simplicidade, a ferida física é útil para delinear o papel das células epiteliais no fechamento da ferida. Outro modelo bem estabelecido de lesão corneia é a queima química, especialmente a queimadura deálcali 19,20,21. No entanto, tal abordagem danifica indiretamente toda a superfície ocular, incluindo a córnea periférica e o estroma córnea19. De fato, queimaduras alcalinas potencialmente induzem úlceras corneais, perfurações, opificação epitelial e neovascularização rápida22, e o resultado incontrolável de queimaduras alcalinas desqualificadas que se aproximam de estudos gerais de cicatrização de feridas. Inúmeros outros métodos também são usados para investigar a cicatrização de feridas córneas de acordo com o foco particular do estudo em questão (por exemplo, debridamento epitelial completo23, a combinação de lesão química e mecânica para ferida de espessura parcial24, ablação a laser excimer para feridas que se estendem ao estroma25). O uso de uma rebarba ocular restringe o ponto focal à resposta epitelial à ferida e fornece uma ferida altamente reprodutível.
Como em cada método de infligência de feridas, o uso de uma rebarba ocular tem vantagens e desvantagens. A principal desvantagem é que a resposta sendo principalmente epitelial, não reflete perfeitamente as abrasões vistas no cenário clínico. No entanto, este método tem inúmeras vantagens, incluindo a facilidade com que pode ser configurado e realizado, sua precisão, sua reprodutibilidade e o fato de não ser invasivo, tornando-o um método bem tolerado pelos animais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5mm burr tips</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BU-5S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1M Tris, pH 8.8</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >adhesive tabs</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Algerbrush burr, Complete instrument</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BR2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton swaps</td>
			<td >Heinz Herenz Hamburg</td>
			<td >1030128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting plate</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting tools</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >double-distilled water</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppedorf tubes, 2ml</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A5040</td>
			<td>Caution: causes irritation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G7651</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lidocaine hydrochloride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >L5647</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounts</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G301P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >101VR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pH indicator strips</td>
			<td >Macherey-Nagel</td>
			<td >92110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic spoons</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 15 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 50 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scanning electron microscope</td>
			<td >FEI</td>
			<td >Quanta 250 FEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Soft sponge</td>
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zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis

Como a superfície transparente do olho, a córnea é fundamental para uma visão clara. Devido à sua localização, este tecido é propenso a insultos ambientais. De fato, as lesões oculares mais encontradas clinicamente são aquelas para a córnea. Embora a cura de feridas na córnea tenha sido extensivamente estudada em pequenos mamíferos (ou seja, ratos, ratos e coelhos), estudos de fisiologia da córnea negligenciaram outras espécies, incluindo zebrafish, apesar do zebrafish ser um modelo clássico de pesquisa.
Este relatório descreve um método de realização de uma abrasão córnea em zebrafish. A ferida é realizada in vivo em peixes anestesiados usando uma rebarba ocular. Este método permite uma ferida epitelial reprodutível, deixando o resto do olho intacto. Após a abrasão, o fechamento da ferida é monitorado ao longo de 3 h, após o qual a ferida é reeptelializada. Usando microscopia eletrônica de varredura, seguida de processamento de imagem, a forma das células epiteliais e as saliências apical podem ser investigadas para estudar as várias etapas durante o fechamento da ferida epitelial da córnea.
As características do modelo de zebrafish permitem o estudo da fisiologia do tecido epitelial e do comportamento coletivo das células epiteliais quando o tecido é desafiado. Além disso, o uso de um modelo privado da influência do filme lacrimal pode produzir novas respostas sobre a resposta córnea ao estresse. Por fim, este modelo também permite a delineação dos eventos celulares e moleculares envolvidos em qualquer tecido epitelial submetido a uma ferida física. Este método pode ser aplicado à avaliação da eficácia da droga em testes pré-clínicos.

Este estudo descreve um método usando uma rebarba oftálmica em experimentos de cura de feridas de córnea de zebrafish. O método é modificado a partir de estudos anteriores em camundongos, onde a rebarba foi demonstrada para remover as camadas de células epiteliais eficientemente13. Os desafios no woundamento corneal de zebrafish incluem o tamanho relativamente pequeno do olho, e no caso de experimentos demorados, a necessidade de manter um fluxo constante de água através das brânquias (co...

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Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis

Este protocolo se concentra em danificar a superfície ocular do zebrafish através da abrasão para avaliar o subsequente fechamento da ferida no nível celular. Esta abordagem explora uma rebarba ocular para remover parcialmente o epitélio corneo e usa microscopia eletrônica de varredura para rastrear mudanças na morfologia celular durante o fechamento da ferida.

Cura da ferida corneal de zebrafish: da abrasão à análise de imagem de fechamento da ferida

As the transparent surface of the eye, the cornea is instrumental for clear sight. Due to its location, this tissue is prone to environmental insults. ...

A transparência da córnea é fundamental para limpar a visão. No contexto patológico, essa transparência pode ser um desafio. Estudar o mecanismo de patogênese requer modelos simples com alta semelhança com o órgão humano.Nesses aspectos, o zebrafish é um excelente modelo. E esta é a primeira descrição detalhada da abrasão da córnea em zebrafish. Esta técnica é uma maneira simples e rápida de induzir a entrada superficial no olho.O fechamento da ferida pode ser seguido facilmente após a abrasão. Além disso, produtos químicos, ou fatores específicos, podem ser adicionados à água do tanque para estudar seu impacto no fechamento da ferida. À medida que a ferida é criada manualmente, o método requer alguma prática para obter resultados consistentes.Antes do experimento, prepare uma solução de 0,02% de trabalho de tricaine. Descongele 2 mL de 0,4% de solução de estoque. Adicione a 40 mL de água do sistema.E coloque a solução em um recipiente pequeno. Tenha a rebarba oftálmica pronta, verificando se a ponta da rebarba está limpa. E se necessário, remova detritos celulares com um cotonete úmido.Faça uma incisão ao lado de uma esponja macia. E umedeça a esponja com água do sistema. Coloque a esponja no palco de um microscópio dissecando.Garanta espaço de trabalho suficiente para usar a rebarba. E iluminação suficiente de lado e acima para ver a superfície dos olhos corretamente. Coloque suavemente o peixe anestesiado com uma colher na incisão na esponja com a cabeça salientes da superfície da esponja.Aproxime-se cuidadosamente da superfície dos olhos com a ponta da rebarba. E comece a mover a ponta na superfície dos olhos com um movimento circular. Quando a abrasão estiver feita, coloque cuidadosamente os peixes no sistema fresco de água contendo analgésico para recuperação.Limpe a rebarba imediatamente após o uso com um cotonete úmido. Pegue o peixe no ponto de tempo desejado e coloque-o em solução 0,02%. Mantenha o animal na solução até que o movimento opercular cesse completamente e o peixe não reaja ao toque.Coloque o peixe em uma placa de Petri com uma colher, e segure-o com pinças. Decapite o peixe com uma tesoura dissecando. Evite fazer arranhões na superfície do olho.Coloque o tecido em um tubo de amostra contendo fosfato de sódio de 0,1 M. E enxágüe-o com um tampão limpo para que nenhum sangue permaneça na solução. Fixar o tecido em 2,5% glutaraldeído em 0,1 M de fosfato de sódio por 24 horas a 4 C.Remova a solução de fixação e enxágue a amostra várias vezes com fosfato de sódio de 0,1 M.Disseque a amostra colocando-a em uma gota de fosfato de sódio de 0,1 M em uma placa de dissecação. Corte a amostra da cabeça em duas com uma tesoura de dissecação fina. Alternativamente, colete os olhos colocando cuidadosamente as pontas de pinças finas nas órbitas oculares a partir do lado do olho.Em seguida, retire o olho da tomada e remova tecido extra. Transfira a amostra dissecada para um tubo contendo fosfato de sódio de 0,1 M. Certifique-se de que não há tecido extra no tubo de amostra, pois ele pode aderir ao topo do olho durante o processamento da amostra.Coloque a montagem com a guia em um suporte. E o suporte para a base de um microscópio dissecando. Coloque suavemente a amostra de tecido no suporte com pinças finas, córnea voltada para cima.Cubra o espécime com platina usando o dispositivo apropriado. E armazene as amostras à temperatura ambiente até a imagem. Adquira imagens da ampliação desejada.E use imagens de 2000 a 2500x para análise. Ajuste o brilho e o contraste para ver claramente todas as bordas celulares e microcréditos. E evite áreas superexpostas na imagem.Abra a imagem TIFF com Fiji ImageJ 1.53. E use uma barra de escala para definir a escala. Crie uma linha igual à barra de escala com a ferramenta Linha.Selecione Analisar. Em seguida, definir escala. E digite a distância conhecida.Em seguida, abra o gerenciador de ROI usando o menu Analisar, Ferramentas. Para selecionar tamanho de célula e arredondamento, selecione Analisar, definir medidas, descritores de forma. E use a ferramenta Lupa para ver as células sob ampliação.Selecione células com a ferramenta Polígono e adicione cada seleção ao gerenciador de ROI. Finalmente, meça as células selecionadas e salve a medição. Para prosseguir com a análise de microarmes, certifique-se de que a imagem está em formato de 8 bits clicando no menu Imagem, Tipo.Em seguida, selecione a célula com a ferramenta Polígono. E limpe o fundo clicando em Editar, depois Limpar para fora. Suavize a imagem uma a três vezes selecionando Process, Smooth.E ajuste o brilho e o contraste da imagem, ajuste, brilho/contraste, para que os microcréditos se destaquem da forma mais clara possível. Convolve a imagem clicando em Process, Filters, Convolve. E transformá-lo em binário clicando em Process, Binary, Make Binary.Em seguida, esqueleto a imagem em preto e branco selecionando Process, Binary, Skeletonize. Use a função Esqueleto Analisado para medir os parâmetros do microarem e salvar os valores. A área do ferimento está fechada a três horas após o ferimento.Mas o local onde as bordas da ferida se juntam permanece visível. Os resultados mostraram que em microctérias de epitélio de córnea abradas podem ser observadas em algumas células alongadas próximas ao local da ferida. Em algumas regiões periféricas, os microcréditos são perdidos do centro da célula.Uma comparação entre as duas regiões periféricas mostrou células alongadas com microcréditos médios mais curtos, indicando rearranjos celulares como reação ao ferimento. Esses resultados sugerem que as alterações de forma celular se correlacionam com a modificação da microcrélise e enfatizam a heterogeneidade dentro do epitélio córnea na resposta à ferida. Lembre-se que a operação requer treinamento para realizar uma ferida homogênea e reprodutível.Além da microscopia eletrônica, o tecido pode ser usado para histologia, manchas imunológicas e hibridização in situ. Estes fornecerão mais informações sobre as mudanças celulares e moleculares durante a cicatrização da ferida. O uso de zebrafish amplia nosso conhecimento sobre biologia córnea.Além disso, este modelo é excelente para estudos farmacológicos, e pode ser usado para entender mais sobre a evolução dos olhos.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Isolamento de RNA Síntese Zebrafish e cDNA embrionárias para Análise de Expressão Gênica

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Biologia

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Desenvolvimento de imagem automatizada e análise química para as telas de zebrafish.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Produção de transgênicos Xenopus laevis Por Restrição Integração Mediada por Enzima e Transplante Nuclear

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Imagens ao vivo de extrusão celular da epiderme de Zebrafish desenvolvimento

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Análise do Perfil Metabólico de embriões Zebrafish

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Métodos para a pele ferimento e Ensaios para Responses ferida no<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...