Name: zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis
Uploaded: 2022-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis at JoVE.com

Авторы благодарят Пертти Панулу за доступ к подразделению рыбок данио и Анри Койвулу за руководство и помощь в экспериментах с рыбками данио. Это исследование было поддержано Академией Финляндии, Фондом Джейн и Аатос Эркко, Финским культурным фондом и программой ATIP-Avenir. Визуализация проводилась в отделении электронной микроскопии и в отделении световой микроскопии Института биотехнологии при поддержке HiLIFE и Biocenter Finland.

Все эксперименты были одобрены национальным советом по экспериментам на животных.
1. Препараты
<ol><li>Подготовьте раствор трицина, используемый для анестезии26 заранее (0,4% раствор, используемый в этом протоколе). Используйте перчатки и храните матери...

<ol>
	<li>Baden, T., Euler, T., Berens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+retinal+basis+of+vision+across+species.">Understanding the retinal basis of vision across species.</a> Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).</li><li>Nishida, T., Saika, S., Morishige, N., Manis, M. J., Holland, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea+and+sclera:+Anatomy+and+physiology.">Cornea and sclera: Anatomy and physiology.</a> Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. , 1-22 (2017).</li><li>Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions+in+the+cornea.">Stromal-epithelial interactions in the cornea.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).</li><li>Wilson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+injury+induces+keratocyte+apoptosis:+hypothesized+role+for+the+interleukin-1+system+in+the+modulation+of+corneal+tissue+organization+and+wound+healing.">Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing.</a> Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).</li><li>Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+keratocyte+proliferation+in+response+to+epithelial+debridement.">Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement.</a> Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).</li><li>West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+keratocyte:+corneal+stromal+cell+with+variable+repair+phenotypes.">The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).</li><li>Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+abrasions+and+corneal+foreign+bodies.">Corneal abrasions and corneal foreign bodies.</a> Primary Care. 42 (3), 363-375 (2015).</li><li>Ben-Eli, H., Erdinest, N., Solomon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+complications+of+chronic+eye+rubbing+in+ocular+allergy.">Pathogenesis and complications of chronic eye rubbing in ocular allergy.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 19 (5), 526-534 (2019).</li><li>Wilson, S. A., Last, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+corneal+abrasions.">Management of corneal abrasions.</a> American Family Physician. 70 (1), 123-128 (2004).</li><li>Nagata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBP485+promotes+corneal+epithelial+wound+healing.">JBP485 promotes corneal epithelial wound healing.</a> Scientific Reports. 5, 14776 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MANF+promotes+diabetic+corneal+epithelial+wound+healing+and+nerve+regeneration+by+attenuating+hyperglycemia-induced+endoplasmic+reticulum+stress.">MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress.</a> Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).</li><li>Li, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+AlgerBrush+II+rotating+burr+as+a+tool+for+inducing+ocular+surface+failure+in+the+New+Zealand+White+rabbit.">Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit.</a> Experimental Eye Research. 147, 1-11 (2016).</li><li>Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+abrasion+with+ocular+burr+as+a+model+for+cornea+wound+healing.">Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (137), e58071 (2018).</li><li>Kalha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1++progenitor+cell+dynamics+in+murine+cornea+during+homeostasis+and+wound+healing.">Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing.</a> Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).</li><li>Park, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+contribution+of+keratin-14(+)+limbal+epithelial+precursors+in+corneal+wound+healing.">Visualizing the contribution of keratin-14(+) limbal epithelial precursors in corneal wound healing.</a> Stem Cell Reports. 12 (1), 14-28 (2019).</li><li>Kuony, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodysplasin-A+signaling+is+a+key+integrator+in+the+lacrimal+gland-cornea+feedback+loop.">Ectodysplasin-A signaling is a key integrator in the lacrimal gland-cornea feedback loop.</a> Development. 146 (14), (2019).</li><li>Farrelly, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+live+imaging+of+single+corneal+stem+cells+reveals+compartmentalized+organization+of+the+limbal+niche.">Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).</li><li>Ikkala, K., Michon, F., Stratoulias, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+Zebrafish+corneal+injury+induces+bilateral+cell+plasticity+supporting+wound+closure.">Unilateral Zebrafish corneal injury induces bilateral cell plasticity supporting wound closure.</a> Scientific Reports. , (2021).</li><li>Ormerod, L. D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+models+of+corneal+injury+using+alkali-immersed+filter+discs.">Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).</li><li>Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alkali-burn+injury+model+of+corneal+neovascularization+in+the+mouse.">An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159 (2014).</li><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+modeling+of+corneal+alkali+injury+in+the+rat+eye.">Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye.</a> Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).</li><li>Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+chemical+injuries+and+their+management.">Ocular chemical injuries and their management.</a> Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).</li><li>Pal-Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BALB/c+and+C57BL6+mouse+strains+vary+in+their+ability+to+heal+corneal+epithelial+debridement+wounds.">BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds.</a> Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).</li><li>Chen, J. J., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+corneal+epithelial+wound+healing+in+partial-thickness+removal+of+limbal+epithelium.">Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).</li><li>Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGTA+in+corneal+wound+healing+after+transepithelial+laser+ablation+in+a+rabbit+model:+a+randomized,+blinded,+placebo-controlled+study.">RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).</li><li>. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio Available from: <a target="_blank" href="https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html">https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> (2000)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+wound+closure+in+the+rabbit+cornea.+A+biphasic+process.">Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).</li><li>Parlanti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+debris+accumulates+in+corneal+epithelial+cells+after+intraepithelial+corneal+nerves+are+damaged:+A+focused+Ion+Beam+Scanning+Electron+Microscopy+(FIB-SEM)+study.">Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study.</a> Experimental Eye Research. 194, 107998 (2020).</li><li>Zhao, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+cornea:+structure+and+development.">The zebrafish cornea: structure and development.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).</li><li>Richardson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-epithelialization+of+cutaneous+wounds+in+adult+zebrafish+combines+mechanisms+of+wound+closure+in+embryonic+and+adult+mammals.">Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals.</a> Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).</li><li>van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+contraction+drives+the+3D+patterning+of+epithelial+cell+surfaces.">Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration+in+zebrafish.">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).</li><li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirt6+deficiency+impairs+corneal+epithelial+wound+healing.">Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing.</a> Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).</li><li>Ksander, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCB5+is+a+limbal+stem+cell+gene+required+for+corneal+development+and+repair.">ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair.</a> Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li></ol>

Физические травмы роговицы являются наиболее распространенной причиной визитов пациентов офтальмологии в больницу. Поэтому важно установить соответствующие модели для изучения различных аспектов патофизиологии роговицы. До сих пор мышь является наиболее часто используемой модель?...

Поскольку большинство эпителиев находятся в контакте с внешней средой, они склонны к физическим травмам, что делает их хорошо подходящими для изучения процессов заживления ран. Среди хорошо изученных тканей роговица является чрезвычайно полезной моделью в исследовании клеточных и молекулярных аспектов заживления ран. Как прозрачная внешняя поверхность, он обеспечивает физическую защиту глаза и является первым элементом, который фокусирует свет на сетчатке. Хотя структура и клеточный состав сетчатки различаются между видами1, эти элементы роговицы, как правило, похожи во всех глазах камерного типа, независимо от вида.
Роговица состоит из трех основных слоев2. Первым и самым внешним слоем является эпителий, который постоянно обновляется для обеспечения его прозрачности. Вторым слоем является строма, которая содержит рассеянные клетки, называемые кератоцитами, в толстом слое строго организованных коллагеновых волокон. Третьим и самым внутренним слоем является эндотелий, который позволяет диффузии питательных веществ и жидкостей из передней камеры во внешние слои. Эпителиальные и стромальные клетки взаимодействуют через факторы роста и цитокины3. Это взаимодействие подчеркивается быстрым апоптозом и последующей пролиферацией кератоцитов после повреждения эпителия 4,5. В случае более глубокой раны, такой как пункция, кератоциты принимают активное участие в процессе заживления6.
Находясь в контакте с внешней средой, распространены физические травмы роговицы. Многие из них вызваны мелкими посторонними предметами7, такими как песок или пыль. Рефлекс трения глаз может привести к обширным эпителиальным ссадинам и ремоделированиюроговицы 8. В зависимости от размера и глубины раны эти физические травмы болезненны и занимают несколько дней, чтобы зажить9. Оптимальные характеристики заживления ран модели облегчают понимание клеточных и молекулярных аспектов закрытия раны. Кроме того, такие модели также оказались полезными для тестирования новых молекул с потенциалом для ускорения заживления роговицы, как ранее было продемонстрировано10,11.
Протокол, описанный здесь, направлен на использование рыбок данио в качестве соответствующей модели для изучения физического повреждения роговицы. Эта модель очень удобна для фармакологических скрининговых исследований, поскольку она позволяет добавлять молекулы непосредственно в воду резервуара и, следовательно, вступать в контакт с целебной роговицей. Подробности, представленные здесь, помогут ученым провести свои исследования на модели рыбок данио. Травма in vivo выполняется с притупленным глазным заусенцем. Воздействие на эпителиальные клетки, прилегающие или находящиеся на расстоянии от него, можно проанализировать путем специфического удаления центрального эпителия роговицы. В последние годы многочисленные доклады были посвящены такому методу на роговице грызунов 12,13,14,15,16,17; однако на сегодняшний день только в одном докладе этот метод применялся к рыбкам данио18.
Из-за своей простоты физическая рана полезна для очерчивания роли эпителиальных клеток в закрытии раны. Другой устоявшейся моделью повреждения роговицы является химический ожог, особенно щелочной ожог 19,20,21. Однако такой подход косвенно повреждает всю поверхность глаза, включая периферическую роговицу и строму роговицы19. Действительно, щелочные ожоги потенциально вызывают язвы роговицы, перфорации, помутнение эпителия и быструю неоваскуляризацию22, а неконтролируемый исход щелочных ожогов дисквалифицирует этот подход для общих исследований заживления ран. Многочисленные другие методы также используются для исследования заживления ран роговицы в соответствии с конкретным направлением рассматриваемого исследования (например, полная эпителиальная санация23, сочетание химического и механического повреждения раны частичной толщины24, эксимерная лазерная абляция для ран, простирающихся до стромы25). Использование глазного заусенца ограничивает фокусную точку эпителиальной реакцией на рану и обеспечивает высокую воспроизводимость раны.
Как и при каждом способе нанесения раны, использование глазного заусенца имеет свои преимущества и недостатки. Основным недостатком является то, что реакция в основном эпителиальная, она не полностью отражает ссадины, наблюдаемые в клинических условиях. Тем не менее, этот метод имеет множество преимуществ, в том числе легкость, с которой он может быть настроен и выполнен, его точность, его воспроизводимость и тот факт, что он неинвазивный, что делает его методом, хорошо переносимым животными.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5mm burr tips</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BU-5S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1M Tris, pH 8.8</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >adhesive tabs</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Algerbrush burr, Complete instrument</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BR2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton swaps</td>
			<td >Heinz Herenz Hamburg</td>
			<td >1030128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting plate</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting tools</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >double-distilled water</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppedorf tubes, 2ml</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A5040</td>
			<td>Caution: causes irritation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G7651</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lidocaine hydrochloride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >L5647</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounts</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G301P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >101VR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pH indicator strips</td>
			<td >Macherey-Nagel</td>
			<td >92110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic spoons</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 15 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 50 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scanning electron microscope</td>
			<td >FEI</td>
			<td >Quanta 250 FEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Soft sponge</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sputter coater</td>
			<td >Quorum Technologies</td>
			<td >GQ150TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereomicroscope</td>
			<td >Leica</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis

Как прозрачная поверхность глаза, роговица играет важную роль в ясном зрении. Благодаря своему расположению эта ткань склонна к экологическим нарушениям. Действительно, травмы глаз, наиболее часто встречающиеся клинически, - это травмы роговицы. В то время как заживление ран роговицы широко изучалось у мелких млекопитающих (то есть мышей, крыс и кроликов), исследования физиологии роговицы пренебрегли другими видами, включая рыбок данио, несмотря на то, что рыбки данио являются классической исследовательской моделью.
В этом отчете описывается метод выполнения истирания роговицы на рыбках данио. Рана выполняется in vivo на обезболенных рыбах с помощью глазного заусенца. Этот метод позволяет воспроизвести эпителиальную рану, оставляя остальную часть глаза нетронутой. После истирания контролируется закрытие раны в течение 3 ч, после чего рана реэпителизируется. С помощью сканирующей электронной микроскопии с последующей обработкой изображений можно исследовать форму эпителиальных клеток и апикальные выступы для изучения различных этапов закрытия эпителиальной раны роговицы.
Характеристики модели рыбок данио позволяют изучать физиологию эпителиальной ткани и коллективное поведение эпителиальных клеток при оспаривании ткани. Кроме того, использование модели, лишенной влияния слезной пленки, может дать новые ответы относительно реакции роговицы на стресс. Наконец, эта модель также позволяет очертить клеточные и молекулярные события, участвующие в любой эпителиальной ткани, подвергшейся физической ране. Этот метод может быть применен для оценки эффективности препарата при доклинических испытаниях.

Это исследование описывает метод с использованием офтальмологического заусенца в экспериментах по заживлению ран роговицы рыбок данио. Метод модифицирован по сравнению с предыдущими исследованиями на мышах, где было показано, что заусенец эффективно удаляет эпителиальные клеточные...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis at JoVE.com

Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis

Этот протокол фокусируется на повреждении глазной поверхности рыбок данио путем истирания для оценки последующего закрытия раны на клеточном уровне. Этот подход использует глазной заусенец для частичного удаления эпителия роговицы и использует сканирующую электронную микроскопию для отслеживания изменений в морфологии клеток во время закрытия раны.

Заживление ран роговицы рыбок данио: от истирания до анализа закрытия раны

As the transparent surface of the eye, the cornea is instrumental for clear sight. Due to its location, this tissue is prone to environmental insults. ...

Прозрачность роговицы играет важную роль в прояснении зрения. В патологическом контексте эта прозрачность может быть поставлена под сомнение. Изучение механизма патогенеза требует простых моделей, имеющих высокое сходство с органом человека.В этих аспектах рыбка данио является отличной моделью. И это первое подробное описание истирания роговицы у рыбок данио. Эта техника является простым и быстрым способом вызвать поверхностный вход в глаз.Закрытие раны можно легко проследить после истирания. Кроме того, химические вещества или определенные факторы могут быть добавлены в воду резервуара для изучения их влияния на закрытие раны. Поскольку рана создается вручную, метод требует некоторой практики для получения последовательных результатов.Перед экспериментом подготовьте 0,02% рабочий раствор трикаина. Разморозить 2 мл 0,4% раствора. Добавьте до 40 мл системной воды.И поместите раствор в небольшой контейнер. Приготовьте офтальмологический заусенец, проверив, чист ли наконечник заусенца. А при необходимости удалить остатки клеток влажным ватным тампоном.Сделайте разрез в сторону мягкой губки. И смочите губку системной водой. Поместите губку на ступень рассекающего микроскопа.Обеспечьте достаточное рабочее пространство для использования заусенца. И достаточно освещения сбоку и сверху, чтобы правильно разглядеть поверхность глаза. Осторожно поместите обезболенную рыбу ложкой в разрез на губке с головкой, выступающей из поверхности губки.Осторожно подойдите к поверхности глаза кончиком заусенца. И начните движение кончика по поверхности глаза круговыми движениями. Когда истирание будет сделано, осторожно поместите рыбу в пресную систему воды, содержащую анальгетик для восстановления.Очистите заусенец сразу после использования влажным ватным тампоном. Подберите рыбу в нужный момент времени и поместите ее в 0,02% раствор трикаина. Держите животное в растворе до тех пор, пока оперкулярное движение полностью не прекратится и рыба не отреагирует на прикосновения.Поместите рыбу на чашку Петри ложкой и подержите ее пинцетом. Обезглавить рыбу рассекающими ножницами. Избегайте появления царапин на поверхности глаз.Поместите ткань в пробирку, содержащую 0,1 М фосфата натрия. И промыть его чистым буфером, чтобы в растворе не осталось крови. Зафиксируйте ткань в 2,5% глутаральдегида в 0,1 М фосфата натрия в течение 24 часов при 4 С. Удалите фиксирующий раствор и промойте образец несколько раз 0,1 М фосфата натрия.Рассекните образец, поместив его на каплю 0,1 М фосфата натрия на рассекающую пластину. Разрежьте образец головки на две части тонкими рассекающими ножницами. Кроме того, соберите глаза, осторожно поместив кончики тонкого пинцета в глазницы со стороны глаза.Затем вытащите глаз из глазницы и удалите лишнюю ткань. Переложите рассеченный образец в пробирку, содержащую 0,1 М фосфата натрия. Убедитесь, что в пробирке для образцов нет лишней ткани, так как она может прилипать к верхней части глаза во время обработки образца.Поместите крепление с помощью вкладки на держатель. И держатель к основанию рассекающего микроскопа. Аккуратно поместите образец ткани на крепление тонким пинцетом, роговицу вверх.Покрыть образец платиной с помощью соответствующего устройства. И храните образцы при комнатной температуре до получения изображения. Получайте изображения нужного увеличения.И используйте для анализа изображения от 2000 до 2500x. Отрегулируйте яркость и контрастность, чтобы четко видеть все границы клеток и микрориджи. И избегайте переэкспонированных областей на изображении.Откройте изображение TIFF с помощью Fiji ImageJ 1.53. И используйте шкалу для установки шкалы. Создайте линию, равную шкале масштаба, с помощью инструмента «Линия».Выберите Анализ. Затем установите масштаб. И набираем на известном расстоянии.Затем откройте менеджер ROI с помощью меню Анализ, Инструменты. Для параметров Размер ячейки и округлость выберите Анализ, Задать измерения, Дескрипторы фигур. И используйте инструмент «Увеличительное стекло», чтобы увидеть ячейки под увеличением.Выделите ячейки с помощью инструмента «Полигон» и добавьте каждый выделенный фрагмент в диспетчер окупаемости инвестиций. Наконец, измерьте выбранные ячейки и сохраните измерение. Чтобы продолжить анализ микрориджа, убедитесь, что изображение находится в 8-битном формате, нажав на меню Изображение, Тип.Затем выделите ячейку с помощью инструмента «Полигон». И очистите фон, нажав «Редактировать», затем «Очистить снаружи». Сгладьте изображение один-три раза, выбрав Обработать, Сгладить.И отрегулируйте яркость и контрастность от Image, Adjust, Brightness/Contrast, чтобы микрориджи выделялись как можно более четко. Сверните изображение, нажав на Процесс, Фильтры, Convolve. И превратите его в двоичный, нажав Обрабатывать, Двоичный, Сделать двоичным.Затем скелетируйте черно-белое изображение, выбрав «Обрабатывать», «Двоичный», «Скелетонизировать». Используйте функцию Анализируемый скелет для измерения параметров микрориджа и сохранения значений. Область раны закрывается через три часа после ранения.Но место, где соединяются границы раны, остается видимым. Результаты показали, что на истиранном эпителии роговицы микрориджи могут наблюдаться в некоторых вытянутых клетках рядом с местом раны. В некоторых периферических областях микрориджи теряются из центра клетки.Сравнение между двумя периферическими областями показало удлиненные клетки с более короткими средними микрориджами, что указывает на клеточные перестановки как реакцию на ранение. Эти результаты свидетельствуют о том, что изменения формы клеток коррелируют с модификацией микрориджа и подчеркивают гетерогенность в эпителии роговицы в реакции раны. Помните, что операция требует тренировки для выполнения однородной и воспроизводимой раны.Помимо электронной микроскопии, ткань может быть использована для гистологии, иммунологических окрашиваний и гибридизации in situ. Они обеспечат дальнейшее понимание клеточных и молекулярных изменений во время заживления ран. Использование рыбок данио расширяет наши знания по биологии роговицы.Кроме того, эта модель отлично подходит для фармакологических исследований и может быть использована для лучшего понимания эволюции глаз.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

РНК Изоляция от эмбриональных данио рерио и кДНК синтеза для анализа экспрессии генов

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Разработка автоматизированной обработки изображений и анализа для экранов данио химических веществ.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Получение трансгенных Xenopus laevis По рестрикции Интеграция опосредованного и ядерной трансплантации

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Живая изображения клеточных Экструзия из эпидермиса развивающихся данио рерио

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Метаболический Анализ профиля эмбрионов данио рерио

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Анализ эмбрионального и личиночного рыбок данио скелетных мышечных волокон из диссоциированных препаратов

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Методы для кожи телесные повреждения и анализы для заживления ответы в<em&gt; C. Элеганс</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Микроинъекция в данио рерио к модели острое повреждение почек

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...