Name: zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis
Uploaded: 2022-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis at JoVE.com

Författarna tackar Pertti Panula för tillgången till zebrafiskenheten och Henri Koivula för vägledningen och hjälpen med zebrafiskexperimenten. Forskningen stöddes av Finlands Akademi, Jane och Aatos Erkkos Stiftelse, Finska kulturfonden och ATIP-Avenir-programmet. Avbildningen utfördes vid elektronmikroskopienheten och ljusmikroskopienheten, Institutet för bioteknik, med stöd av HiLIFE och Biocenter Finland.

Alla försök godkändes av Djurförsöksnämnden.
1. Förberedelser
<ol><li>Förbered trikainsemilösningen som används för anestesi26 i förväg (0,4% stamlösning som används i detta protokoll). Använd handskar och förvara materialen i en dragskåpa när det är möjligt.<ol>
<li>För 50 ml av en 0,4% lösning, väg 200 mg trikainpulver i ett 50 ml rör. Lös upp pulvret i cirka 45 ml dubbeldestillerat vatten.</li>
		<li>Justera trikainsallös...

<ol>
	<li>Baden, T., Euler, T., Berens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+retinal+basis+of+vision+across+species.">Understanding the retinal basis of vision across species.</a> Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).</li><li>Nishida, T., Saika, S., Morishige, N., Manis, M. J., Holland, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea+and+sclera:+Anatomy+and+physiology.">Cornea and sclera: Anatomy and physiology.</a> Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. , 1-22 (2017).</li><li>Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions+in+the+cornea.">Stromal-epithelial interactions in the cornea.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).</li><li>Wilson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+injury+induces+keratocyte+apoptosis:+hypothesized+role+for+the+interleukin-1+system+in+the+modulation+of+corneal+tissue+organization+and+wound+healing.">Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing.</a> Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).</li><li>Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+keratocyte+proliferation+in+response+to+epithelial+debridement.">Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement.</a> Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).</li><li>West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+keratocyte:+corneal+stromal+cell+with+variable+repair+phenotypes.">The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).</li><li>Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+abrasions+and+corneal+foreign+bodies.">Corneal abrasions and corneal foreign bodies.</a> Primary Care. 42 (3), 363-375 (2015).</li><li>Ben-Eli, H., Erdinest, N., Solomon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+complications+of+chronic+eye+rubbing+in+ocular+allergy.">Pathogenesis and complications of chronic eye rubbing in ocular allergy.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 19 (5), 526-534 (2019).</li><li>Wilson, S. A., Last, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+corneal+abrasions.">Management of corneal abrasions.</a> American Family Physician. 70 (1), 123-128 (2004).</li><li>Nagata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBP485+promotes+corneal+epithelial+wound+healing.">JBP485 promotes corneal epithelial wound healing.</a> Scientific Reports. 5, 14776 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MANF+promotes+diabetic+corneal+epithelial+wound+healing+and+nerve+regeneration+by+attenuating+hyperglycemia-induced+endoplasmic+reticulum+stress.">MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress.</a> Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).</li><li>Li, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+AlgerBrush+II+rotating+burr+as+a+tool+for+inducing+ocular+surface+failure+in+the+New+Zealand+White+rabbit.">Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit.</a> Experimental Eye Research. 147, 1-11 (2016).</li><li>Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+abrasion+with+ocular+burr+as+a+model+for+cornea+wound+healing.">Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (137), e58071 (2018).</li><li>Kalha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1++progenitor+cell+dynamics+in+murine+cornea+during+homeostasis+and+wound+healing.">Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing.</a> Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).</li><li>Park, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+contribution+of+keratin-14(+)+limbal+epithelial+precursors+in+corneal+wound+healing.">Visualizing the contribution of keratin-14(+) limbal epithelial precursors in corneal wound healing.</a> Stem Cell Reports. 12 (1), 14-28 (2019).</li><li>Kuony, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectodysplasin-A+signaling+is+a+key+integrator+in+the+lacrimal+gland-cornea+feedback+loop.">Ectodysplasin-A signaling is a key integrator in the lacrimal gland-cornea feedback loop.</a> Development. 146 (14), (2019).</li><li>Farrelly, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+live+imaging+of+single+corneal+stem+cells+reveals+compartmentalized+organization+of+the+limbal+niche.">Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).</li><li>Ikkala, K., Michon, F., Stratoulias, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+Zebrafish+corneal+injury+induces+bilateral+cell+plasticity+supporting+wound+closure.">Unilateral Zebrafish corneal injury induces bilateral cell plasticity supporting wound closure.</a> Scientific Reports. , (2021).</li><li>Ormerod, L. D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+models+of+corneal+injury+using+alkali-immersed+filter+discs.">Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).</li><li>Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alkali-burn+injury+model+of+corneal+neovascularization+in+the+mouse.">An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159 (2014).</li><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+modeling+of+corneal+alkali+injury+in+the+rat+eye.">Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye.</a> Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).</li><li>Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+chemical+injuries+and+their+management.">Ocular chemical injuries and their management.</a> Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).</li><li>Pal-Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BALB/c+and+C57BL6+mouse+strains+vary+in+their+ability+to+heal+corneal+epithelial+debridement+wounds.">BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds.</a> Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).</li><li>Chen, J. J., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+corneal+epithelial+wound+healing+in+partial-thickness+removal+of+limbal+epithelium.">Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).</li><li>Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGTA+in+corneal+wound+healing+after+transepithelial+laser+ablation+in+a+rabbit+model:+a+randomized,+blinded,+placebo-controlled+study.">RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).</li><li>. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio Available from: <a target="_blank" href="https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html">https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> (2000)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+wound+closure+in+the+rabbit+cornea.+A+biphasic+process.">Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).</li><li>Parlanti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+debris+accumulates+in+corneal+epithelial+cells+after+intraepithelial+corneal+nerves+are+damaged:+A+focused+Ion+Beam+Scanning+Electron+Microscopy+(FIB-SEM)+study.">Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study.</a> Experimental Eye Research. 194, 107998 (2020).</li><li>Zhao, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+cornea:+structure+and+development.">The zebrafish cornea: structure and development.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).</li><li>Richardson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-epithelialization+of+cutaneous+wounds+in+adult+zebrafish+combines+mechanisms+of+wound+closure+in+embryonic+and+adult+mammals.">Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals.</a> Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).</li><li>van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+contraction+drives+the+3D+patterning+of+epithelial+cell+surfaces.">Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).</li><li>Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration+in+zebrafish.">Heart regeneration in zebrafish.</a> Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).</li><li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirt6+deficiency+impairs+corneal+epithelial+wound+healing.">Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing.</a> Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).</li><li>Ksander, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCB5+is+a+limbal+stem+cell+gene+required+for+corneal+development+and+repair.">ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair.</a> Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li></ol>

Hornhinneskador är den vanligaste orsaken till oftalmologiska patientbesök på sjukhuset. Därför är det viktigt att fastställa relevanta modeller för studier av olika aspekter av hornhinnans patofysiologi. Hittills är musen den vanligaste modellen för studier av hornhinnans sårläkning. Att lägga till ögondroppar på murina sårade ögon för att validera effekten av specifika läkemedel på hornhinnans sårläkning kan dock vara svårt. I detta avseende är zebrafiskmodellen särskilt användbar för farmako...

Eftersom de flesta epitelerna är i kontakt med den yttre miljön är de benägna att skadas fysiskt, vilket gör dem väl lämpade för studier av sårläkningsprocesser. Bland de välstuderade vävnaderna är hornhinnan en extremt användbar modell vid undersökningen av de cellulära och molekylära aspekterna av sårläkning. Som en transparent yttre yta ger den fysiskt skydd för ögat och är det första elementet som fokuserar ljuset på näthinnan. Medan näthinnans struktur och cellsammansättning skiljer sig åt mellan arter1, är dessa element i hornhinnan i allmänhet lika i alla kameratypsögon, oavsett art.
Hornhinnan består av tre huvudlager2. Det första och yttersta lagret är epitelet, som ständigt förnyas för att säkerställa dess transparens. Det andra skiktet är stroma, som innehåller spridda celler, kallade keratocyter, inom ett tjockt lager av strikt organiserade kollagenfibrer. Det tredje och innersta skiktet är endotelet, vilket möjliggör närings- och vätskediffusion från den främre kammaren till de yttre skikten. Epitel- och stromacellerna interagerar via tillväxtfaktorer och cytokiner3. Denna interaktion framhävs av den snabba apoptosen och efterföljande proliferation av keratocyter efter epitelskada 4,5. Vid ett djupare sår, såsom en punktering, tar keratocyter en aktiv roll i läkningsprocessen6.
Att vara i kontakt med den yttre miljön är fysiska skador på hornhinnan vanliga. Många av dem orsakas av små främmande föremål7, såsom sand eller damm. Reflexen av ögongnuggning kan leda till omfattande epitelnötning och hornhinneremodellering8. Enligt sårstorlek och djup är dessa fysiska skador smärtsamma och tar flera dagar att läka9. De optimala sårläkningsegenskaperna hos en modell underlättar förståelsen av de cellulära och molekylära aspekterna av sårförslutning. Dessutom har sådana modeller också visat sig vara användbara för att testa nya molekyler med potential att påskynda hornhinneläkning, vilket tidigare visat 10,11.
Protokollet som beskrivs här syftar till att använda zebrafisk som en relevant modell för att studera fysisk skada på hornhinnan. Denna modell är mycket lämplig för farmakologiska screeningstudier eftersom den gör det möjligt att tillsätta molekyler direkt till tankvattnet och därför komma i kontakt med en helande hornhinna. Detaljerna som tillhandahålls här kommer att hjälpa forskare att utföra sina studier på zebrafiskmodellen. In vivo-skadan utförs med en tråkig okulär burr. Påverkan på epitelceller som gränsar till eller på avstånd från den kan analyseras genom att specifikt avlägsna det centrala hornhinneepitelet. Under de senaste åren har många rapporter fokuserat på en sådan metod på gnagare hornhinna 12,13,14,15,16,17; Hittills har dock endast en enda rapport tillämpat denna metod på zebrafisk18.
På grund av sin enkelhet är det fysiska såret användbart för att avgränsa epitelcellernas roll i sårförslutning. En annan väletablerad modell av hornhinneskada är den kemiska bränningen, särskilt alkaliförbränningen 19,20,21. Ett sådant tillvägagångssätt skadar emellertid indirekt hela ögonytan, inklusive perifer hornhinna och hornhinnan stroma19. Faktum är att alkalibrännskador potentiellt inducerar hornhinnesår, perforeringar, epitelial opacifiering och snabb neovaskularisering22, och det okontrollerbara resultatet av alkalibrännskador diskvalificerar det tillvägagångssättet för allmänna sårläkningsstudier. Många andra metoder används också för att undersöka sårläkning av hornhinnan enligt den aktuella studiens särskilda fokus (t.ex. fullständig epiteldebridering23, kombinationen av kemisk och mekanisk skada för partiell tjocklek sår24, excimerlaserablation för sår som sträcker sig till stroma25). Användningen av en okulär burr begränsar brännpunkten till epitelsvaret på såret och ger ett mycket reproducerbart sår.
Som med varje metod för sårföring har användningen av en okulär burr fördelar och nackdelar. Den största nackdelen är att svaret mestadels är epitelialt, det återspeglar inte perfekt de nötningar som ses i den kliniska miljön. Denna metod har emellertid många fördelar, inklusive den lätthet med vilken den kan ställas in och utföras, dess precision, dess reproducerbarhet och det faktum att den är icke-invasiv, vilket gör den till en metod som tolereras väl av djur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td >Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5mm burr tips</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BU-5S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1M Tris, pH 8.8</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >adhesive tabs</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Algerbrush burr, Complete instrument</td>
			<td >Alger Equipment Company</td>
			<td >BR2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton swaps</td>
			<td >Heinz Herenz Hamburg</td>
			<td >1030128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting plate</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting tools</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >double-distilled water</td>
			<td >in-house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppedorf tubes, 2ml</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A5040</td>
			<td>Caution: causes irritation.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >G7651</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lidocaine hydrochloride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >L5647</td>
			<td>Caution: toxic.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounts</td>
			<td >Agar Scientific</td>
			<td >G301P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dish</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >101VR20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pH indicator strips</td>
			<td >Macherey-Nagel</td>
			<td >92110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic spoons</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 15 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic tubes, 50 ml</td>
			<td >Greiner Bio-One</td>
			<td >227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scanning electron microscope</td>
			<td >FEI</td>
			<td >Quanta 250 FEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Soft sponge</td>
			<td >any provider</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sputter coater</td>
			<td >Quorum Technologies</td>
			<td >GQ150TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereomicroscope</td>
			<td >Leica</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish corneal wound healing: from abrasion to wound closure imaging analysis

Som ögats genomskinliga yta är hornhinnan avgörande för klar syn. På grund av sin plats är denna vävnad benägen för miljöförolämpningar. Faktum är att de ögonskador som oftast uppstår kliniskt är de till hornhinnan. Medan hornhinnans sårläkning har studerats i stor utsträckning hos små däggdjur (dvs. möss, råttor och kaniner), har hornhinnefysiologiska studier försummat andra arter, inklusive zebrafisk, trots att zebrafisk är en klassisk forskningsmodell.
Denna rapport beskriver en metod för att utföra en hornhinnnötning på zebrafisk. Såret utförs in vivo på sövd fisk med användning av en okulär burr. Denna metod möjliggör ett reproducerbart epitelsår och lämnar resten av ögat intakt. Efter nötning övervakas sårförslutning under 3 timmar, varefter såret reepitelialiseras. Genom att använda svepelektronmikroskopi, följt av bildbehandling, kan epitelcellformen och apikala utsprång undersökas för att studera de olika stegen under hornhinnans epitelsårstängning.
Egenskaperna hos zebrafiskmodellen möjliggör studier av epitelvävnadsfysiologin och epitelcellernas kollektiva beteende när vävnaden utmanas. Dessutom kan användningen av en modell som berövas tårfilmens inflytande ge nya svar om hornhinnans svar på stress. Slutligen tillåter denna modell också avgränsningen av de cellulära och molekylära händelserna som är involverade i någon epitelvävnad som utsätts för ett fysiskt sår. Denna metod kan tillämpas på utvärdering av läkemedelseffektivitet vid preklinisk testning.

Denna studie beskriver en metod som använder en oftalmisk burr i zebrafisk hornhinnans sårläkningsexperiment. Metoden är modifierad från tidigare studier på möss, där burren visade sig ta bort epitelcellskikten effektivt13. Utmaningarna i zebrafisk hornhinnesår inkluderar den relativt lilla storleken på ögat, och i fallet med tidskrävande experiment, behovet av att upprätthålla ett konstant vattenflöde genom gälarna (som beskrivs av Xu och kollegor28). De fr...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis at JoVE.com

Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis

Detta protokoll fokuserar på att skada zebrafiskens okulära yta genom nötning för att bedöma den efterföljande sårförslutningen på cellulär nivå. Detta tillvägagångssätt utnyttjar en okulär burr för att delvis avlägsna hornhinnans epitel och använder svepelektronmikroskopi för att spåra förändringar i cellmorfologi under sårförslutning.

Zebrafish Corneal Wound Healing: Från nötning till sårförslutning Imaging Analysis

As the transparent surface of the eye, the cornea is instrumental for clear sight. Due to its location, this tissue is prone to environmental insults. ...

Hornhinnans transparens är avgörande för att rensa synen. I patologiska sammanhang kan denna öppenhet vara en utmaning. Att studera patogenesmekanismen kräver enkla modeller med hög likhet med det mänskliga organet.I dessa aspekter är zebrafisk en utmärkt modell. Och det här är den första detaljerade beskrivningen av hornhinnans nötning i zebrafisk. Denna teknik är ett enkelt och snabbt sätt att inducera ytinträde i ögat.Sårförslutningen kan enkelt följas efter nötning. Dessutom kan kemikalier eller specifika faktorer tillsättas till tankvattnet för att studera deras inverkan på sårförslutning. Eftersom såret skapas manuellt kräver metoden viss övning för att få konsekventa resultat.Före experimentet, förbered en 0,02% arbetslösning av trikain. Tina 2 ml 0,4% lagerlösning. Lägg till 40 ml systemvatten.Och placera lösningen i en liten behållare. Ha den oftalmiska burren redo genom att kontrollera om burrspetsen är ren. Och om det behövs, ta bort cellskrot med en fuktig bomullspinne.Gör ett snitt på sidan av en mjuk svamp. Och fukta svampen med systemvatten. Placera svampen på scenen i ett dissekerande mikroskop.Se till att det finns tillräckligt med arbetsutrymme för att använda burren. Och tillräckligt med belysning från sidan och över för att se ögonytan korrekt. Placera försiktigt den bedövade fisken med en sked i snittet på svampen med huvudet utskjutande från svampytan.Närma dig försiktigt ögonytan med burrspetsen. Och börja flytta spetsen på ögonytan med en cirkulär rörelse. När nötningen är klar, placera försiktigt fisken i färsksystemet vatten som innehåller smärtstillande medel för återhämtning.Rengör burren omedelbart efter användning med en fuktig bomullspinne. Plocka upp fisken vid önskad tidpunkt och placera den i 0,02% trikainlösning. Håll djuret i lösningen tills den operkulära rörelsen har upphört helt och fisken reagerar inte på beröring.Lägg fisken på en petriskål med en sked och håll den med pincett. Halshugg fisken med dissekerande sax. Undvik att göra repor på ögonytan.Sätt vävnaden i ett provrör innehållande 0,1 M natriumfosfat. Och skölj den med en ren buffert så att inget blod finns kvar i lösningen. Fixera vävnaden i 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumfosfat i 24 timmar vid 4 C.Ta bort fixeringslösningen och skölj provet flera gånger med 0,1 M natriumfosfat.Dissekera provet genom att placera det på en droppe av 0,1 M natriumfosfat på en dissekeringsplatta. Skär huvudprovet i två med fin dissekerande sax. Alternativt kan du samla ögonen genom att försiktigt placera spetsarna på fin pincett i ögonhålorna från sidan av ögat.Dra sedan ut ögat från uttaget och ta bort extra vävnad. Överför det dissekerade provet till ett rör innehållande 0,1 M natriumfosfat. Se till att det inte finns någon extra vävnad i provröret, eftersom det kan fästa på toppen av ögat under provbehandling.Placera fästet med fliken på en hållare. Och hållaren till basen av ett dissekerande mikroskop. Placera försiktigt vävnadsprovet på fästet med fin pincett, hornhinnan uppåt.Belägg provet med platina med lämplig anordning. Och förvara proverna vid rumstemperatur tills avbildning. Skaffa bilder av önskad förstoring.Och använd 2000 till 2500x bilder för analys. Justera ljusstyrkan och kontrasten för att tydligt se alla cellgränser och mikroridge. Och undvik överexponerade områden i bilden.Öppna TIFF-bilden med Fiji ImageJ 1.53. Och använd en skalstång för att ställa in skalan. Skapa en linje som är lika med skalningsfältet med verktyget Linje.Välj Analysera. Ställ sedan in skala. Och skriv in det kända avståndet.Öppna sedan ROI-hanteraren med menyn Analysera, Verktyg. För cellstorlek och rundhet väljer du Analysera, Ange mätningar, Formbeskrivningar. Och använd förstoringsglasverktyget för att se cellerna under förstoring.Markera celler med Polygon-verktyget och lägg till varje val i ROI-hanteraren. Slutligen mäter du de valda cellerna och sparar mätningen. För att fortsätta med microridge-analys, se till att bilden är i 8-bitarsformat genom att klicka på menyn Bild, Skriv.Välj sedan cellen med Polygon-verktyget. Och rensa bakgrunden genom att klicka på Redigera och sedan Rensa utanför. Jämna ut bilden en till tre gånger genom att välja Process, Smooth.Och justera ljusstyrkan och kontrasten från Bild, Justera, Ljusstyrka/Kontrast, så att mikrokylskåpen sticker ut så tydligt som möjligt. Konvolvera bilden genom att klicka på Process, Filters, Convolve. Och förvandla det till binärt genom att klicka på Process, Binary, Make Binary.Skelettisera sedan den svartvita bilden genom att välja Process, Binary, Skeletonize. Använd funktionen Analyserat skelett för att mäta mikroridgeparametrarna och spara värdena. Sårområdet är stängt vid tre timmar efter sår.Men platsen där sårgränserna förenas förblir synlig. Resultaten visade att på slipade hornhinneepitele kan mikroridge observeras i vissa långsträckta celler bredvid sårstället. I vissa perifera regioner förloras mikrokylorna från mitten av cellen.En jämförelse mellan de två perifera regionerna visade långsträckta celler med kortare genomsnittliga mikroridges, vilket indikerar cellomläggningar som en reaktion på sår. Dessa resultat tyder på att cellformförändringar korrelerar med mikroridgemodifiering och betonar heterogeniteten inom hornhinnans epitel i sårrespons. Kom ihåg att operationen kräver träning för att utföra ett homogent och reproducerbart sår.Förutom elektronmikroskopi kan vävnaden användas för histologi, immunologiska färgningar och in situ-hybridisering. Dessa kommer att ge ytterligare insikt i cellen och molekylära förändringar under sårläkning. Att använda zebrafisk breddar vår kunskap om hornhinnebiologi.Dessutom är denna modell utmärkt för farmakologiska studier och kan användas för att förstå mer om ögonutveckling.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

RNA Isolering från embryonala Zebrafish och cDNA syntes för Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

Utveckling av automatiserad bildbehandling och analys för zebrafisk kemiska skärmar.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Produktion av Transgena Xenopus laevis Genom begränsning enzymmedierad Integration och Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Bildproduktion för cell Extrudering från överhuden av utvecklingsländer Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Metabolisk profil Analys av zebrafisk embryon

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analys av embryonala och Larvernas Zebrafish Skelett myofibers från Dissocierade Förberedelser

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder för Skin såra och Analyser för Wound-svar i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxin mikroinjektion i Zebrafish till Model akut njursvikt

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...