Name: size exclusion chromatography for separating extracellular vesicles from conditioned cell culture media
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier Penn State Behrend et la Hamot Health Foundation pour leur financement, ainsi que le Penn State Microscopy Facility à University Park, en Pennsylvanie.

1. Préparation des tampons et des réactifs
REMARQUE: Fabriquez des réactifs de culture cellulaire dans la hotte de culture cellulaire pour maintenir la stérilité.
<ol><li>Préparation de réactifs de culture cellulaire<ol><li>Préparer une glycémie DMEM normale à haute teneur en glucose en ajoutant 50 mL de FBS et 5 mL de pénicilline-streptocoque (Pen-Strep) dans 500 mL de DMEM à haute teneur en glucose et conserver à 4 °C. Utilisez ce milieu pour cultiver et dil...

<ol>
	<li>Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+evidence+for+externalization+of+the+transferrin+receptor+in+vesicular+form+in+sheep+reticulocytes.">Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).</li><li>Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+endocytosis+of+transferrin+and+recycling+of+the+transferrin+receptor+in+rat+reticulocytes.">Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Rontogianni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+extracellular+vesicles+allows+for+human+breast+cancer+subtyping.">Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping.</a> Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).</li><li>Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+circulating+cancer+biomarkers:+opportunities+and+challenges.">Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14 (2018).</li><li>Thompson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+neurodegenerative+disease-pathogenesis+to+biomarkers.">Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).</li><li>O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake,+functionality,+and+re-release+of+extracellular+vesicle-encapsulated+cargo.">Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo.</a> Cell Reports. 39 (2), 110651 (2022).</li><li>Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+extracellular+vesicles+and+release+of+their+cargo+from+endosomes.">Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).</li><li>Willms, E., Caba&#241;as, C., M&#228;ger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+heterogeneity:+Subpopulations,+isolation+techniques,+and+diverse+functions+in+cancer+progression.">Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).</li><li>Tzaridis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+separation+techniques+impact+results+from+human+blood+samples:+Considerations+for+diagnostic+applications.">Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211 (2021).</li><li>Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+isolation+and+separation+techniques+for+extracellular+vesicles.">Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles.</a> Journal of Chromatography A. 1636, 461773 (2021).</li><li>G&#225;mez-Valero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography-based+isolation+minimally+alters+extracellular+vesicles'+characteristics+compared+to+precipitating+agents.">Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li><li>Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+functionality+of+extracellular+vesicles+isolated+using+size-exclusion+chromatography+compared+to+ultracentrifugation.">Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).</li><li>Campos-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+detection+of+extracellular+vesicles+immune-captured+from+urine+by+conventional+flow+cytometry.">High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2042 (2019).</li><li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1CAM+is+not+associated+with+extracellular+vesicles+in+human+cerebrospinal+fluid+or+plasma.">L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma.</a> Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Mathieu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+exosome+versus+small+ectosome+secretion+revealed+by+live+intracellular+tracking+of+CD63+and+CD9.">Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+simplified+dichotomic+size-exclusion+chromatography+for+isolating+extracellular+vesicles+toward+clinical+applications.">Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145 (2021).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies.">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).</li><li>Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+macromolecular+complexes+for+cryo-electron+microscopy.">Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3239 (2007).</li><li>Williams, R. L., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+shape+of+the+ESCRT+machinery.">The emerging shape of the ESCRT machinery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).</li><li>Willms, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+release+subpopulations+of+exosomes+with+distinct+molecular+and+biological+properties.">Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).</li><li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses.">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).</li><li>B&#246;ing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography.">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li><li>Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three+step+protocol+to+isolate+extracellular+vesicles+from+plasma+or+cell+culture+medium+with+both+high+yield+and+purity.">A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450 (2020).</li><li>Guerreiro, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+extracellular+vesicle+isolation+by+combining+cell+media+modifications,+ultrafiltration,+and+size-exclusion+chromatography.">Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography.</a> PLoS ONE. 13 (9), 02024276 (2018).</li><li>On&#243;di, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-purity+extracellular+vesicles+by+the+combination+of+iodixanol+density+gradient+ultracentrifugation+and+bind-elute+chromatography+from+blood+plasma.">Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1479 (2018).</li><li>Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-isolation+of+extracellular+vesicles+and+high-density+lipoproteins+using+density+gradient+ultracentrifugation.">Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li></ol>

SEC est une méthode conviviale pour séparer adéquatement les véhicules électriques des CCM conditionnés. Afin d’isoler spécifiquement les VE dérivés de cellules, il faut tenir compte d’un examen attentif du type de CCM et de ses suppléments. De nombreux milieux de culture cellulaire doivent être complétés par du FBS, qui contient des VE dérivés de l’animal chez lequel le sérum a été récolté. Ces VE sériques peuvent saturer et masquer tout signal produit par les VE dérivés de cellules en cultu...

L’explosion de l’intérêt pour l’étude des vésicules extracellulaires (VE) s’est accompagnée de progrès majeurs dans les technologies et les techniques utilisées pour séparer et étudier ces particules hétérogènes de taille nanométrique. Depuis leur découverte il y a près de quatre décennies1,2, ces petites structures membraneuses contiennent des lipides, des acides nucléiques et des protéines bioactifs et jouent un rôle majeur dans la communication intercellulaire 3,4. Les VE sont libérés par tous les types de cellules et sont donc présents dans tous les liquides biologiques, y compris le plasma sanguin et le sérum, la salive et l’urine. Les VE dans ces fluides sont très prometteurs pour servir de biomarqueurs non invasifs pour diverses maladies, y compris les maladies neuroinflammatoires et neurodégénératives, les cancers et les maladies auto-immunes 5,6,7. De plus, des études mécanistes in vitro peuvent être réalisées au moyen de techniques de culture cellulaire en séparant les VE libérés dans le milieu de culture 3,8,9.
Pour comprendre le rôle des VE dans la physiopathologie de la maladie, une séparation adéquate du liquide dans lequel ils se trouvent est primordiale. L’étalon-or pour la séparation des véhicules électriques a longtemps été l’ultracentrifugation différentielle (dUC)10, mais des techniques plus sophistiquées ont vu le jour pour obtenir une meilleure séparation des véhicules électriques des autres composants extracellulaires. Certaines de ces techniques comprennent les gradients de densité, la fraction d’écoulement en champ à flux asymétrique (A4F), la cytométrie en flux, l’immunocapture, la précipitation au polyéthylèneglycol et la chromatographie d’exclusion de taille (SEC)11,12,13. Chaque technique a son propre ensemble d’avantages et d’inconvénients; cependant, il a été démontré que la SEC en particulier sépare assez efficacement les VE des fluides biologiques et des surnageants de culture cellulaire 8,14,15. SEC a également l’avantage supplémentaire d’être relativement simple et convivial.
La SEC est une méthode qui sépare les composants d’un fluide en fonction de leur taille. Avec cette technique, une colonne de résine (fabriquée en interne ou achetée dans le commerce) est utilisée pour fractionner un échantillon. Les petites particules dans l’échantillon sont piégées entre les billes dans la résine, tandis que les particules plus grosses sont capables de passer à travers la résine plus librement, et donc éluer plus tôt dans le processus. Parce que les VE sont plus grands en taille que de nombreuses protéines extracellulaires et agrégats de protéines, les VE traversent la colonne plus rapidement et éluent dans des fractions plus précoces que les protéines extracellulaires14.
Dans cet article sur les méthodes, l’utilisation de la SEC pour la séparation des VE des milieux de culture cellulaire (CCM) des oligodendrocytes humains dans des conditions de contrôle et de stress du réticulum endoplasmique (RE) est décrite. À l’aide de ce protocole, il est démontré que les VE séparés par cette technique se trouvent dans des fractions spécifiques qui peuvent être regroupées et concentrées pour la caractérisation en aval, et que les VE séparés sont dérivés de cellules et non d’une source exogène telle que le sérum bovin fœtal (FBS) utilisé pour compléter la CCM. La présence des marqueurs EV canoniques, CD63, CD81 et CD916,17,18,19 dans les fractions EV, et leur absence dans les fractions protéiques est démontrée par le Western blotting. En utilisant la microscopie électronique à transmission (MET), les VE sont visualisés et affichent la morphologie attendue et ne sont observés que dans la fraction EV. Les particules sont également comptées dans les fractions EV et protéique des conditions de contrainte témoin et ER, et un grand nombre de particules dans la plage de taille prévue de 50 à 200 nm de diamètre sont observées dans les échantillons EV. Ensemble, ces données appuient l’idée que la SEC est une méthode efficiente et efficace pour séparer les VE des milieux de culture cellulaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>3 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC200324</td>
			<td>3 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074V</td>
			<td>1:1000 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calnexin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>&#160;ab22595</td>
			<td>1:500 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>312102</td>
			<td>1:500 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GM130 antibody [EP892Y] - cis-Golgi Marker</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52649</td>
			<td>1:500 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076V</td>
			<td>1:1000 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Fraction Collector</td>
			<td>Izon Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Gatan Orius SC200</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cd63 Mouse anti Human</td>
			<td>BD</td>
			<td>556019</td>
			<td>1:1000 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-23962</td>
			<td>1:1000 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imager</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1705061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3483-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH300022.FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Premium grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, exosome-depleted</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Great Value Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B076NRD2TZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOG Human Oligodendroglioma Cell Line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCC163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk</td>
			<td>Izon Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol &#62;99.8% ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Glass plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653310</td>
			<td>with 0.75mm spacers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Short plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin,Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP66150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce PVDF Transfer Membranes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Western Blotting Filter Paper</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>84783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>TB0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5872S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab125011</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SX0603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate,&#8805;99.0% (GC), dust-free pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75746-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>FEI Tecnai 12 Biotwin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeta View software</td>
			<td>Analytik</td>
			<td></td>
			<td>NTA software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

size exclusion chromatography for separating extracellular vesicles from conditioned cell culture media

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des structures liées à la membrane lipidique de taille nanométrique qui sont libérées par toutes les cellules, sont présentes dans tous les biofluides et contiennent des protéines, des acides nucléiques et des lipides qui reflètent la cellule mère dont elles sont dérivées. La séparation appropriée des véhicules électriques des autres composants d’un échantillon permet de caractériser leur cargaison associée et donne un aperçu de leur potentiel en tant que communicateurs intercellulaires et biomarqueurs non invasifs pour de nombreuses maladies. Dans la présente étude, des VE dérivés d’oligodendrocytes ont été isolés à partir de milieux de culture cellulaire à l’aide d’une combinaison de techniques de pointe, y compris l’ultrafiltration et la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) pour séparer les VE des autres protéines extracellulaires et complexes protéiques. À l’aide de colonnes SEC disponibles dans le commerce, les VE ont été séparés des protéines extracellulaires libérées par les cellules d’oligodendrogliome humain dans des conditions de stress de contrôle et de réticulum endoplasmique (RE). Les marqueurs EV canoniques CD9, CD63 et CD81 ont été observés dans les fractions 1-4, mais pas dans les fractions 5-8. GM130, une protéine de l’appareil de Golgi, et la calnexine, une protéine intégrale du RE, ont été utilisés comme marqueurs EV négatifs, et n’ont été observés dans aucune fraction. De plus, en regroupant et en concentrant les fractions 1 à 4 en tant que fraction EV et les fractions 5 à 8 en tant que fraction protéique, l’expression de CD63, CD81 et CD9 dans la fraction EV a été observée. L’expression de GM130 ou de calnexine n’a été observée dans aucun des types de fraction. Les fractions regroupées des conditions de contrôle et de stress ER ont été visualisées par microscopie électronique à transmission et des vésicules ont été observées dans les fractions EV, mais pas dans les fractions protéiques. Les particules dans l’EV et les fractions protéiques des deux conditions ont également été quantifiées avec une analyse de suivi des nanoparticules. Ensemble, ces données démontrent que la SEC est une méthode efficace pour séparer les VE des milieux de culture cellulaire conditionnés.

Le transfert Western révèle une séparation adéquate des véhicules électriques et de la moelle caustique calcinée Pour évaluer l’efficacité de la SEC pour séparer les VE des milieux de culture cellulaire, un transfert Western a été effectué en utilisant chaque fraction individuelle des échantillons témoins pour sonder l’expression des trois marqueurs VE canoniques, CD9, CD63 et CD81, ainsi que GM130 et calnexine18, qui ont été utilisés comme témoins négat...

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Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media

Le protocole démontre ici que les vésicules extracellulaires peuvent être séparées de manière adéquate des milieux de culture cellulaire conditionnés en utilisant la chromatographie d’exclusion de taille.

Chromatographie d’exclusion de taille pour séparer les vésicules extracellulaires des milieux de culture cellulaire conditionnés

Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized lipid-membrane bound structures that are released from all cells, are present in all biofluids, and contain ...

La séparation des vésicules extracellulaires des fluides tels que les milieux de culture cellulaire peut permettre aux chercheurs de caractériser la cargaison vesticulaire et d’explorer leurs mécanismes de communication intracellulaire. Cette technique permet une séparation suffisante des VE et des protéines extracellulaires des milieux de culture cellulaire conditionnés qui est simple et conviviale. Pour commencer, placez PBS dans un bain-marie de 37 degrés Celsius.Observer les flacons de culture cellulaire témoins et traités à la tunicamycine sous un microscope composé avec une lentille d’objectif 10 x et 100 x. Prendre note de toute différence entre les flacons. Retirez le milieu de la fiole et placez-le dans un tube de 50 millilitres.Ensuite, centrifuger le tube à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et transférer le surnageant dans un nouveau tube. Centrifuger le tube à 2000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le super nageant dans un nouveau tube et placer le tube sur de la glace.Prenez quatre unités d’ultrafiltration de coupure de 15 millilitres et trois kilodaltons et ajoutez cinq millilitres de PBS à chaque tube. Amorcez les filtres en centrifugeant les unités à 4 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le PBS des unités, diviser le surnageant du témoin et des conditions traitées en deux unités d’ultrafiltration contenant chacune environ 12,5 millilitres de fluide.Centrifuger les tubes à 4 000 g pendant une heure 45 minutes à quatre degrés Celsius ou jusqu’à ce que le milieu concentré ou le rétentat dans chaque unité soit concentré à 250 microlitres ou moins. Transférer le rétentat des deux unités de contrôle dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre marqué et des unités traitées dans un autre tube. Mesurer le volume total du rétentat dans chaque tube microcentrifugé.Si le volume est inférieur à 500 microlitres, ajoutez du PBS filtré de 0,22 micron jusqu’à ce que le volume final soit de 500 microlitres. Placez les tubes dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Activez le collecteur automatique de fractions ou AFC.Retirez la colonne de quatre degrés Celsius et laissez-la se réchauffer à température ambiante. Retirez les échantillons de rétention du congélateur à moins 80 degrés Celsius et placez-les sur de la glace pour les décongeler, en attendant, placez huit tubes étiquetés de 1,5 millilitre dans le carrousel AFC avec les couvercles orientés vers l’intérieur. Insérez la colonne dans l’AFC avec le code-barres face au lecteur et ajustez les paramètres pour collecter huit fractions de 500 microlitres chacune et le volume tampon par défaut.Vérifiez ensuite les instructions à l’écran pour démarrer la collecte. Une fois que le tampon de stockage est complètement absorbé dans la partie supérieure de la matrice de colonnes. Commencez à rincer la colonne en ajoutant 15 millilitres de PBS à la colonne.N’ajoutez pas de PBS trop tôt car cela diluerait le tampon de stockage et empêcherait un rinçage adéquat. Juste avant que les 15 millilitres de PBS ne soient absorbés par la matrice, cliquez sur OK pour arrêter le rinçage et enlever tout PBS résiduel du haut de la matrice colonne avec une micro-pipette. Ne touchez pas à la matrice.Ajoutez 500 microlitres d’échantillon au centre de la colonne et cliquez sur OK pour commencer l’exécution. Une fois que l’échantillon est complètement absorbé dans la matrice, ajoutez immédiatement huit millilitres de PBS à la colonne. AFC dissipe automatiquement le volume vide au centre du carrousel avant de collecter les huit fractions de 500 microlitres chacune.Après la course, retirez les fractions du carrousel et placez-les sur la glace. Retirez ensuite le volume vide du centre du carrousel. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de PBS à la colonne pour laver tout échantillon résiduel de la colonne.Et une fois que l’échantillon repenti a été complètement rincé, ajoutez 15 millilitres de PBS à la colonne. Au fur et à mesure que le PBS final est absorbé par la matrice, ajoutez 500 microlitres d’hydroxyde de sodium 0,5 molaire au centre de la matrice de la colonne. Ensuite, lorsque l’hydroxyde de sodium est absorbé, ajoutez 30 millilitres de PBS à la colonne et laissez-la rincer.Une fois tous les échantillons terminés, conservez la colonne pour une utilisation ultérieure en ajoutant 15 millilitres d’azoture de sodium à 0,05% à la colonne. Laissez environ cinq millilitres d’azoture de sodium sur le dessus de la matrice de colonne. Retirez la colonne de l’AFC et fixez les capuchons supérieur et inférieur avant de placer la colonne à quatre degrés Celsius pour le stockage.Construire l’unité d’ultrafiltration. Obtenir deux millilitres, trois unités d’ultrafiltration de coupure de trois kilodaltons par échantillon. Chaque unité est composée de trois parties, cône, filtre et cylindre à flux.Étiquetez chaque partie correctement. Ajouter un millilitre de PBS à la partie filtrante et bouchonner avec la pièce conique. Centrifuger le cône de l’unité d’ultrafiltration vers le haut à 3 500 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et retirer le PBS filtré du cylindre à écoulement.Retournez l’unité d’ultrafiltration et centrifugez pendant deux minutes à 1000 G à quatre degrés Celsius pour éliminer le PBS restant. Combinez quatre 500 microlitres de chaque fraction et ajoutez-les à l’unité d’ultrafiltration. Ensuite, les colonnes de centrifugeuses coïncident pendant une heure, 45 minutes à 3 500 G à quatre degrés Celsius ou jusqu’à ce que le niveau de rétention soit à 100 microlitres.Retirez le cylindre d’écoulement et jetez le flux traversant. Retournez l’unité d’ultrafiltration et centrifugez pendant deux minutes à 1000 XG à quatre degrés Celsius. Transférer le rétentat dans le cône dans un tube de 1,5 millilitre et porter le volume de l’échantillon à 150 microlitres avec du PBS filtré de 0,22 micron avant de placer les tubes dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius.Un bloc occidental représentatif de fractions individuelles a montré une forte expression de CD9, CD63 et CD81. Infractions de un à quatre avec peu ou pas d’infractions d’expression cinq à huit. Aucune expression de GM130 ou de calnexine n’a été observée dans aucune fraction.L’albumine n’était présente que par fractions six à huit. L’efficacité de la concentration des fractions EV et protéique a également été évaluée. L’expression de CD9 et CD63 a été observée dans les lysats cellulaires.Les trois protéines CD étaient présentes dans les fractions EV des échantillons témoins et traités à la tunicamycine, mais pas dans les fractions protéiques. Le gène de susceptibilité tumorale 101 était présent dans les lysats cellulaires, mais pas dans les fractions EV ou protéiques. Le GM130 et la calnexine n’ont été observés que dans les lysats cellulaires.Dans le Western blot des milieux de culture cellulaire appauvris en exosomes, les marqueurs EV étaient présents dans les lysats cellulaires, mais pas dans les échantillons de milieux. L’expression de l’albumine a été observée dans les fractions protéiques et l’expression minimale dans les lysats cellulaires. Les observations TEM ont démontré des structures sphériques dans les fractions EV des échantillons témoins et traités à la tunicamycine.Ces structures n’ont pas été observées dans les fractions protéiques des deux types d’échantillons. L’analyse de suivi des nanoparticules révèle des différences dans les concentrations de particules des fractions témoins et traitées dans les fractions EV par rapport au contrôle, un peu plus de particules étaient présentes dans le traitement à la tunicamycine. Cependant, dans les fractions protéiques, moins de particules ont été détectées par rapport aux VE.Il est important d’avoir le même volume d’échantillon pour les conditions de contrôle et traitées, ce qui permet de comparer facilement les VE des différents traitements. Après avoir séparé les VE des milieux de culture cellulaire de la condition, nous pouvons caractériser la teneur en protéines, ARN et lipides des vésicules avec le séquençage protéomique de l’ARN et la lipidomique.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Recherche

Neurosciences

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Culture organotypique d&#39;exprimant la GFP embryons de souris pour les images en temps réel d&#39;excroissance des nerfs périphériques

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

La culture de moteur primaire et neurones sensoriels de médias définis sur les échafaudages électrofilées poly-L-lactide nanofibres

Electrospinning is a technique for producing micro- to nano-scale fibers. Fibers can be electrospun with varying degrees of alignment, from highly aligned ...

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

Localisation des protéines en 3D de la culture de cellules souches neuronales: une méthodologie de visualisation hybride

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Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

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Cinématique oculaire mesurée In Vitro la stimulation des nerfs crâniens de la tortue

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Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment

Caractérisation des vésicules extracellulaires dérivées d’une cellule immunitaire et étude de l’impact fonctionnel sur l’environnement cellulaire

The neuroinflammatory state of the central nervous system (CNS) plays a key role in physiological and pathological conditions. Microglia, the resident ...

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