Name: size exclusion chromatography for separating extracellular vesicles from conditioned cell culture media
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare la Penn State Behrend e la Hamot Health Foundation per i finanziamenti, nonché la Penn State Microscopy Facility di University Park, PA.

1. Preparazione di tamponi e reagenti
NOTA: Produrre reagenti di coltura cellulare nella cappa di coltura cellulare per mantenere la sterilità.
<ol><li>Preparazione di reagenti di coltura cellulare<ol><li>Preparare il normale DMEM ad alto contenuto di glucosio aggiungendo 50 ml di FBS e 5 ml di penicillina-streptococco (Pen-Strep) in 500 ml di DMEM ad alto contenuto di glucosio e conservare a 4 °C. Utilizzare questo mezzo per la coltura e l'espansione delle cellule.</li>
...

<ol>
	<li>Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+evidence+for+externalization+of+the+transferrin+receptor+in+vesicular+form+in+sheep+reticulocytes.">Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).</li><li>Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+endocytosis+of+transferrin+and+recycling+of+the+transferrin+receptor+in+rat+reticulocytes.">Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Rontogianni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+extracellular+vesicles+allows+for+human+breast+cancer+subtyping.">Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping.</a> Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).</li><li>Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+circulating+cancer+biomarkers:+opportunities+and+challenges.">Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14 (2018).</li><li>Thompson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+neurodegenerative+disease-pathogenesis+to+biomarkers.">Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).</li><li>O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake,+functionality,+and+re-release+of+extracellular+vesicle-encapsulated+cargo.">Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo.</a> Cell Reports. 39 (2), 110651 (2022).</li><li>Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+extracellular+vesicles+and+release+of+their+cargo+from+endosomes.">Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).</li><li>Willms, E., Caba&#241;as, C., M&#228;ger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+heterogeneity:+Subpopulations,+isolation+techniques,+and+diverse+functions+in+cancer+progression.">Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).</li><li>Tzaridis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+separation+techniques+impact+results+from+human+blood+samples:+Considerations+for+diagnostic+applications.">Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211 (2021).</li><li>Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+isolation+and+separation+techniques+for+extracellular+vesicles.">Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles.</a> Journal of Chromatography A. 1636, 461773 (2021).</li><li>G&#225;mez-Valero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography-based+isolation+minimally+alters+extracellular+vesicles'+characteristics+compared+to+precipitating+agents.">Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li><li>Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+functionality+of+extracellular+vesicles+isolated+using+size-exclusion+chromatography+compared+to+ultracentrifugation.">Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).</li><li>Campos-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+detection+of+extracellular+vesicles+immune-captured+from+urine+by+conventional+flow+cytometry.">High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2042 (2019).</li><li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1CAM+is+not+associated+with+extracellular+vesicles+in+human+cerebrospinal+fluid+or+plasma.">L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma.</a> Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Mathieu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+exosome+versus+small+ectosome+secretion+revealed+by+live+intracellular+tracking+of+CD63+and+CD9.">Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+simplified+dichotomic+size-exclusion+chromatography+for+isolating+extracellular+vesicles+toward+clinical+applications.">Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145 (2021).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies.">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).</li><li>Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+macromolecular+complexes+for+cryo-electron+microscopy.">Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3239 (2007).</li><li>Williams, R. L., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+shape+of+the+ESCRT+machinery.">The emerging shape of the ESCRT machinery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).</li><li>Willms, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+release+subpopulations+of+exosomes+with+distinct+molecular+and+biological+properties.">Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).</li><li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses.">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).</li><li>B&#246;ing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography.">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li><li>Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three+step+protocol+to+isolate+extracellular+vesicles+from+plasma+or+cell+culture+medium+with+both+high+yield+and+purity.">A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450 (2020).</li><li>Guerreiro, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+extracellular+vesicle+isolation+by+combining+cell+media+modifications,+ultrafiltration,+and+size-exclusion+chromatography.">Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography.</a> PLoS ONE. 13 (9), 02024276 (2018).</li><li>On&#243;di, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-purity+extracellular+vesicles+by+the+combination+of+iodixanol+density+gradient+ultracentrifugation+and+bind-elute+chromatography+from+blood+plasma.">Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1479 (2018).</li><li>Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-isolation+of+extracellular+vesicles+and+high-density+lipoproteins+using+density+gradient+ultracentrifugation.">Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li></ol>

SEC è un metodo intuitivo per separare adeguatamente i veicoli elettrici dal CCM condizionato. Al fine di isolare specificamente le EV derivate da cellule, deve essere presa in considerazione un'attenta considerazione del tipo di CCM e dei suoi integratori. Molti terreni di coltura cellulare devono essere integrati con FBS, che contiene EV derivate dall'animale in cui è stato raccolto il siero. Queste EV sieriche possono saturare e mascherare qualsiasi segnale prodotto da EV derivate da cellule in coltura<sup class="xr...

L'esplosione di interesse nello studio delle vescicole extracellulari (EV) è stata accompagnata da importanti progressi nelle tecnologie e nelle tecniche utilizzate per separare e studiare queste particelle eterogenee di dimensioni nanometriche. Nel tempo trascorso dalla loro scoperta quasi quattro decenni fa1,2, queste piccole strutture membranose sono state trovate per contenere lipidi bioattivi, acidi nucleici e proteine, e svolgono un ruolo importante nella comunicazione intercellulare 3,4. Le EV vengono rilasciate da tutti i tipi di cellule e sono quindi presenti in tutti i fluidi biologici, compresi plasma sanguigno e siero, saliva e urina. Le EV all'interno di questi fluidi sono molto promettenti per servire come biomarcatori non invasivi per varie malattie, tra cui malattie neuroinfiammatorie e neurodegenerative, tumori e disturbi autoimmuni 5,6,7. Inoltre, gli studi meccanicistici in vitro possono essere eseguiti attraverso tecniche di coltura cellulare separando le EV rilasciate nel terreno di coltura 3,8,9.
Per comprendere il ruolo delle EV nella fisiopatologia della malattia, un'adeguata separazione dal fluido in cui si trovano è fondamentale. Il gold standard per la separazione delle EV è stato a lungo l'ultracentrifugazione differenziale (dUC)10, tuttavia sono emerse tecniche più sofisticate per ottenere una migliore separazione delle EV da altri componenti extracellulari. Alcune di queste tecniche includono gradienti di densità, frazione di flusso asimmetrico (A4F), citometria a flusso, immunocattura, precipitazione di polietilenglicole e cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) 11,12,13. Ogni tecnica ha il suo insieme di vantaggi e svantaggi; tuttavia, la SEC in particolare ha dimostrato di separare gli EV sia dai fluidi biologici che dai supernatanti di coltura cellulare in modo abbastanza efficace 8,14,15. SEC ha anche il vantaggio di essere relativamente semplice e facile da usare.
SEC è un metodo che separa i componenti di un fluido in base alle dimensioni. Con questa tecnica, una colonna di resina (prodotta internamente o acquistata commercialmente) viene utilizzata per frazionare un campione. Le particelle piccole nel campione rimangono intrappolate tra le perle all'interno della resina, mentre le particelle più grandi sono in grado di passare attraverso la resina più liberamente, e quindi eluire all'inizio del processo. Poiché le EV sono di dimensioni maggiori rispetto a molte proteine extracellulari e aggregati proteici, le EV passano attraverso la colonna più velocemente e si eluiscono nelle frazioni precedenti rispetto alle proteine extracellulari14.
In questo documento sui metodi, viene delineato l'uso di SEC per la separazione di EV da terreni di coltura cellulare (CCM) da oligodendrociti umani in condizioni di stress sia di controllo che del reticolo endoplasmatico (ER). Utilizzando questo protocollo, è dimostrato che le EV separate con questa tecnica si trovano all'interno di frazioni specifiche che possono essere raggruppate insieme e concentrate per la caratterizzazione a valle, e che le EV separate derivano da cellule e non da una fonte esogena come il siero bovino fetale (FBS) utilizzato per integrare il CCM. La presenza dei marcatori EV canonici, CD63, CD81 e CD916,17,18,19 nelle frazioni EV e la loro assenza nelle frazioni proteiche è dimostrata con western blotting. Utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), le EV vengono visualizzate e visualizzano la morfologia attesa e vengono osservate solo nella frazione EV. Le particelle vengono anche contate nelle frazioni EV e proteiche di entrambe le condizioni di stress di controllo e ER, e un gran numero di particelle all'interno dell'intervallo di dimensioni previsto di 50-200 nm di diametro sono osservati nei campioni EV. Insieme, questi dati supportano l'idea che SEC sia un metodo efficiente ed efficace per separare le EV dai terreni di coltura cellulare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>3 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC200324</td>
			<td>3 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074V</td>
			<td>1:1000 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calnexin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>&#160;ab22595</td>
			<td>1:500 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>312102</td>
			<td>1:500 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GM130 antibody [EP892Y] - cis-Golgi Marker</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52649</td>
			<td>1:500 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076V</td>
			<td>1:1000 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Fraction Collector</td>
			<td>Izon Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Gatan Orius SC200</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cd63 Mouse anti Human</td>
			<td>BD</td>
			<td>556019</td>
			<td>1:1000 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-23962</td>
			<td>1:1000 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imager</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1705061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3483-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH300022.FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Premium grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, exosome-depleted</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Great Value Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B076NRD2TZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOG Human Oligodendroglioma Cell Line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCC163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk</td>
			<td>Izon Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol &#62;99.8% ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Glass plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653310</td>
			<td>with 0.75mm spacers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Short plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin,Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP66150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce PVDF Transfer Membranes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Western Blotting Filter Paper</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>84783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>TB0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5872S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab125011</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SX0603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate,&#8805;99.0% (GC), dust-free pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75746-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>FEI Tecnai 12 Biotwin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeta View software</td>
			<td>Analytik</td>
			<td></td>
			<td>NTA software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

size exclusion chromatography for separating extracellular vesicles from conditioned cell culture media

Le vescicole extracellulari (EV) sono strutture legate alla membrana lipidica di dimensioni nanometriche che vengono rilasciate da tutte le cellule, sono presenti in tutti i biofluidi e contengono proteine, acidi nucleici e lipidi che riflettono la cellula madre da cui derivano. La corretta separazione degli EV dagli altri componenti in un campione consente la caratterizzazione del loro carico associato e fornisce informazioni sul loro potenziale come comunicatori intercellulari e biomarcatori non invasivi per numerose malattie. Nel presente studio, le EV derivate dagli oligodendrociti sono state isolate dai terreni di coltura cellulare utilizzando una combinazione di tecniche all'avanguardia, tra cui l'ultrafiltrazione e la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) per separare le EV da altre proteine extracellulari e complessi proteici. Utilizzando colonne SEC disponibili in commercio, le EV sono state separate dalle proteine extracellulari rilasciate dalle cellule di oligodendroglioma umano sia in condizioni di controllo che di stress del reticolo endoplasmatico (ER). I marcatori EV canonici CD9, CD63 e CD81 sono stati osservati nelle frazioni 1-4, ma non nelle frazioni 5-8. GM130, una proteina dell'apparato di Golgi, e calnexina, una proteina integrale dell'ER, sono stati usati come marcatori EV negativi e non sono stati osservati in nessuna frazione. Inoltre, quando si raggruppano e si concentrano le frazioni 1-4 come frazione EV e le frazioni 5-8 come frazione proteica, è stata osservata l'espressione di CD63, CD81 e CD9 nella frazione EV. L'espressione di GM130 o calnexina non è stata osservata in nessuno dei tipi di frazione. Le frazioni aggregate da entrambe le condizioni di stress di controllo e ER sono state visualizzate con microscopia elettronica a trasmissione e le vescicole sono state osservate nelle frazioni EV, ma non nelle frazioni proteiche. Anche le particelle nell'EV e le frazioni proteiche di entrambe le condizioni sono state quantificate con l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle. Insieme, questi dati dimostrano che SEC è un metodo efficace per separare le EV dai terreni di coltura cellulare condizionati.

Il Western blotting rivela un'adeguata separazione dei veicoli elettrici dal CCM Per valutare l'efficacia del SEC per separare le EV dai terreni di coltura cellulare, è stata eseguita una macchia occidentale utilizzando ogni singola frazione dai campioni di controllo per sondare l'espressione dei tre marcatori EV canonici, CD9, CD63 e CD81, nonché GM130 e calnexin18, che sono stati utilizzati come controlli negativi (Figura 3). L'espressione dell...

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Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media

Il protocollo qui dimostra che le vescicole extracellulari possono essere adeguatamente separate dai terreni di coltura cellulare condizionati utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale.

Cromatografia ad esclusione dimensionale per separare le vescicole extracellulari dai terreni di coltura cellulare condizionati

Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized lipid-membrane bound structures that are released from all cells, are present in all biofluids, and contain ...

La separazione delle vescicole extracellulari da fluidi come i terreni di coltura cellulare può consentire ai ricercatori di caratterizzare il carico vesticolare ed esplorare i loro meccanismi di comunicazione intracellulare. Questa tecnica consente una separazione sufficiente di EV e proteine extracellulari da terreni di coltura cellulare condizionati che è semplice e facile da usare. Per iniziare posizionare PBS in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius.Osservare il controllo e i flaconi di coltura cellulare trattati con tunicamicina al microscopio composto con una lente obiettivo 10 x e 100 x. Prendi nota di eventuali differenze tra i palloni. Rimuovere il mezzo dal pallone e metterlo in un tubo da 50 millilitri.Quindi centrifugare il tubo a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e trasferire il super natante in un nuovo tubo. Centrifugare il tubo a 2000 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il super natante in un nuovo tubo e posizionare il tubo sul ghiaccio.Prendi quattro unità di ultrafiltrazione da 15 millilitri e tre kilodalton e aggiungi cinque millilitri di PBS a ciascun tubo. Innescare i filtri centrifugando le unità a 4.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il PBS dalle unità, dividere il surnatante dalle condizioni di controllo e trattate in due unità di ultrafiltrazione ciascuna con circa 12,5 millilitri di fluido ciascuna.Centrifugare i tubi a 4.000 G per un'ora e 45 minuti a quattro gradi Celsius o fino a quando il mezzo concentrato o il retentato in ciascuna unità è concentrato a 250 microlitri o meno. Trasferire il retentato da entrambe le unità di controllo in un micro tubo da centrifuga da 1,5 millilitri etichettato e dalle unità trattate in un altro tubo. Misurare il volume totale del retentato in ogni micro tubo di centrifuga.Se il volume è inferiore a 500 microlitri, aggiungere PBS filtrato da 0,22 micron fino a quando il volume finale è di 500 microlitri. Mettere i tubi in un congelatore a meno 80 gradi Celsius. Accendere il raccoglitore automatico di frazioni o AFC.Rimuovere la colonna da quattro gradi Celsius e lasciare che la colonna si riscaldi a temperatura ambiente. Rimuovere i campioni retentati dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e metterli sul ghiaccio per scongelare, durante l'attesa, impostare otto tubi etichettati da 1,5 millilitri nel carosello AFC con coperchi rivolti verso l'interno. Inserire la colonna nell'AFC con il codice a barre rivolto verso il lettore e regolare le impostazioni per raccogliere otto frazioni di 500 microlitri ciascuna e buffer volume di default.Quindi verificare le istruzioni visualizzate per avviare la raccolta. Dopo che il buffer di archiviazione è stato completamente assorbito nella parte superiore della matrice di colonne. Iniziare a lavare la colonna aggiungendo 15 millilitri di PBS alla colonna.Non aggiungere PBS troppo presto in quanto diluirebbe il buffer di archiviazione e impedirebbe un adeguato svuotamento. Poco prima che tutti i 15 millilitri di PBS vengano assorbiti dalla matrice, fare clic su OK per interrompere il lavaggio e rimuovere qualsiasi PBS residuo dalla parte superiore della matrice della colonna con una micro pipetta. Non toccare la matrice.Aggiungere 500 microlitri di campione al centro della colonna e fare clic su OK per iniziare l'esecuzione. Dopo che il campione è stato completamente assorbito nella matrice, aggiungere immediatamente otto millilitri di PBS alla colonna. AFC dissipa automaticamente il volume di vuoto al centro della giostra prima di raccogliere tutte le otto frazioni di 500 microlitri ciascuna.Dopo la corsa, rimuovere le frazioni dalla giostra e posizionarle sul ghiaccio. Quindi rimuovere il volume vuoto dal centro della giostra. Quindi, aggiungere 10 millilitri di PBS alla colonna per lavare qualsiasi campione residuo dalla colonna.E una volta che il campione pentito è stato completamente lavato aggiungere 15 millilitri di PBS alla colonna. Mentre il PBS finale viene assorbito dalla matrice, aggiungere 500 microlitri di idrossido di sodio 0,5 molare al centro della matrice della colonna. Quindi, quando l'idrossido di sodio viene assorbito, aggiungere 30 millilitri di PBS alla colonna e lasciarlo sciacquare.Una volta fatto con tutti i campioni, conservare la colonna per un uso successivo aggiungendo 15 millilitri di azoturo di sodio allo 0,05% alla colonna. Lasciare circa cinque millilitri di azoturo di sodio sulla parte superiore della matrice della colonna. Rimuovere la colonna dall'AFC e fissare i cappucci superiore e inferiore prima di posizionare la colonna a quattro gradi Celsius per la conservazione.Costruire l'unità di ultra filtrazione. Ottenere due millilitri, tre unità di ultrafiltrazione kilodalton cutoff per campione. Ogni unità è composta da tre parti, cono, filtro e flusso attraverso il cilindro.Etichettare correttamente ogni parte. Aggiungere un millilitro di PBS alla porzione filtrante e tappare con il pezzo di cono. Centrifugare il cono dell'unità di ultrafiltrazione rivolto verso l'alto a 3.500 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il PBS filtrato dal flusso attraverso il cilindro.Capovolgere l'unità di ultrafiltrazione e centrifugare per due minuti a 1000 G a quattro gradi Celsius per rimuovere eventuali PBS rimanenti. Combinare quattro 500 microlitri di ogni frazione e aggiungerli all'unità di ultrafiltrazione. Quindi le colonne di centrifuga coincidono per un'ora, 45 minuti a 3.500 G a quattro gradi Celsius o fino a quando il livello di retentato è a 100 microlitri.Rimuovere il flusso attraverso il cilindro ed eliminare il flusso attraverso. Capovolgere l'unità di ultrafiltrazione e centrifugare per due minuti a 1000 XG a quattro gradi Celsius. Trasferire il retentato nel cono in un tubo da 1,5 millilitri e rendere il volume del campione a 150 microlitri con PBS filtrato da 0,22 micron prima di posizionare i tubi in meno 80 gradi Celsius congelatore.Un blocco occidentale rappresentativo di singole frazioni ha mostrato una forte espressione di CD9, CD63 e CD81. Infrazioni da uno a quattro con poca o nessuna espressione infrazioni da cinque a otto. Nessuna espressione di GM130 o calnexina è stata osservata in nessuna frazione.L'albumina era presente solo nelle frazioni da sei a otto. È stata inoltre valutata l'efficacia della concentrazione delle frazioni EV e proteiche. L'espressione di CD9 e CD63 è stata osservata nei lisati cellulari.Tutte e tre le proteine CD erano presenti nelle frazioni EV di controllo e nei campioni trattati con tunicamicina, ma non nelle frazioni proteiche. Il gene di suscettibilità tumorale 101 era presente nei lisati cellulari, ma non nelle frazioni EV o proteiche. Il GM130 e la calnexina sono stati osservati solo nei lisati cellulari.Nella macchia occidentale dei terreni di coltura cellulare impoveriti degli esosomi, i marcatori EV erano presenti nei lisati cellulari ma non nei campioni di media. L'espressione di albumina è stata osservata nelle frazioni proteiche e l'espressione minima nei lisati cellulari. Le osservazioni TEM hanno dimostrato strutture sferiche nelle frazioni EV di controllo e campioni trattati con tunicamicina.Queste strutture non sono state osservate in nessuna delle frazioni proteiche del tipo campione. L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle rivela differenze nelle concentrazioni di particelle di controllo e nelle frazioni trattate nelle frazioni EV rispetto al controllo, leggermente più particelle erano presenti nel trattamento con tunicamicina. Tuttavia, nelle frazioni proteiche, sono state rilevate meno particelle rispetto alle EV.È importante avere lo stesso volume di campione per le condizioni di controllo e trattate, consentendo un facile confronto delle EV dei diversi trattamenti. Dopo aver separato le EV dai terreni di coltura cellulare della condizione, possiamo caratterizzare il contenuto di proteine, RNA e lipidi delle vescicole con il sequenziamento dell'RNA proteomico e la lipidomica.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Ricerca

Neuroscienze

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