Name: size exclusion chromatography for separating extracellular vesicles from conditioned cell culture media
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media at JoVE.com

Yazarlar, Penn State Behrend ve Hamot Sağlık Vakfı'na finansman için ve ayrıca University Park, PA'daki Penn State Mikroskopi Tesisi'ne teşekkür etmek istiyor.

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması
NOT: Steriliteyi korumak için hücre kültürü reaktiflerini hücre kültürü davlumbazında yapın.
<ol><li>Hücre kültürü reaktiflerinin hazırlanması<ol><li>500 mL yüksek glikoz DMEM'ine 50 mL FBS ve 5 mL penisilin-streptokok (Pen-Strep) ekleyerek normal yüksek glikoz DMEM'i hazırlayın ve 4 ° C'de saklayın. Hücreleri kültürlemek ve genişletmek için bu ortamı kullanın.</li>
		<li>500 mL yüksek glikoz DMEM...

<ol>
	<li>Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+evidence+for+externalization+of+the+transferrin+receptor+in+vesicular+form+in+sheep+reticulocytes.">Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).</li><li>Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+endocytosis+of+transferrin+and+recycling+of+the+transferrin+receptor+in+rat+reticulocytes.">Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).</li><li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Rontogianni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+extracellular+vesicles+allows+for+human+breast+cancer+subtyping.">Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping.</a> Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).</li><li>Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+circulating+cancer+biomarkers:+opportunities+and+challenges.">Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges.</a> Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14 (2018).</li><li>Thompson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+neurodegenerative+disease-pathogenesis+to+biomarkers.">Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).</li><li>O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake,+functionality,+and+re-release+of+extracellular+vesicle-encapsulated+cargo.">Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo.</a> Cell Reports. 39 (2), 110651 (2022).</li><li>Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+extracellular+vesicles+and+release+of+their+cargo+from+endosomes.">Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes.</a> ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).</li><li>Th&#233;ry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).</li><li>Willms, E., Caba&#241;as, C., M&#228;ger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+heterogeneity:+Subpopulations,+isolation+techniques,+and+diverse+functions+in+cancer+progression.">Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).</li><li>Tzaridis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+separation+techniques+impact+results+from+human+blood+samples:+Considerations+for+diagnostic+applications.">Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211 (2021).</li><li>Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+isolation+and+separation+techniques+for+extracellular+vesicles.">Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles.</a> Journal of Chromatography A. 1636, 461773 (2021).</li><li>G&#225;mez-Valero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography-based+isolation+minimally+alters+extracellular+vesicles'+characteristics+compared+to+precipitating+agents.">Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li><li>Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+functionality+of+extracellular+vesicles+isolated+using+size-exclusion+chromatography+compared+to+ultracentrifugation.">Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).</li><li>Campos-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+detection+of+extracellular+vesicles+immune-captured+from+urine+by+conventional+flow+cytometry.">High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2042 (2019).</li><li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L1CAM+is+not+associated+with+extracellular+vesicles+in+human+cerebrospinal+fluid+or+plasma.">L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma.</a> Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).</li><li>Th&#233;ry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Mathieu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+exosome+versus+small+ectosome+secretion+revealed+by+live+intracellular+tracking+of+CD63+and+CD9.">Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).</li><li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+simplified+dichotomic+size-exclusion+chromatography+for+isolating+extracellular+vesicles+toward+clinical+applications.">Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145 (2021).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies.">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).</li><li>Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+macromolecular+complexes+for+cryo-electron+microscopy.">Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3239 (2007).</li><li>Williams, R. L., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+shape+of+the+ESCRT+machinery.">The emerging shape of the ESCRT machinery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).</li><li>Willms, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+release+subpopulations+of+exosomes+with+distinct+molecular+and+biological+properties.">Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).</li><li>Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foetal+bovine+serum+influence+on+in+vitro+extracellular+vesicle+analyses.">Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).</li><li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).</li><li>B&#246;ing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography.">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li><li>Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three+step+protocol+to+isolate+extracellular+vesicles+from+plasma+or+cell+culture+medium+with+both+high+yield+and+purity.">A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450 (2020).</li><li>Guerreiro, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+extracellular+vesicle+isolation+by+combining+cell+media+modifications,+ultrafiltration,+and+size-exclusion+chromatography.">Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography.</a> PLoS ONE. 13 (9), 02024276 (2018).</li><li>On&#243;di, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-purity+extracellular+vesicles+by+the+combination+of+iodixanol+density+gradient+ultracentrifugation+and+bind-elute+chromatography+from+blood+plasma.">Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1479 (2018).</li><li>Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-isolation+of+extracellular+vesicles+and+high-density+lipoproteins+using+density+gradient+ultracentrifugation.">Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li></ol>

SEC, EV'leri şartlandırılmış CCM'den yeterince ayırmak için kullanıcı dostu bir yöntemdir. Hücre kaynaklı EV'leri spesifik olarak izole etmek için, CCM tipinin ve takviyelerinin dikkatli bir şekilde dikkate alınması gerekir. Birçok hücre kültürü ortamının, serumun toplandığı hayvandan türetilen EV'leri içeren FBS ile desteklenmesi gerekir. Bu serum EV'leri, kültür26'daki hücrelerden türetilen EV'ler tarafından üretilen herhangi bir sinyali doyurabilir ve maskeleye...

Hücre dışı vezikülleri (EV'ler) incelemeye olan ilginin patlamasına, bu nano boyutlu, heterojen parçacıkları ayırmak ve incelemek için kullanılan teknoloji ve tekniklerdeki büyük gelişmeler eşlik etmiştir. Yaklaşık kırk yıl önce 1,2 keşfedilmelerinden bu yana geçen sürede, bu küçük membranöz yapıların biyoaktif lipitler, nükleik asitler ve proteinler içerdiği ve hücreler arası iletişimde önemli roller oynadığı bulunmuştur 3,4. EV'ler tüm hücre tiplerinden salınır ve bu nedenle kan plazması ve serum, tükürük ve idrar dahil olmak üzere tüm biyolojik sıvılarda bulunur. Bu sıvıların içindeki EV'ler, nöroinflamatuar ve nörodejeneratif hastalıklar, kanserler ve otoimmün bozukluklar dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için invaziv olmayan biyobelirteçler olarak hizmet etme konusunda büyük umut vaat etmektedir 5,6,7. Ayrıca, in vitro mekanik çalışmalar, kültür ortamı 3,8,9'a salınan EV'leri ayırarak hücre kültürü teknikleri aracılığıyla gerçekleştirilebilir.
EV'lerin hastalık patofizyolojisindeki rolünü anlamak için, bulundukları sıvıdan yeterli ayrılma çok önemlidir. EV ayırma için altın standart uzun zamandır diferansiyel ultrasantrifüjleme (dUC)10 olmuştur, ancak EV'lerin diğer hücre dışı bileşenlerden daha iyi ayrılmasını sağlamak için daha sofistike teknikler ortaya çıkmıştır. Bu tekniklerden bazıları yoğunluk gradyanları, asimetrik akış alanı-akış fraksiyonu (A4F), akış sitometrisi, immünocapture, polietilen glikol çökeltmesi ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) 11,12,13'tür. Her tekniğin kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır; Bununla birlikte, özellikle SEC'in EV'leri hem biyolojik sıvılardan hem de hücre kültürü süpernatantlarından oldukça etkili bir şekilde ayırdığı gösterilmiştir 8,14,15. SEC ayrıca nispeten basit ve kullanıcı dostu olma bonusuna sahiptir.
SEC, bir sıvının bileşenlerini boyuta göre ayıran bir yöntemdir. Bu teknikle, bir numuneyi fraksiyone etmek için bir reçine sütunu (şirket içinde yapılan veya ticari olarak satın alınan) kullanılır. Numunedeki küçük parçacıklar reçine içindeki boncuklar arasında sıkışıp kalırken, daha büyük parçacıklar reçineden daha serbest bir şekilde geçebilir ve böylece işlemin başlarında ortaya çıkabilir. EV'ler birçok hücre dışı proteinden ve protein agregalarından daha büyük boyuttadır, EV'ler kolondan daha hızlı geçer ve hücre dışı proteinlerden daha erken fraksiyonlarda süzülür14.
Bu yöntem makalesinde, EV'lerin hücre kültürü ortamından (CCM) hem kontrol hem de endoplazmik retikulum (ER) stres koşulları altında insan oligodendrositlerinden ayrılması için SEC'in kullanımı özetlenmiştir. Bu protokolü kullanarak, bu teknikle ayrılan EV'lerin, birlikte toplanabilen ve aşağı akış karakterizasyonu için konsantre edilebilen spesifik fraksiyonlar içinde bulunduğu ve ayrılan EV'lerin, CCM'yi desteklemek için kullanılan fetal sığır serumu (FBS) gibi eksojen bir kaynaktan değil, hücrelerden türetildiği gösterilmiştir. EV fraksiyonlarında kanonik EV belirteçleri, CD63, CD81 ve CD916,17,18,19'un varlığı ve protein fraksiyonlarında yokluğu batı lekelenmesi ile gösterilmiştir. İletim elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak, EV'ler görselleştirilir ve beklenen morfolojiyi gösterir ve sadece EV fraksiyonunda gözlenir. Parçacıklar ayrıca hem kontrol hem de ER stres koşullarının EV ve protein fraksiyonlarında sayılır ve EV numunelerinde 50-200 nm çapında beklenen boyut aralığında çok sayıda parçacık gözlenir. Birlikte, bu veriler SEC'in EV'leri hücre kültürü ortamından ayırmak için etkili ve etkili bir yöntem olduğu fikrini desteklemektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>3 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>UFC200324</td>
			<td>3 kDa cutoff</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074V</td>
			<td>1:1000 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calnexin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>&#160;ab22595</td>
			<td>1:500 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>312102</td>
			<td>1:500 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GM130 antibody [EP892Y] - cis-Golgi Marker</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52649</td>
			<td>1:500 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076V</td>
			<td>1:1000 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Fraction Collector</td>
			<td>Izon Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Gatan Orius SC200</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cd63 Mouse anti Human</td>
			<td>BD</td>
			<td>556019</td>
			<td>1:1000 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-23962</td>
			<td>1:1000 Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP Imager</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1705061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3483-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH300022.FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Premium grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, exosome-depleted</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A2720801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Great Value Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B076NRD2TZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOG Human Oligodendroglioma Cell Line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCC163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk</td>
			<td>Izon Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol &#62;99.8% ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Glass plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653310</td>
			<td>with 0.75mm spacers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Short plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>492016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin,Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP66150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce PVDF Transfer Membranes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Western Blotting Filter Paper</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>84783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>TB0560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5872S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]</td>
			<td>ABCam</td>
			<td>ab125011</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SX0603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate,&#8805;99.0% (GC), dust-free pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75746-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>FEI Tecnai 12 Biotwin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tunicamycin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeta View software</td>
			<td>Analytik</td>
			<td></td>
			<td>NTA software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

size exclusion chromatography for separating extracellular vesicles from conditioned cell culture media

Hücre dışı veziküller (EV'ler), tüm hücrelerden salınan, tüm biyoakışkanlarda bulunan ve türetildikleri ana hücreyi yansıtan proteinler, nükleik asitler ve lipitler içeren nano boyutlu lipit-membrana bağlı yapılardır. EV'lerin bir numunedeki diğer bileşenlerden uygun şekilde ayrılması, ilişkili kargolarının karakterizasyonuna izin verir ve sayısız hastalık için hücreler arası iletişimciler ve invaziv olmayan biyobelirteçler olarak potansiyelleri hakkında fikir verir. Bu çalışmada, oligodendrosit türevi EV'ler, EV'leri diğer hücre dışı proteinlerden ve protein komplekslerinden ayırmak için ultrafiltrasyon ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) dahil olmak üzere en son tekniklerin bir kombinasyonu kullanılarak hücre kültürü ortamından izole edildi. Ticari olarak temin edilebilen SEC kolonları kullanılarak, EV'ler hem kontrol hem de endoplazmik retikulum (ER) stres koşulları altında insan oligodendroglioma hücrelerinden salınan hücre dışı proteinlerden ayrıldı. Kanonik EV belirteçleri CD9, CD63 ve CD81, 1-4 fraksiyonlarında gözlendi, ancak 5-8 fraksiyonlarında gözlenmedi. Golgi aparatının bir proteini olan GM130 ve ER'nin ayrılmaz bir proteini olan kalneksin, negatif EV belirteçleri olarak kullanıldı ve herhangi bir fraksiyonda gözlenmedi. Ayrıca, EV fraksiyonu olarak 1-4 fraksiyonlarını ve protein fraksiyonu olarak 5-8 fraksiyonlarını bir araya getirip yoğunlaştırırken, EV fraksiyonunda CD63, CD81 ve CD9 ekspresyonu gözlenmiştir. GM130 veya kalneksin ekspresyonu, fraksiyon tiplerinin hiçbirinde gözlenmedi. Hem kontrol hem de ER stres koşullarından toplanan fraksiyonlar transmisyon elektron mikroskobu ile görselleştirildi ve veziküller EV fraksiyonlarında gözlendi, ancak protein fraksiyonlarında gözlenmedi. EV'deki parçacıklar ve her iki koşuldan protein fraksiyonları da nanopartikül izleme analizi ile ölçüldü. Birlikte, bu veriler SEC'in EV'leri şartlandırılmış hücre kültürü ortamından ayırmak için etkili bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Batı lekelenmesi, EV'lerin CCM'den yeterli şekilde ayrıldığını ortaya koymaktadır EV'leri hücre kültürü ortamından ayırmak için SEC'in etkinliğini değerlendirmek için, kontrol örneklerinden her bir fraksiyon kullanılarak, üç kanonik EV belirtecinin, CD9, CD63 ve CD81'in yanı sıra negatif kontroller olarak kullanılan GM130 ve calnexin18'in ekspresyonunu araştırmak için bir batı lekesi çalıştırıldı (Şekil 3). Albü...

Watch this Scientific Journal Video about Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media at JoVE.com

Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media

Buradaki protokol, hücre dışı veziküllerin, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak şartlandırılmış hücre kültürü ortamından yeterince ayrılabileceğini göstermektedir.

Hücre Dışı Vezikülleri Şartlandırılmış Hücre Kültürü Ortamından Ayırmak için Boyut Dışlama Kromatografisi

Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized lipid-membrane bound structures that are released from all cells, are present in all biofluids, and contain ...

Hücre dışı veziküllerin durum hücresi kültürü ortamı gibi sıvılardan ayrılması, araştırmacıların vestiküler kargoyu karakterize etmelerine ve hücre içi iletişim mekanizmalarını keşfetmelerine izin verebilir. Bu teknik, EV'lerin ve hücre dışı proteinlerin, basit ve kullanıcı dostu olan şartlandırılmış hücre kültürü ortamından yeterli şekilde ayrılmasını sağlar. PBS'yi 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirmeye başlamak için.Kontrol ve tunikasin ile muamele edilmiş hücre kültürü şişelerini 10 x ve 100 x objektif lensle bileşik bir mikroskop altında gözlemleyin. Şişeler arasındaki farkları not alın. Ortamı şişeden çıkarın ve 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.Daha sonra tüpü dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 G'de santrifüj edin ve süper natantı yeni bir tüpe aktarın. Tüpü dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 2000 G'de santrifüj yapın. Süper natantı yeni bir tüpe aktarın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.Dört adet 15 mililitre üç kilodalton kesme ultra filtrasyon ünitesi alın ve her tüpe beş mililitre PBS ekleyin. Üniteleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 4.000 G'de santrifüj ederek filtreleri astarlayın. PBS'yi ünitelerden çıkardıktan sonra, süpernatantı kontrol ve işlem görmüş koşullardan, her birinde yaklaşık 12,5 mililitre ortam bulunan iki ultra filtreleme ünitesine bölün.Tüpleri 4.000 G'de bir saat 45 dakika boyunca dört santigrat derecede veya her birimdeki konsantre ortam veya retentat 250 mikrolitre veya daha azına konsantre olana kadar santrifüj yapın. Retentatı her iki kontrol ünitesinden etiketli 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne ve işlenmiş ünitelerden başka bir tüpe aktarın. Her mikro santrifüj tüpündeki retentatın toplam hacmini ölçün.Hacim 500 mikrolitreden azsa, son hacim 500 mikrolitre olana kadar 0.22 mikron filtrelenmiş PBS ekleyin. Tüpleri eksi 80 santigrat derece dondurucuya yerleştirin. Otomatik kesir toplayıcıyı veya AFC'yi açın.Kolonu dört santigrat dereceden çıkarın ve sütunun oda sıcaklığına ısınmasına izin verin. Retentat numunelerini eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve çözülmesi için buzun üzerine yerleştirin, beklerken, AFC atlıkarınca içinde kapakları içe dönük sekiz adet etiketli 1,5 mililitrelik tüp yerleştirin. Barkodu okuyucuya bakacak şekilde sütunu AFC'ye yerleştirin ve ayarları her biri 500 mikrolitrelik sekiz fraksiyon toplayacak ve arabellek hacmini varsayılan olarak ayarlayın.Ardından, koleksiyonu başlatmak için ekrandaki talimatları doğrulayın. Depolama tamponu sütun matrisinin üst kısmına tamamen emildikten sonra. Kolona 15 mililitre PBS ekleyerek sütunu yıkamaya başlayın.PBS'yi çok erken eklemeyin, çünkü depolama arabelleğini seyreltir ve yeterli yıkamayı önler. 15 mililitre PBS'nin tamamı matris tarafından emilmeden hemen önce, yıkamayı durdurmak ve sütun matrisinin üstünden kalan PBS'yi mikro pipetle çıkarmak için Tamam'ı tıklayın. Matrise dokunmayın.Kolonun ortasına 500 mikrolitre numune ekleyin ve çalıştırmaya başlamak için Tamam'ı tıklayın. Numune matrise tamamen emildikten sonra derhal kolona sekiz mililitre PBS ekleyin. AFC, her biri 500 mikrolitrelik sekiz fraksiyonun tümünü toplamadan önce boşluk hacmini otomatik olarak atlıkarınca merkezine atar.Koşudan sonra, atlıkarınca kesirlerini çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Ardından boş hacmi döngünün ortasından çıkarın. Ardından, kolondan kalan herhangi bir numuneyi yıkamak için kolona 10 mililitre PBS ekleyin.Ve tövbe edilen numune tamamen yıkandıktan sonra, sütuna 15 mililitre PBS ekleyin. Son PBS matris tarafından emilirken, kolonun matrisinin merkezine 500 mikrolitre 0.5 molar sodyum hidroksit ekleyin. Daha sonra sodyum hidroksit emildiğinde, kolona 30 mililitre PBS ekleyin ve akmasına izin verin.Tüm numunelerle yapıldıktan sonra, kolona 15 mililitre% 0.05 sodyum azid ekleyerek daha sonra kullanmak üzere sütunu koruyun. Kolon matrisinin üstüne yaklaşık beş mililitre sodyum azid bırakın. Sütunu AFC'den çıkarın ve saklamak üzere sütunu dört santigrat dereceye yerleştirmeden önce üst ve alt kapakları takın.Ultra filtrasyon ünitesini oluşturun. Numune başına iki mililitre, üç kilodalton kesme ultra filtrasyon ünitesi elde edin. Her ünite üç parçadan oluşur, koni, filtre ve silindirden akış.Her parçayı doğru şekilde etiketleyin. Filtre kısmına bir mililitre PBS ekleyin ve koni parçasıyla kapatın. Ultrafiltrasyon ünitesi koni tarafını dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 3.500 G'de santrifüj edin ve filtrelenmiş PBS'yi silindir içinden akıştan çıkarın.Ultrafiltrasyon ünitesini baş aşağı çevirin ve kalan PBS'yi çıkarmak için dört santigrat derecede 1000 G'de iki dakika boyunca santrifüj yapın. Her fraksiyonun dört 500 mikrolitresini birleştirin ve bunları ultrafiltrasyon ünitesine ekleyin. Daha sonra santrifüj sütunları bir saat, 45 dakika boyunca 3, 500 G'de dört santigrat derecede veya retentat seviyesi 100 mikrolitrede olana kadar çakışıyor.Akış silindirini çıkarın ve içinden akışı atın. Ultra filtreleme ünitesini baş aşağı çevirin ve dört santigrat derecede 1000 XG'de iki dakika boyunca santrifüj yapın. Konideki retentatı 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpleri eksi 80 santigrat derece dondurucuya yerleştirmeden önce numune hacmini 0.22 mikron filtrelenmiş PBS ile 150 mikrolitreye yapın.Bireysel fraksiyonların temsili bir batı bloğu CD9, CD63 ve CD81'in güçlü ekspresyonunu gösterdi. Çok az veya hiç ifade içermeyen bir ila dört ihlal beş ila sekiz arasında ihlal eder. Herhangi bir fraksiyonda GM130 veya kalneksin ekspresyonu gözlenmedi.Albümin sadece altı ila sekiz fraksiyonda mevcuttu. EV ve protein fraksiyonlarının konsantre edilmesinin etkinliği de değerlendirildi. Hücre lizatlarında CD9 ve CD63 ekspresyonu gözlendi.Her üç CD proteini de kontrol ve tunikamisin ile muamele edilmiş örneklerin EV fraksiyonlarında mevcuttu, ancak protein fraksiyonlarında mevcut değildi. Tümör duyarlılık geni 101, hücre lizatlarında mevcuttu, ancak EV veya protein fraksiyonlarında mevcut değildi. GM130 ve kalneksin sadece hücre lizatlarında gözlendi.Eksozom tükenmiş hücre kültürü ortamının batı lekesinde, EV belirteçleri hücre lizatlarında mevcuttu, ancak medya örneklerinde mevcut değildi. Albümin ekspresyonu protein fraksiyonlarında ve minimal ekspresyon hücre lizatlarında gözlendi. TEM gözlemleri, kontrol ve tunikamisin ile muamele edilmiş numunelerin EV fraksiyonlarında küresel yapılar göstermiştir.Bu yapılar her iki örnek tipi protein fraksiyonunda da gözlenmedi. Nanopartikül izleme analizi, kontrol partikül konsantrasyonlarındaki farklılıkları ortaya koymaktadır ve EV fraksiyonlarında işlem görmüş fraksiyonlar, kontrole kıyasla, tunikamisin tedavisinde biraz daha fazla parçacık mevcuttu. Bununla birlikte, protein fraksiyonlarında, EV'lere göre daha az parçacık tespit edildi.Kontrol ve tedavi koşulları için aynı numune hacmine sahip olmak önemlidir, bu da EV'lerin farklı tedavilerden kolayca karşılaştırılmasını sağlar. EV'leri durum hücresi kültürü ortamından ayırdıktan sonra, veziküllerin protein, RNA ve lipit içeriğini proteomik RNA dizilimi ve lipidomik ile karakterize edebiliriz.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nörobilim

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Organotipik Dilim Kültür GFP-Periferik Sinir akıbet Gerçek zamanlı Görüntüleme Fare Embriyolar ifade

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

Kültür İlköğretim Motor ve Electrospun Poli-L-lactide Nanofiber Yapı iskeleleri Tanımlı Medya Duyu Nöronlar

Electrospinning is a technique for producing micro- to nano-scale fibers. Fibers can be electrospun with varying degrees of alignment, from highly aligned ...

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

3D Nöral Kök Hücre Kültürü yerelleştirme Protein: Hybrid Görselleştirme Metodolojisi

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

Oküler kinematik Vitro uyarılması kaplumbağa kranial sinirler tarafından ölçülen

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

İnsan yetişkin cilt fibroblastlar indüklenen Neurons yüksek verimli kültürünün basit üretimi

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Balık Pituitaries bir yüksek kaliteli birincil hücre kültürü hazırlanması

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment

İmmün Hücre Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu ve Hücre Çevresi Üzerindeki Fonksiyonel Etkisinin İncelenmesi

The neuroinflammatory state of the central nervous system (CNS) plays a key role in physiological and pathological conditions. Microglia, the resident ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Embriyonik Fare Beyincisinden İzole Edilen Nöronların Birincil Kültürü

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...