Name: digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma
Uploaded: 2022-09-13T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma at JoVE.com

Forfatterne anerkender støtten fra Laboratoriet for Klinisk Genomik og Avanceret Teknologi i Institut for Patologi og Laboratoriemedicin i Dartmouth Hitchcock Health System. Forfatterne anerkender også patologiens delte ressource på Dartmouth Cancer Center med NCI Cancer Center Support Grant 5P30 CA023108-37.

Protokollen skitseret nedenfor følger retningslinjerne fra Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Der blev indhentet informeret samtykke fra de patienter, hvis vævsprøver indgik i dette studie. Se afsnittet Materialetabel for at få flere oplysninger om alle materialer, reagenser, udstyr og software, der bruges i denne protokol.
1. Forberedelse af dias17
<ol><li>Hent eller tilbered formalinfikseret, paraffinindlejret ...

<ol>
	<li>Pedersen, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+patterns+of+lac-z+transfected+human+glioma+cells+in+the+rat+brain.">Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain.</a> International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).</li><li>Iwadate, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+in+glioblastoma+progression.">Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression.</a> Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).</li><li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+and+prognosis+analysis+of+epithelial-mesenchymal+transition+in+glioma.">Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Barthel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+molecular+signature+and+crossroads+with+tumor+microenvironment.">Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).</li><li>Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-apoptosis+mechanisms+in+malignant+gliomas.">Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).</li><li>Berghoff, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death+ligand+1+expression+and+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+glioblastoma.">Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).</li><li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue.">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li><li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling.">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li><li>Garcia-Pardo, M., Calles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-1+NSCLC+therapy+resistance+mechanism.">ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism.</a> Precision Cancer Medicine. , (2021).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+spatial+profiling+of+individual+glomeruli+from+patients+with+anti-neutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+glomerulonephritis.">Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).</li><li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+GeoMx+digital+spatial+profiler.">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456 (2021).</li><li>Brady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-+and+intra-tumor+heterogeneity+of+metastatic+prostate+cancer+determined+by+digital+spatial+gene+expression+profiling.">Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling.</a> Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).</li><li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+digital+spatial+profiling+of+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+patients.">Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients.</a> Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).</li><li>Wang, D. Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study:+Digital+spatial+profiling+of+metastatic+clear+cell+carcinoma+reveals+intra-tumor+heterogeneity+in+epithelial-mesenchymal+gradient.">Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>GeoMx DSP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+slide+preparation+user+manual.">Automated slide preparation user manual.</a> GeoMx DSP. , (2022).</li><li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).</li><li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoadjuvant+versus+adjuvant+ipilimumab+plus+nivolumab+in+macroscopic+stage+III+melanoma.">Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).</li><li>Matthews, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-enriched+hyaluronan+binding+(BEHAB)/brevican+cleavage+in+a+glioma+cell+line+is+mediated+by+a+disintegrin+and+metalloproteinase+with+thrombospondin+motifs+(ADAMTS)+family+member.">Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).</li><li>Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+infiltration+into+central+nervous+system+tissue+in+vitro:+involvement+of+a+metalloprotease.">Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease.</a> Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).</li><li>Beli&#235;n, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-type+1+matrix+metalloprotease+(MT1-MMP)+enables+invasive+migration+of+glioma+cells+in+central+nervous+system+white+matter.">Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter.</a> Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).</li><li>Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+antigens+recognized+by+T+lymphocytes:+At+the+core+of+cancer+immunotherapy.">Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).</li><li>Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+for+cancer+prevention:+a+practical+and+feasible+approach+to+the+cancer+epidemic.">Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Chen, L., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-PD-1/PD-L1+therapy+of+human+cancer:+past,+present,+and+future.">Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-Associated+stromal+cells+stimulate+glioma+malignancy+by+regulating+the+tumor+immune+microenvironment.">Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).</li><li>Ishii, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+characterization+of+the+tumorigenic+&amp;#34;peri-necrotic+niche&amp;#34;+harboring+quiescent+stem-like+tumor+cells+in+glioblastoma.">Histological characterization of the tumorigenic &amp;#34;peri-necrotic niche&amp;#34; harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma.</a> PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).</li><li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments.">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).</li><li>NanoString. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CosMx+Spatial+Molecular+Imager:+True+Single-Cell+In+Situ+Solution.">CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution.</a> NanoString. , (2022).</li></ol>

I betragtning af mangfoldigheden af proteiner, der potentielt kan påvirke aggressiviteten af gliomer og forestillingen om, at flere af disse proteiner forbliver uopdagede, er en proteinkvantificeringsmetode med høj kapacitet en ideel teknologisk tilgang. Da geodata i onkologiske prøver ofte korrelerer med differentialekspression18, giver inkorporering af rumlig profilering i proteinkvantificeringsmetoden mulighed for mere effektiv analyse.
DSP's high-throughput-tilga...

Diffust infiltrerende gliomer er den mest almindelige type ondartet hjernetumor hos voksne og er altid dødelige. Tilbøjeligheden til, at gliomceller migrerer meget i hjernen, er en stor terapeutisk udfordring. Den mekanisme, hvormed de spredes, involverer rettet migration og ukontrolleret invasion. Invasive gliomceller har vist sig at udvise tropisme og migration langs hvide stofkanaler1, med nyere forskning, der implicerer demyelinering af disse kanaler som en aktiv, protumorigen funktion2. Invasion medieres af en epitel-til-mesenkymal overgang, hvor gliomceller erhverver mesenkymale egenskaber ved at reducere ekspressionen af gener, der koder for ekstracellulære matrixproteiner og celleadhæsionsmolekyler, forstærker migration og letter formering gennem tumormikromiljøet 3,4,5.
På molekylært niveau er der påvist forstyrrelse af flere proteiner, der giver cellulær stabilitet og grænseflade med immunogene komponenter6. Infiltrative gliomer er kendt for at gennemgå undertrykkelse af proteiner med anti-apoptotiske (fx PTEN) egenskaber7. De overudtrykker også proteiner, der fremmer unddragelse af værtsimmunresponset (f.eks. PD1 / PDL1)8. Dysreguleringen af disse komplekse veje forbedrer tumorigeniciteten og øger malignt potentiale.
Inden for prøver af invasivt gliom var målet at evaluere den differentielle ekspression af proteiner, der er nøglen til cellevækst, overlevelse og spredning og til mikromiljøets strukturelle integritet mellem invasive og ikke-invasive komponenter. Derudover forsøgte vi at studere differentiel regulering af proteiner med en aktiv immunogen rolle, hvilket giver indsigt i den mekanisme, hvormed kompromitterede værtsimmunforsvar kan forbedre gliomernes proliferative og invasive potentiale. Dette er især relevant i betragtning af den nylige bredde af forskning, der viser, hvordan immunmarkører og drivkræfter for dysregulering i malignitet kan tjene som mål for immunterapi. At identificere levedygtige terapeutiske mål blandt de mange proteiner, der er involveret i immunovervågning og reaktivitet, kræver en meget følsom og omfattende tilgang.
I betragtning af den brede vifte af kandidatproteiner, der kan studeres, søgte vi en metode, der ligner immunhistokemi, men med forbedret databehandlingseffektivitet. Inden for kræftbiologi har DSP vist sig som en kraftfuld teknologi med vigtige fordele i forhold til alternative værktøjer til proteomisk analyse og kvantificering. Kendetegnende for DSP er dens multiplexingkapacitet med høj kapacitet, der giver mulighed for samtidig undersøgelse af flere forskellige proteiner i en prøve, hvilket markerer en vigtig sondring fra standard, men lavere plex-teknologier såsom immunohistokemi (IHC)9,10. Multiplexfunktionen i DSP kompromitterer ikke dens troskab som et kvantitativt og analytisk værktøj, som det fremgår af undersøgelser, der sammenligner DSP med IHC. Når det anvendes til proteomisk kvantificering af ikke-småcellede lungekræftprøver, har DSP for eksempel vist sig at have lignende resultater som IHC11. Derudover tilbyder DSP tilpassede regionale specifikationer, hvor brugerne manuelt kan definere regioner, inden for hvilke de skal udføre proteomisk analyse. Dette giver en fordel i forhold til multiplexmetoder for hele sektioner10,12. I en enkelt behandlingsrunde tilbyder DSP således flere lag af analyse ved at undersøge flere proteinmål på tværs af flere regioner af interesse.
DSP har applikationer i flere forskellige patologiske indstillinger. DSP er især fordelagtig i onkologisk analyse, da rumlig variation kan korrelere med cellulær transformation og differentiel proteinekspression. For eksempel er DSP blevet brugt til at sammenligne den proteomiske profil af brystkræft med det tilstødende tumormikromiljø. Dette har vigtige konsekvenser for forståelsen af denne tumor naturlige historie og dens progression samt potentiel respons på behandling13. Yderligere sammenhænge, der illustrerer alsidigheden af DSP, omfatter rumlig kvantificering af proteindiversitet i prostatacancer 14, association af immuncellemarkørekspression med sygdomsprogression i hoved- og halspladecellecarcinom15 og demonstration af en epitel-mesenkymal gradient af proteinekspression, der adskiller metastatisk fra primær klar cellekræft i æggestokkene16 . Ved at implementere DSP karakteriserer vi den rumlige topografi af proteiner, der kan påvirke tumorigenese og invasion af gliomer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BOND Research Detection System</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DS9455</td>
			<td>Open detection system containing open containers in a reagent tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Wash</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>AR950</td>
			<td>10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer W</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 conjugation kit</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>AB188287</td>
			<td>Cy3 fluorescent antibody conjugation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>System for imaging and characterizing protein and RNA targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx DSP Instrument BufferKit</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100471</td>
			<td>Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Hyb Code Pack_Protein</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300401</td>
			<td>Controls for running GeoMX DSP experiemtns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300101</td>
			<td>Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300105</td>
			<td>Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Protein Slide Prep FFPE</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300308</td>
			<td>Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDH1-R132H antibody</td>
			<td>Dianova, Hamburg, Germany</td>
			<td>DIA-H09</td>
			<td>Monoclonal antibody against human IDH1 R132H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Bond RX</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Fully automated IHC stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Kit--12 reactions</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100052</td>
			<td>Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCounter Analysis System</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Master II</td>
			<td>3DHistech Ltd., Budapest, Hungary</td>
			<td></td>
			<td>To create the tissue microarray block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma

Diffust infiltrerende gliomer er forbundet med høj sygelighed og dødelighed på grund af tumorspredningens infiltrative karakter. De er morfologisk komplekse tumorer med en høj grad af proteomisk variabilitet på tværs af både selve tumoren og dens heterogene mikromiljø. Det ondartede potentiale af disse tumorer forbedres ved dysregulering af proteiner involveret i flere nøgleveje, herunder processer, der opretholder cellulær stabilitet og bevarer mikromiljøets strukturelle integritet. Selvom der har været adskillige bulk- og enkeltcellegliomanalyser, er der en relativ mangel på rumlig stratificering af disse proteomiske data. Forståelse af forskelle i rumlig fordeling af tumorfremkaldende faktorer og immuncellepopulationer mellem den iboende tumor, invasiv kant og mikromiljø giver værdifuld indsigt i de mekanismer, der ligger til grund for tumorproliferation og formering. Digital rumlig profilering (DSP) repræsenterer en kraftfuld teknologi, der kan danne grundlaget for disse vigtige flerlagsanalyser.
DSP er en metode, der effektivt kvantificerer proteinekspression inden for brugerdefinerede rumlige regioner i en vævsprøve. DSP er ideel til at studere differentialekspressionen af flere proteiner inden for og på tværs af udmærkelsesregioner, hvilket muliggør flere niveauer af kvantitativ og kvalitativ analyse. DSP-protokollen er systematisk og brugervenlig, hvilket giver mulighed for tilpasset rumlig analyse af proteomiske data. I dette eksperiment er vævsmikroarrays konstrueret af arkiverede glioblastomkernebiopsier. Derefter vælges et panel af antistoffer, der er målrettet mod proteiner af interesse i prøven. Antistofferne, som er prækonjugeret til UV-fotokleerbare DNA-oligonukleotider, inkuberes derefter med vævsprøven natten over. Under fluorescensmikroskopivisualisering af antistofferne defineres interesseområder (ROI'er), inden for hvilke proteinekspression kan kvantificeres med prøverne. UV-lys rettes derefter mod hvert investeringsafkast og spalter DNA-oligonukleotiderne. Oligonukleotiderne mikroaspireres og tælles inden for hver ROI, hvilket kvantificerer det tilsvarende protein på rumlig basis.

Figur 4 viser de repræsentative resultater fra et DSP-eksperiment udført på prøver af glioblastom. Et varmekort præsenteres, der illustrerer en af metoderne til at fange data visuelt ved hjælp af DSP-softwaren. Rækker repræsenterer proteinmål, og hver kolonne svarer til en interesseregion. Et farveområde fra blå til rød angiver henholdsvis lavt til højt udtryk. Variabilitet af farve inden for en række afspejler regional protein heterogenitet og antyder en mulig rumlig sammenhæ...

Watch this Scientific Journal Video about Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma at JoVE.com

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Proteomisk dysregulering spiller en vigtig rolle i spredningen af diffust infiltrerende gliomer, men flere relevante proteiner forbliver uidentificerede. Digital rumlig behandling (DSP) tilbyder en effektiv tilgang med høj kapacitet til karakterisering af differentiel ekspression af kandidatproteiner, der kan bidrage til invasion og migration af infiltrative gliomer.

Digital rumlig profilering til karakterisering af mikromiljøet i voksentype diffust infiltrerende gliom

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

Digital Spatial Profiling, eller DSP, tilbyder en effektiv metode til rumligt stratificeret proteinkvantificering. Dens implementering gør det muligt for os at karakterisere proteinekspression på tværs af forskellige regioner af en tumor og mikromiljøet. Et centralt træk ved DSP er dens multiplexing-kapacitet, der muliggør databehandling med høj kapacitet.Evnen til at definere tilpassede regioner af interesse giver desuden en rumlig dimension til dataanalyse. DSP kan anvendes på enhver prøve, hvor rumligt kvantificerende protein eller RNA-ekspression kan hjælpe med at belyse en patologisk eller fysiologisk proces. Dette er især relevant i onkologi, hvor regional målvariation kan korrelere med ondartet vækst eller invasion.Demonstrerer proceduren vil være Scott Palisoul, en histoteknolog, og Rachael Barney, en genomisk teknolog. For at forberede dias skal du begynde med at tage flere to millimeter kerner fra hver biopsi og sætte dem i en enkelt vævsmikroarrayblok. Skær fire mikron sektioner fra blokken, og monter dem på glasglas.Placer hvert dias inde i glideholderpakningen, og inkuber det ved 60 grader Celsius i 30 minutter. I det halvautomatiske IHC-system skal du fylde beholderen i position et med 150 mikroliter vaskebuffer pr. dias plus fem milliliter dødt volumen og lade låget stå åbent. Fyld den samme mængde blokeringsopløsning i beholderen i position to.Læg reagensbeholderbakken på maskinen. Vælg Process IHC efterfulgt af blokering af løsningsnavn i rullemenuen i feltet Markør. Når du er færdig med alle dias, skal du klikke på Luk.Klik derefter på Udskriv etiketter, og marker Alle diasetiketter, der endnu ikke er udskrevet, og klik på Udskriv. Sæt etiketter på toppen af diasene. Læg diasene på glidebakken, og sørg for, at prøven og etiketten vender opad.Tryk på LED-knappen for at sænke bakken, og lad instrumentet begynde scanningen og genkendelsen af dias. Klik på Start-knappen for at starte eksperimentet. Når kørslen er færdig, skal du trykke på LED-knappen, når den blinker grønt.Fjern bakken fra instrumentet, og løft forsigtigt dækfliserne fra hvert dias. Placer diasene i 1X fosfatbufferet saltvand. Fjern overskydende buffer, og konturer hver vævssektion med en hydrofob pen for at skabe en hydrofob barriere.Lav en antistof PC-oligo-opløsning ved at tilføje otte mikroliter af hvert antistof pr. Dias og bruge Buffer W til at nå et endeligt volumen på 200 mikroliter. Påfør derefter antistoffet PC oligo-opløsningen på diasene og inkuber diasene natten over ved fire grader Celsius. Efter inkubation placeres diasene i en befugtet bakke og vaskes tre gange i 10 minutter i 1X TBST.Efterfiksering i 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af vask to gange i fem minutter i 1X TBST. Tilsæt SYTO 13 nuklear plet i 15 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af vask to gange med 1X TBST. Hold musen over Dataindsamling i Kontrolcenter, og vælg Ny eller Fortsæt kørsel.Placer sliden i slideholderen med etiketten mod brugeren. Sænk glidebakkeklemmen, og sørg for, at vævet er synligt i det aflange vindue. Tilføj seks milliliter Buffer S.Følg vejledningen i Kontrolcenter.Zoom mellem forskellige akser med x- og y-skyderne for at afgrænse et område til scanning. Vælg Scan, og lad scanningen fortsætte, indtil hele det definerede målområde er blevet afbildet. Generer et billede på 20 gange.Definer investeringsafkastene ved at vælge tre cirkulære investeringsafkast af samme størrelse med en diameter på 250 mikrometer for hver vævskerne. Godkend investeringsafkastene ved at klikke på knappen Afslut scanningsarbejdsområde. Vent derefter på, at UV-lyset spalter oligoerne fra antistofferne.Når du har afsluttet processen med rengøringsinstrumentet, skal du vælge Ny dataindsamling for at fortsætte med de aktuelle dias eller pladen. Åbn det færdige pladevindue ved at dobbeltklikke på ikonområdet Plade. Indtast hybridiseringskodens pakkepartinummer, og klik på Opdater.Klik derefter på Afslut. Fjern lysbilledholderen og opsamlingspladen ved at følge vejledningen. Opbevar diasene i TBST, eller dæk dem med et vandigt medium og dækslip til langtidsopbevaring.Forsegl pladerne ved hjælp af en permeabel tætning og tør aspirerne ved 65 grader Celsius i en termisk cyklist med toppen åben. Tilsæt syv mikroliter diethylpyrocarbonatbehandlet vand og bland. Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter, og drej derefter hurtigt ned.Forbered sondebufferblandingen ved at vælge passende sonde R- og sonde U-ligninger, der anvender ligningen som beskrevet i tekstprotokollen. Tilsæt 84 mikroliter sondebufferblanding til hver hybridiseringskodepakke. I en frisk 96-brønds hybridiseringsplade tilsættes otte mikroliter af hver hybridiseringskode masterblanding i alle de 12 brønde i den angivne række.Overfør syv mikroliter fra DSP-opsamlingspladen til den tilsvarende brønd i hybridiseringspladen. Varm tætning, drej pladen, og inkuber den natten over ved 67 grader Celsius. Efter inkubation afkøles pladen på is og udfører et hurtigt spin.Saml hybridiseringsprodukterne fra hver brønd i et strimmelrør, og pipetter forsigtigt hver brønd fem gange. Drej ned, og læg strimmelrørene i analysesystemet. På DSP-instrumentet skal du gemme CDF-filen på et USB-drev og overføre dataene til den digitale analysator.Tryk på Start behandling på skærmen. Vælg Høj følsomhed efterfulgt af Næste. Tryk på Vælg alle for antallet af brønde med eksempler og derefter Udfør efterfulgt af Næste i e-mailmeddelelsen.Klik derefter på Start. Når forberedelsesstationen er færdig, skal du forsegle patronen og overføre den til den digitale analysator. Tryk på Start optælling.Vælg Sceneposition. Tryk på Indlæs eksisterende CDF-fil, og vælg tidligere uploadet fil. Tryk på Udført.Vælg Sceneposition igen, tryk på Udført, og start derefter for at køre programmet. Gem ZIP-filen for reportertællingskonverteringsfilerne fra analysesystemet til et USB-drev. Indsæt drevet i DSP-maskinen.Hold markøren over Dataindsamling i DSP Control Center, og klik derefter på Upload konti. Vælg den relevante ZIP-fil. Klik på Poster i DSP Control Center.Hvis du vil have vist scanninger i køen, skal du vælge Føj valgte scanninger til kø og derefter Min analysekø. Vælg Ny undersøgelse fra Kø ved at holde markøren over indstillingen Dataanalyse i Kontrolcenter. DSP-eksperiment blev udført på prøver af glioblastom, og resultaterne blev visualiseret som et varmekort.Rækker repræsenterer proteinmål, og hver kolonne svarer til en interesseregion. Udtryksniveau er afbildet af et farveområde, der varierer fra blå, der viser lavt udtryk, til rød, hvilket angiver højt udtryk. Variabilitet af farve inden for en række afspejler regional protein heterogenitet og antyder en mulig rumlig sammenhæng med differentiel proteinekspression.I dette eksperiment var S100 og CD-56 universelt høje, fordi de er neurale markører. Markører med mest variabilitet inkluderer B7-H3, KI-67, CD-44 og fibronectin, som vides at være forbundet med tumorproliferation, migration og metastase. Ud fra en lang række kandidatmål kan DSP identificere dem, der udviser betydelig regional variation.Dette lægger grundlaget for at undersøge faktorer forbundet med variabilitet og deres relevans for sygdom.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokol til Rapid Post-mortem Cell Culture af Diffus Intrinsic Pontine gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR vurdering af pH, pO2, Redox Status, og koncentrationen af fosfat og glutathion i Tumor mikromiljø

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Evaluering af biomarkører i gliom af Immunhistokemi på Paraffin-Embedded 3D gliom Neurosphere kulturer

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation af Ortotopiske tumorer i bugspytkirtlen og ex vivo karakterisering af tumor Infiltrerende T-celle cytotoksicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse af sidepopulation i faste tumorcellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumortransplantation til vurdering af dynamikken i tumorinfiltrerende CD8 + T-celler i mus

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Rumlig profilering af protein- og RNA-ekspression i væv: En tilgang til finjustering af virtuel mikrodissektion

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Live-3D-celle immuncytokemiske assays af pædiatrisk diffust midterliniegliom

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Industrialiseret, kunstig intelligens-styret lasermikrodissektion til mikroskaleret proteomisk analyse af tumormikromiljøet

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed stregkode billedanalyse til immunprofilering og rumlig kortlægning karakterisering i enkeltcelleanalyse af paraffinvævsprøver

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...