Name: digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma
Uploaded: 2022-09-13T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma at JoVE.com

De auteurs erkennen de steun van het Laboratorium voor Klinische Genomica en Geavanceerde Technologie in de afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde van het Dartmouth Hitchcock Health System. De auteurs erkennen ook de Pathology Shared Resource in het Dartmouth Cancer Center met NCI Cancer Center Support Grant 5P30 CA023108-37.

Het onderstaande protocol volgt de richtlijnen van de Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten van wie weefselmonsters in dit onderzoek waren opgenomen. Zie de sectie Tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, reagentia, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt.
1. Dia voorbereiding17
<ol><li>Ophalen of bereiden formaline-gef...

<ol>
	<li>Pedersen, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+patterns+of+lac-z+transfected+human+glioma+cells+in+the+rat+brain.">Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain.</a> International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).</li><li>Iwadate, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+in+glioblastoma+progression.">Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression.</a> Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).</li><li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+and+prognosis+analysis+of+epithelial-mesenchymal+transition+in+glioma.">Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Barthel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+molecular+signature+and+crossroads+with+tumor+microenvironment.">Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).</li><li>Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-apoptosis+mechanisms+in+malignant+gliomas.">Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).</li><li>Berghoff, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death+ligand+1+expression+and+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+glioblastoma.">Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).</li><li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue.">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li><li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling.">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li><li>Garcia-Pardo, M., Calles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-1+NSCLC+therapy+resistance+mechanism.">ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism.</a> Precision Cancer Medicine. , (2021).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+spatial+profiling+of+individual+glomeruli+from+patients+with+anti-neutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+glomerulonephritis.">Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).</li><li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+GeoMx+digital+spatial+profiler.">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456 (2021).</li><li>Brady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-+and+intra-tumor+heterogeneity+of+metastatic+prostate+cancer+determined+by+digital+spatial+gene+expression+profiling.">Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling.</a> Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).</li><li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+digital+spatial+profiling+of+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+patients.">Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients.</a> Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).</li><li>Wang, D. Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study:+Digital+spatial+profiling+of+metastatic+clear+cell+carcinoma+reveals+intra-tumor+heterogeneity+in+epithelial-mesenchymal+gradient.">Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>GeoMx DSP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+slide+preparation+user+manual.">Automated slide preparation user manual.</a> GeoMx DSP. , (2022).</li><li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).</li><li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoadjuvant+versus+adjuvant+ipilimumab+plus+nivolumab+in+macroscopic+stage+III+melanoma.">Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).</li><li>Matthews, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-enriched+hyaluronan+binding+(BEHAB)/brevican+cleavage+in+a+glioma+cell+line+is+mediated+by+a+disintegrin+and+metalloproteinase+with+thrombospondin+motifs+(ADAMTS)+family+member.">Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).</li><li>Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+infiltration+into+central+nervous+system+tissue+in+vitro:+involvement+of+a+metalloprotease.">Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease.</a> Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).</li><li>Beli&#235;n, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-type+1+matrix+metalloprotease+(MT1-MMP)+enables+invasive+migration+of+glioma+cells+in+central+nervous+system+white+matter.">Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter.</a> Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).</li><li>Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+antigens+recognized+by+T+lymphocytes:+At+the+core+of+cancer+immunotherapy.">Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).</li><li>Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+for+cancer+prevention:+a+practical+and+feasible+approach+to+the+cancer+epidemic.">Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Chen, L., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-PD-1/PD-L1+therapy+of+human+cancer:+past,+present,+and+future.">Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-Associated+stromal+cells+stimulate+glioma+malignancy+by+regulating+the+tumor+immune+microenvironment.">Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).</li><li>Ishii, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+characterization+of+the+tumorigenic+&amp;#34;peri-necrotic+niche&amp;#34;+harboring+quiescent+stem-like+tumor+cells+in+glioblastoma.">Histological characterization of the tumorigenic &amp;#34;peri-necrotic niche&amp;#34; harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma.</a> PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).</li><li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments.">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).</li><li>NanoString. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CosMx+Spatial+Molecular+Imager:+True+Single-Cell+In+Situ+Solution.">CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution.</a> NanoString. , (2022).</li></ol>

Gezien de diversiteit aan eiwitten die mogelijk de agressiviteit van gliomen kunnen beïnvloeden en het idee dat verschillende van deze eiwitten onontdekt blijven, is een high-throughput eiwitkwantificeringsmethode een ideale technologische benadering. Aangezien ruimtelijke gegevens in oncologische monsters vaak correleren met differentiële expressie18, maakt het opnemen van ruimtelijke profilering in de eiwitkwantificeringsbenadering bovendien een effectievere analyse mogelijk.
<p class="jov...

Diffuus infiltrerende gliomen zijn het meest voorkomende type kwaadaardige hersentumor bij volwassenen en zijn steevast dodelijk. De neiging voor glioomcellen om uitgebreid in de hersenen te migreren is een grote therapeutische uitdaging. Het mechanisme waarmee ze zich verspreiden, omvat gerichte migratie en ongecontroleerde invasie. Van invasieve glioomcellen is aangetoond dat ze tropisme en migratie vertonen langs witte stofkanalen1, waarbij recent onderzoek demyelinisatie van deze kanalen impliceert als een actief, protumorigene eigenschap2. Invasie wordt gemedieerd door een epitheliale naar mesenchymale overgang, waarbij glioomcellen mesenchymale eigenschappen verwerven door de expressie van genen die coderen voor extracellulaire matrixeiwitten en celadhesiemoleculen te verminderen, migratie te versterken en de voortplanting door de tumormicro-omgeving te vergemakkelijken 3,4,5.
Op moleculair niveau is verstoring van verschillende eiwitten aangetoond die cellulaire stabiliteit en interface met immunogene componenten verlenen6. Van infiltratieve gliomen is bekend dat ze onderdrukking ondergaan van eiwitten met anti-apoptotische (bijv. PTEN) eigenschappen7. Ze overexpressie ook eiwitten die het ontwijken van de immuunrespons van de gastheer bevorderen (bijv. PD1 / PDL1)8. De ontregeling van deze complexe paden verbetert de tumorigeniciteit en verhoogt het kwaadaardige potentieel.
Binnen monsters van invasief glioom was het doel om de differentiële expressie van eiwitten te evalueren die essentieel zijn voor celgroei, overleving en proliferatie, en voor de structurele integriteit van micro-omgeving tussen invasieve en niet-invasieve componenten. Daarnaast probeerden we de differentiële regulatie van eiwitten met een actieve immunogene rol te bestuderen, waardoor we inzicht kregen in het mechanisme waarmee gecompromitteerde immuunafweer van de gastheer het proliferatieve en invasieve potentieel van gliomen kan verbeteren. Dit is vooral relevant gezien de recente breedte van onderzoek dat aantoont hoe immuunmarkers en drivers van ontregeling bij maligniteit kunnen dienen als doelwitten van immunotherapie. Het identificeren van levensvatbare therapeutische doelen onder de vele eiwitten die betrokken zijn bij immunosurveillance en reactiviteit vereist een zeer gevoelige en alomvattende aanpak.
Gezien het brede scala aan kandidaat-eiwitten dat kan worden bestudeerd, zochten we naar een methode die lijkt op immunohistochemie, maar met verbeterde efficiëntie van gegevensverwerking. Op het gebied van kankerbiologie is DSP naar voren gekomen als een krachtige technologie met belangrijke voordelen ten opzichte van alternatieve hulpmiddelen voor proteomische analyse en kwantificering. Het kenmerk van DSP is de multiplexing-capaciteit met hoge doorvoer, waardoor gelijktijdige studie van verschillende eiwitten in een monster mogelijk is, wat een belangrijk onderscheid markeert met standaard maar lagere plextechnologieën zoals immunohistochemie (IHC)9,10. De multiplexfunctie van DSP doet geen afbreuk aan de betrouwbaarheid ervan als een kwantitatief en analytisch hulpmiddel, zoals aangetoond door studies die DSP vergelijken met IHC. Bij gebruik voor proteomische kwantificering van niet-kleincellige longkankermonsters, bijvoorbeeld, is aangetoond dat DSP vergelijkbare resultaten heeft als IHC11. Bovendien biedt DSP aanpasbare regionale specificatie, waarin gebruikers handmatig regio's kunnen definiëren waarbinnen proteomische analyse kan worden uitgevoerd. Dit biedt een voordeel ten opzichte van multiplexmethoden met een hele sectie10,12. In een enkele verwerkingsronde biedt DSP dus meerdere analyselagen door verschillende eiwitdoelen in meerdere interessegebieden te onderzoeken.
DSP heeft toepassingen in verschillende pathologische omgevingen. DSP is vooral voordelig in oncologische analyse, omdat ruimtelijke variatie kan correleren met cellulaire transformatie en differentiële eiwitexpressie. DSP is bijvoorbeeld gebruikt om het proteomische profiel van borstkanker te vergelijken met de aangrenzende tumormicro-omgeving. Dit heeft belangrijke implicaties voor het begrijpen van de natuurlijke geschiedenis van deze tumor en de progressie ervan, evenals de mogelijke respons op behandeling13. Aanvullende contexten die de veelzijdigheid van DSP illustreren, zijn onder meer ruimtelijke kwantificering van eiwitdiversiteit bij prostaatkanker14, associatie van immuuncelmarkerexpressie met ziekteprogressie in hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom15, en demonstratie van een epitheliaal-mesenchymale gradiënt van eiwitexpressie die gemetastaseerde van primaire heldercellige eierstokkanker onderscheidt16 . Door DSP te implementeren, karakteriseren we de ruimtelijke topografie van eiwitten die tumorigenese en invasie van gliomen kunnen beïnvloeden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BOND Research Detection System</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DS9455</td>
			<td>Open detection system containing open containers in a reagent tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Wash</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>AR950</td>
			<td>10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer W</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 conjugation kit</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>AB188287</td>
			<td>Cy3 fluorescent antibody conjugation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>System for imaging and characterizing protein and RNA targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx DSP Instrument BufferKit</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100471</td>
			<td>Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Hyb Code Pack_Protein</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300401</td>
			<td>Controls for running GeoMX DSP experiemtns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300101</td>
			<td>Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300105</td>
			<td>Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Protein Slide Prep FFPE</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300308</td>
			<td>Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDH1-R132H antibody</td>
			<td>Dianova, Hamburg, Germany</td>
			<td>DIA-H09</td>
			<td>Monoclonal antibody against human IDH1 R132H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Bond RX</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Fully automated IHC stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Kit--12 reactions</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100052</td>
			<td>Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCounter Analysis System</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Master II</td>
			<td>3DHistech Ltd., Budapest, Hungary</td>
			<td></td>
			<td>To create the tissue microarray block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma

Diffuus infiltrerende gliomen zijn geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit als gevolg van de infiltratieve aard van tumorverspreiding. Het zijn morfologisch complexe tumoren, met een hoge mate van proteomische variabiliteit over zowel de tumor zelf als zijn heterogene micro-omgeving. Het kwaadaardige potentieel van deze tumoren wordt versterkt door de ontregeling van eiwitten die betrokken zijn bij verschillende belangrijke routes, waaronder processen die de cellulaire stabiliteit handhaven en de structurele integriteit van de micro-omgeving behouden. Hoewel er talloze bulk- en eencellige glioomanalyses zijn geweest, is er een relatief gebrek aan ruimtelijke stratificatie van deze proteomische gegevens. Het begrijpen van verschillen in ruimtelijke verdeling van tumorigene factoren en immuuncelpopulaties tussen de intrinsieke tumor, invasieve rand en micro-omgeving biedt waardevol inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan tumorproliferatie en -verspreiding. Digitale ruimtelijke profilering (DSP) vertegenwoordigt een krachtige technologie die de basis kan vormen voor deze belangrijke meerlagige analyses.
DSP is een methode die efficiënt eiwitexpressie kwantificeert binnen door de gebruiker gespecificeerde ruimtelijke gebieden in een weefselmonster. DSP is ideaal voor het bestuderen van de differentiële expressie van meerdere eiwitten binnen en tussen onderscheidregio's, waardoor meerdere niveaus van kwantitatieve en kwalitatieve analyse mogelijk zijn. Het DSP-protocol is systematisch en gebruiksvriendelijk, waardoor ruimtelijke analyse van proteomische gegevens op maat mogelijk is. In dit experiment worden weefselmicroarrays opgebouwd uit gearchiveerde glioblastoomkernbiopten. Vervolgens wordt een panel van antilichamen geselecteerd, gericht op eiwitten van belang in het monster. De antilichamen, die worden voorgeconjugeerd tot UV-fotocleavable DNA-oligonucleotiden, worden vervolgens 's nachts geïncubeerd met het weefselmonster. Onder fluorescentiemicroscopievisualisatie van de antilichamen worden regio's van belang (ROI's) gedefinieerd waarbinnen eiwitexpressie kan worden gekwantificeerd met de monsters. UV-licht wordt vervolgens gericht op elke ROI, waarbij de DNA-oligonucleotiden worden gesplitst. De oligonucleotiden worden gemicroaspirateerd en geteld binnen elke ROI, waarbij het overeenkomstige eiwit op ruimtelijke basis wordt gekwantificeerd.

Figuur 4 toont de representatieve resultaten van een DSP-experiment uitgevoerd op monsters van glioblastoom. Er wordt een heatmap gepresenteerd, die een van de methoden illustreert waarmee gegevens visueel kunnen worden vastgelegd met behulp van de DSP-software. Rijen vertegenwoordigen eiwitdoelen en elke kolom komt overeen met een interessegebied. Een kleurbereik van blauw tot rood duidt respectievelijk op een lage tot hoge expressie. Variabiliteit van kleur binnen een rij weerspiegelt regi...

Watch this Scientific Journal Video about Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma at JoVE.com

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Proteomische ontregeling speelt een belangrijke rol bij de verspreiding van diffuus infiltrerende gliomen, maar verschillende relevante eiwitten blijven ongeïdentificeerd. Digitale ruimtelijke verwerking (DSP) biedt een efficiënte, high-throughput benadering voor het karakteriseren van de differentiële expressie van kandidaat-eiwitten die kunnen bijdragen aan de invasie en migratie van infiltratieve gliomen.

Digitale ruimtelijke profilering voor karakterisering van de micro-omgeving in diffuus infiltrerend glioom van het volwassen type

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

Digital Spatial Profiling, of DSP, biedt een efficiënte methode voor ruimtelijk gestratificeerde eiwitkwantificering. De implementatie ervan stelt ons in staat om eiwitexpressie te karakteriseren in verschillende regio's van een tumor en de micro-omgeving. Een belangrijk kenmerk van DSP is de multiplexing-mogelijkheid, waardoor gegevensverwerking met hoge doorvoer mogelijk is.De mogelijkheid om aangepaste interessegebieden te definiëren, biedt bovendien een ruimtelijke dimensie aan gegevensanalyse. DSP kan worden toegepast op elk monster waarin ruimtelijk kwantificerend eiwit of RNA-expressie kan helpen bij het ophelderen van een pathologisch of fysiologisch proces. Dit is vooral relevant in de oncologie, waar regionale doelvariabiliteit kan correleren met kwaadaardige groei of invasie.Scott Palisoul, een histotechnoloog, en Rachael Barney, een genomische technoloog, demonstreren de procedure. Om dia's voor te bereiden, begint u met het nemen van verschillende kernen van twee millimeter van elke biopsie en plaatst u ze in een enkel weefselmicroarrayblok. Snijd secties van vier micron uit het blok en monteer ze op glazen dia's.Plaats elke glijbaan in de pakking van de diahouder en incubeer deze gedurende 30 minuten bij 60 graden Celsius. Vul in het semi-geautomatiseerde IHC-systeem de container op positie één met 150 microliter wasbuffer per dia, plus vijf milliliter dood volume, en laat het deksel open. Vul dezelfde hoeveelheid blokkerende oplossing in de container op positie twee.Plaats de reagenscontainerlade op de machine. Selecteer de Proces-IHC, gevolgd door het blokkeren van de naam van de oplossing in de vervolgkeuzelijst van het veld Markering. Als u klaar bent voor alle dia's, klikt u op Sluiten.Klik vervolgens op Etiketten afdrukken en vink Alle dialabels aan die nog niet zijn afgedrukt en klik op Afdrukken. Plak labels op de bovenkanten van de dia's. Plaats de dia's op de schuiflade en zorg ervoor dat het monster en het label naar boven gericht zijn.Druk op de LED-knop om de lade te laten zakken en laat het instrument beginnen met het scannen en herkennen van dia's. Klik op de knop Start om het experiment te starten. Wanneer de run is voltooid, drukt u op de LED-knop wanneer deze groen knippert.Verwijder de lade van het instrument en til de afdektegels voorzichtig van elke dia op. Plaats de dia's in de 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing. Verwijder overtollige buffer en schets elke weefselsectie met een hydrofobe pen om een hydrofobe barrière te creëren.Maak een antilichaam PC oligo oplossing door acht microliter van elk antilichaam per dia toe te voegen en buffer W te gebruiken om een eindvolume van 200 microliter te bereiken. Breng vervolgens de antilichaam PC oligo-oplossing aan op de dia's en incubeer de dia's 's nachts bij vier graden Celsius. Plaats na incubatie de dia's in een bevochtigde lade en was driemaal gedurende 10 minuten in 1X TBST.Post-fix in 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door tweemaal wassen gedurende vijf minuten in 1X TBST. Voeg SYTO 13 kernvlek toe gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door tweemaal wassen met 1X TBST. Plaats de muisaanwijzer op Gegevensverzameling in het bedieningspaneel en selecteer Nieuw of Doorgaan met uitvoeren.Plaats de dia in de diahouder met het label naar de gebruiker toe. Laat de schuifladeklem zakken en zorg ervoor dat het weefsel zichtbaar is in het langwerpige venster. Voeg zes milliliter buffer S toe.Volg de aanwijzingen in het bedieningspaneel.Zoom tussen verschillende assen met de x- en y-schuifregelaars om een gebied af te bakenen dat moet worden gescand. Selecteer Scannen en laat de scan doorgaan totdat het hele gedefinieerde doelgebied is afgebeeld. Genereer een afbeelding van 20 keer.Definieer de ROI's door drie even grote cirkelvormige ROIs met een diameter van 250 micrometer voor elke weefselkern te selecteren. Keur de ROI's goed door op de knop Scanwerkruimte afsluiten te klikken. Wacht vervolgens tot het UV-licht de oligo's van de antilichamen splijt.Nadat u het reinigingsinstrumentproces hebt voltooid, selecteert u Nieuwe gegevensverzameling om door te gaan met de huidige dia's of plaat. Open het voltooide plaatvenster door te dubbelklikken op het pictogramgebied Plaat. Voer het lotnummer van het hybridisatiecodepakket in en klik op Bijwerken.Klik vervolgens op Afronden. Koppel de schuifhouder en de opvangplaat los door de aanwijzingen te volgen. Bewaar de dia's in TBST of bedek ze met een waterig medium en afdek slip voor langdurige opslag.Sluit de platen af met een doorlatende afdichting en droog de aspiraten op 65 graden Celsius in een thermische cycler met de bovenkant open. Voeg zeven microliter diethylpyrocarbonaat behandeld water toe en meng. Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur en draai dan snel naar beneden.Bereid de probebuffermix voor door de juiste probe R- en probe U-vergelijkingen te kiezen die de vergelijking toepassen zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 84 microliter probebuffermix toe aan elk hybridisatiecodepakket. Voeg in een verse hybridisatieplaat met 96 putten acht microliter van elke hybridisatiecodemastermix toe aan alle 12 putten van de aangegeven rij.Breng zeven microliter over van de DSP-opvangplaat naar de overeenkomstige put in de hybridisatieplaat. Verwarm de plaat, draai de plaat en incubeer deze 's nachts bij 67 graden Celsius. Koel na incubatie de plaat af op ijs en voer een snelle draai uit.Bundel de hybridisatieproducten van elke put in een stripbuis en pipetteer elke put voorzichtig vijf keer. Draai naar beneden en laad de stripbuizen in het analysesysteem. Sla het CDF-bestand op een USB-station op het DSP-instrument op en breng de gegevens over naar de digitale analyzer.Druk op het scherm op Verwerking starten. Selecteer Hoge gevoeligheid gevolgd door Volgende. Druk op Alles selecteren voor het aantal putjes met monsters, vervolgens op Voltooien, gevolgd door Volgende op de e-mailmelding.Klik vervolgens op Start. Zodra het voorbereidingsstation klaar is, verzegelt u de cartridge en brengt u deze over naar de digitale analysator. Druk op Start Counting.Selecteer Stage Position. Druk op Bestaand CDF-bestand laden en selecteer eerder geüpload bestand. Druk op Gereed.Selecteer nogmaals Stage Position, druk op Gereed en vervolgens op Start om het programma uit te voeren. Sla het ZIP-bestand van de conversiebestanden van het aantal reporters van het analysesysteem op een USB-station op. Plaats de schijf in het DSP-apparaat.Plaats in het DSP Control Center de muisaanwijzer op Gegevensverzameling en klik vervolgens op Accounts uploaden. Selecteer het relevante ZIP-bestand. Klik op Records in het DSP Control Center.Als u scans in de wachtrij wilt weergeven, selecteert u Geselecteerde scans toevoegen aan wachtrij en vervolgens Mijn analysewachtrij. Selecteer Nieuw onderzoek in wachtrij door de muisaanwijzer op de optie Gegevensanalyse in het bedieningspaneel te plaatsen. DSP-experiment werd uitgevoerd op monsters van glioblastoom en de resultaten werden gevisualiseerd als een heatmap.Rijen vertegenwoordigen eiwitdoelen en elke kolom komt overeen met een interessegebied. Expressieniveau wordt weergegeven door een kleurbereik dat varieert van blauw, met een lage expressie, tot rood, wat een hoge expressie aangeeft. Variabiliteit van kleur binnen een rij weerspiegelt regionale eiwitheterogeniteit en suggereert een mogelijke ruimtelijke associatie met differentiële eiwitexpressie.In dit experiment waren S100 en CD-56 universeel hoog, omdat het neurale markers zijn. Markers met de meeste variabiliteit zijn B7-H3, KI-67, CD-44 en fibronectine, waarvan bekend is dat ze geassocieerd zijn met tumorproliferatie, migratie en metastase. Uit een breed scala aan kandidaat-doelen kan DSP degenen identificeren die aanzienlijke regionale variatie vertonen.Dit legt de basis voor het onderzoeken van factoren die verband houden met variabiliteit en hun relevantie voor ziekte.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Een protocol voor snelle post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR beoordeling van pH, pO2, Redox Status, en concentraties van fosfaat en glutathion in de communicatie van de Tumor

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Evaluatie van Biomarkers in Glioma door Immunohistochemistry op 3D Glioma paraffine-ingebedde Neurosphere culturen

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generatie van Orthotopic alvleesklier tumoren en ex vivo karakterisering van tumor-Infiltrerende T cel cytotoxiciteit

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse van zijpopulatie in vaste tumorcellijnen

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumortransplantatie voor het beoordelen van de dynamiek van tumorinfiltrerende CD8 + T-cellen bij muizen

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Ruimtelijke profilering van eiwit- en RNA-expressie in weefsel: een benadering om virtuele microdissectie te verfijnen

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Live-3D-cel immunocytochemie Assays van pediatrische diffuse middellijn glioom

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Geïndustrialiseerde, kunstmatige intelligentie-geleide lasermicrodissectie voor proteomische analyse op microschaal van de tumormicro-omgeving

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed Barcoding beeldanalyse voor immunoprofiling en ruimtelijke kartering in de eencellige analyse van paraffineweefselmonsters

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...