Name: digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma
Uploaded: 2022-09-13T12:50:00
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Les auteurs reconnaissent le soutien du Laboratoire de génomique clinique et de technologie avancée du Département de pathologie et de médecine de laboratoire du système de santé Hitchcock de Dartmouth. Les auteurs remercient également la ressource partagée en pathologie au Dartmouth Cancer Center avec la subvention de soutien du NCI Cancer Center 5P30 CA023108-37.

Le protocole décrit ci-dessous suit les lignes directrices du Comité d’éthique de la recherche sur les êtres humains de Dartmouth-Hitchcock. Le consentement éclairé a été obtenu des patients dont les échantillons de tissus ont été inclus dans cette étude. Voir la section Tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole.
1. Préparation des diapositives<sup class="...

<ol>
	<li>Pedersen, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+patterns+of+lac-z+transfected+human+glioma+cells+in+the+rat+brain.">Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain.</a> International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).</li><li>Iwadate, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+in+glioblastoma+progression.">Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression.</a> Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).</li><li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+and+prognosis+analysis+of+epithelial-mesenchymal+transition+in+glioma.">Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Barthel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+molecular+signature+and+crossroads+with+tumor+microenvironment.">Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).</li><li>Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-apoptosis+mechanisms+in+malignant+gliomas.">Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).</li><li>Berghoff, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death+ligand+1+expression+and+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+glioblastoma.">Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).</li><li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue.">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li><li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling.">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li><li>Garcia-Pardo, M., Calles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-1+NSCLC+therapy+resistance+mechanism.">ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism.</a> Precision Cancer Medicine. , (2021).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+spatial+profiling+of+individual+glomeruli+from+patients+with+anti-neutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+glomerulonephritis.">Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).</li><li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+GeoMx+digital+spatial+profiler.">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456 (2021).</li><li>Brady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-+and+intra-tumor+heterogeneity+of+metastatic+prostate+cancer+determined+by+digital+spatial+gene+expression+profiling.">Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling.</a> Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).</li><li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+digital+spatial+profiling+of+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+patients.">Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients.</a> Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).</li><li>Wang, D. Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study:+Digital+spatial+profiling+of+metastatic+clear+cell+carcinoma+reveals+intra-tumor+heterogeneity+in+epithelial-mesenchymal+gradient.">Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>GeoMx DSP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+slide+preparation+user+manual.">Automated slide preparation user manual.</a> GeoMx DSP. , (2022).</li><li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).</li><li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoadjuvant+versus+adjuvant+ipilimumab+plus+nivolumab+in+macroscopic+stage+III+melanoma.">Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).</li><li>Matthews, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-enriched+hyaluronan+binding+(BEHAB)/brevican+cleavage+in+a+glioma+cell+line+is+mediated+by+a+disintegrin+and+metalloproteinase+with+thrombospondin+motifs+(ADAMTS)+family+member.">Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).</li><li>Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+infiltration+into+central+nervous+system+tissue+in+vitro:+involvement+of+a+metalloprotease.">Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease.</a> Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).</li><li>Beli&#235;n, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-type+1+matrix+metalloprotease+(MT1-MMP)+enables+invasive+migration+of+glioma+cells+in+central+nervous+system+white+matter.">Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter.</a> Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).</li><li>Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+antigens+recognized+by+T+lymphocytes:+At+the+core+of+cancer+immunotherapy.">Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).</li><li>Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+for+cancer+prevention:+a+practical+and+feasible+approach+to+the+cancer+epidemic.">Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Chen, L., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-PD-1/PD-L1+therapy+of+human+cancer:+past,+present,+and+future.">Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-Associated+stromal+cells+stimulate+glioma+malignancy+by+regulating+the+tumor+immune+microenvironment.">Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).</li><li>Ishii, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+characterization+of+the+tumorigenic+&amp;#34;peri-necrotic+niche&amp;#34;+harboring+quiescent+stem-like+tumor+cells+in+glioblastoma.">Histological characterization of the tumorigenic &amp;#34;peri-necrotic niche&amp;#34; harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma.</a> PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).</li><li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments.">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).</li><li>NanoString. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CosMx+Spatial+Molecular+Imager:+True+Single-Cell+In+Situ+Solution.">CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution.</a> NanoString. , (2022).</li></ol>

Compte tenu de la diversité des protéines qui pourraient potentiellement influencer l’agressivité des gliomes et de l’idée que plusieurs de ces protéines restent non découvertes, une méthode de quantification des protéines à haut débit est une approche technologique idéale. De plus, étant donné que les données spatiales dans les échantillons oncologiques sont souvent corrélées avec l’expression différentielle18, l’intégration du profilage spatial dans l’approche de qua...

Les gliomes infiltrant de manière diffuse sont le type le plus courant de tumeur cérébrale maligne chez l’adulte et sont invariablement mortels. La propension des cellules de gliome à migrer largement dans le cerveau est un défi thérapeutique majeur. Le mécanisme par lequel ils se propagent implique une migration dirigée et une invasion incontrôlée. Il a été démontré que les cellules de gliome invasives présentent un tropisme et une migration le long des faisceaux de substance blanche1, des recherches récentes impliquant la démyélinisation de ces voies comme une caractéristique protumorigène active2. L’invasion est médiée par une transition épithélio-mésenchymateuse, dans laquelle les cellules de gliome acquièrent des propriétés mésenchymateuses en réduisant l’expression des gènes codant pour les protéines de la matrice extracellulaire et les molécules d’adhésion cellulaire, amplifiant la migration et facilitant la propagation à travers le microenvironnement tumoral 3,4,5.
Au niveau moléculaire, la perturbation de plusieurs protéines qui confèrent une stabilité cellulaire et une interface avec des composants immunogènes a été démontrée6. Les gliomes infiltrants sont connus pour subir la suppression de protéines ayant des propriétés anti-apoptotiques (par exemple, PTEN)7. Ils surexpriment également des protéines qui favorisent l’évasion de la réponse immunitaire de l’hôte (p. ex. PD1/PDL1)8. La dérégulation de ces voies complexes augmente la tumorigénicité et augmente le potentiel malin.
Dans des échantillons de gliome invasif, l’objectif était d’évaluer l’expression différentielle de protéines essentielles à la croissance, à la survie et à la prolifération cellulaires, ainsi qu’à l’intégrité structurelle du microenvironnement entre les composants invasifs et non invasifs. De plus, nous avons cherché à étudier la régulation différentielle des protéines ayant un rôle immunogène actif, offrant un aperçu du mécanisme par lequel les défenses immunitaires de l’hôte compromis peuvent améliorer le potentiel prolifératif et invasif des gliomes. Ceci est particulièrement pertinent compte tenu de l’ampleur récente de la recherche démontrant comment les marqueurs immunitaires et les facteurs de dérégulation dans la malignité peuvent servir de cibles de l’immunothérapie. L’identification de cibles thérapeutiques viables parmi les nombreuses protéines impliquées dans l’immunosurveillance et la réactivité nécessite une approche très sensible et globale.
Compte tenu du large éventail de protéines candidates pouvant être étudiées, nous avons cherché une méthode semblable à l’immunohistochimie, mais avec une efficacité accrue du traitement des données. Dans le domaine de la biologie du cancer, DSP est apparu comme une technologie puissante avec des avantages importants par rapport aux outils alternatifs pour l’analyse et la quantification protéomique. La caractéristique du DSP est sa capacité de multiplexage à haut débit, permettant l’étude simultanée de plusieurs protéines différentes dans un échantillon, marquant une distinction importante des technologies standard mais à plus faible plex telles que l’immunohistochimie (IHC)9,10. La caractéristique multiplex du DSP ne compromet pas sa fidélité en tant qu’outil quantitatif et analytique, comme le démontrent les études comparant le DSP à l’IHC. Lorsqu’il est utilisé pour la quantification protéomique d’échantillons de cancer du poumon non à petites cellules, par exemple, il a été démontré que le DSP donne des résultats similaires à IHC11. En outre, DSP offre une spécification régionale personnalisable, dans laquelle les utilisateurs peuvent définir manuellement des régions dans lesquelles effectuer une analyse protéomique. Cela présente un avantage par rapport aux méthodes multiplex à section entière10,12. En un seul cycle de traitement, DSP offre ainsi plusieurs couches d’analyse en examinant plusieurs cibles protéiques dans plusieurs régions d’intérêt.
DSP a des applications dans plusieurs contextes pathologiques différents. La DSP est particulièrement avantageuse dans l’analyse oncologique, car la variation spatiale peut être corrélée à la transformation cellulaire et à l’expression différentielle des protéines. Par exemple, le DSP a été utilisé pour comparer le profil protéomique du cancer du sein au microenvironnement tumoral adjacent. Cela comporte des implications importantes pour la compréhension de l’histoire naturelle de cette tumeur et de sa progression, ainsi que de la réponse potentielle au traitement13. D’autres contextes illustrant la polyvalence du DSP comprennent la quantification spatiale de la diversité des protéines dans le cancer de la prostate14, l’association de l’expression des marqueurs cellulaires immunitaires avec la progression de la maladie dans le carcinome épidermoïde de la tête et du cou 15 et la démonstration d’un gradient épithélial-mésenchymateux de l’expression protéique distinguant le cancer de l’ovaire métastatique du cancer primaire de l’ovaire à cellules claires16 . En implémentant DSP, nous caractérisons la topographie spatiale des protéines qui pourraient avoir un impact sur la tumorigenèse et l’invasion des gliomes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BOND Research Detection System</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DS9455</td>
			<td>Open detection system containing open containers in a reagent tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Wash</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>AR950</td>
			<td>10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer W</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 conjugation kit</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>AB188287</td>
			<td>Cy3 fluorescent antibody conjugation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>System for imaging and characterizing protein and RNA targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx DSP Instrument BufferKit</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100471</td>
			<td>Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Hyb Code Pack_Protein</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300401</td>
			<td>Controls for running GeoMX DSP experiemtns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300101</td>
			<td>Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300105</td>
			<td>Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Protein Slide Prep FFPE</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300308</td>
			<td>Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDH1-R132H antibody</td>
			<td>Dianova, Hamburg, Germany</td>
			<td>DIA-H09</td>
			<td>Monoclonal antibody against human IDH1 R132H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Bond RX</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Fully automated IHC stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Kit--12 reactions</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100052</td>
			<td>Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCounter Analysis System</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Master II</td>
			<td>3DHistech Ltd., Budapest, Hungary</td>
			<td></td>
			<td>To create the tissue microarray block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma

Les gliomes infiltrant de manière diffuse sont associés à une morbidité et une mortalité élevées en raison de la nature infiltrante de la propagation tumorale. Ce sont des tumeurs morphologiquement complexes, avec un degré élevé de variabilité protéomique à la fois dans la tumeur elle-même et dans son microenvironnement hétérogène. Le potentiel malin de ces tumeurs est renforcé par la dérégulation des protéines impliquées dans plusieurs voies clés, y compris les processus qui maintiennent la stabilité cellulaire et préservent l’intégrité structurelle du microenvironnement. Bien qu’il y ait eu de nombreuses analyses de gliome en vrac et unicellulaire, il y a une relative rareté de stratification spatiale de ces données protéomiques. Comprendre les différences dans la distribution spatiale des facteurs tumorigènes et des populations de cellules immunitaires entre la tumeur intrinsèque, la bordure invasive et le microenvironnement offre des informations précieuses sur les mécanismes sous-jacents à la prolifération et à la propagation des tumeurs. Le profilage spatial numérique (DSP) représente une technologie puissante qui peut constituer la base de ces importantes analyses multicouches.
DSP est une méthode qui quantifie efficacement l’expression des protéines dans les régions spatiales spécifiées par l’utilisateur dans un échantillon de tissu. DSP est idéal pour étudier l’expression différentielle de plusieurs protéines dans et entre les régions de distinction, permettant plusieurs niveaux d’analyse quantitative et qualitative. Le protocole DSP est systématique et convivial, permettant une analyse spatiale personnalisée des données protéomiques. Dans cette expérience, des puces à ADN tissulaires sont construites à partir de biopsies de forage de glioblastome archivées. Ensuite, un panel d’anticorps est sélectionné, ciblant les protéines d’intérêt dans l’échantillon. Les anticorps, qui sont préconjugués aux oligonucléotides d’ADN photoclivables par UV, sont ensuite incubés avec l’échantillon de tissu pendant une nuit. Dans le cadre de la visualisation par microscopie à fluorescence des anticorps, les régions d’intérêt (ROI) dans lesquelles quantifier l’expression des protéines sont définies avec les échantillons. La lumière UV est ensuite dirigée vers chaque ROI, clivant les oligonucléotides d’ADN. Les oligonucléotides sont microaspirés et comptés dans chaque ROI, quantifiant la protéine correspondante sur une base spatiale.

La figure 4 montre les résultats représentatifs d’une expérience DSP réalisée sur des échantillons de glioblastome. Une carte thermique est présentée, illustrant l’une des méthodes permettant de capturer visuellement des données à l’aide du logiciel DSP. Les lignes représentent les cibles protéiques, et chaque colonne correspond à une région d’intérêt. Une gamme de couleurs de bleu à rouge indique une expression faible à élevée, respectivement. La variabilité de...

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Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

La dysrégulation protéomique joue un rôle important dans la propagation des gliomes infiltrant de manière diffuse, mais plusieurs protéines pertinentes restent non identifiées. Le traitement spatial numérique (DSP) offre une approche efficace et à haut débit pour caractériser l’expression différentielle des protéines candidates qui peuvent contribuer à l’invasion et à la migration des gliomes infiltrants.

Profilage spatial numérique pour la caractérisation du microenvironnement dans le gliome à infiltration diffuse de type adulte

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

Le profilage spatial numérique, ou DSP, offre une méthode efficace de quantification des protéines stratifiées spatialement. Sa mise en œuvre nous permet de caractériser l’expression des protéines dans des régions distinctes d’une tumeur et du microenvironnement. Une caractéristique clé de DSP est sa capacité de multiplexage, permettant un traitement de données à haut débit.La possibilité de définir des régions d’intérêt personnalisées fournit en outre une dimension spatiale à l’analyse des données. Le DSP peut être appliqué à tout échantillon dans lequel la quantification spatiale de la protéine ou l’expression de l’ARN peut aider à élucider un processus pathologique ou physiologique. Ceci est particulièrement pertinent en oncologie, où la variabilité régionale de la cible peut être corrélée à une croissance maligne ou à une invasion.Scott Palisoul, histotechnologue, et Rachael Barney, technologue en génomique, feront la démonstration de la procédure. Pour préparer les lames, commencez par prélever plusieurs carottes de deux millimètres de chaque biopsie et placez-les dans un seul bloc de microréseau tissulaire. Coupez des sections de quatre microns du bloc et montez-les sur des lames de verre.Placez chaque lame à l’intérieur du joint du porte-lames et incuberez-la à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes. Dans le système IHC semi-automatisé, remplissez le récipient en première position avec 150 microlitres de tampon de lavage par lame, plus cinq millilitres de volume mort, et laissez le couvercle ouvert. Remplissez la même quantité de solution de blocage dans le récipient en position deux.Chargez le bac du récipient de réactif sur la machine. Sélectionnez le processus IHC, suivi du blocage du nom de la solution dans la liste déroulante du champ Marqueur. Une fois toutes les diapositives terminées, cliquez sur Fermer.Cliquez ensuite sur Imprimer les étiquettes, cochez Toutes les étiquettes de diapositives non encore imprimées, puis cliquez sur Imprimer. Apposez des étiquettes sur le haut des diapositives. Chargez les lames sur le plateau de glissière, en veillant à ce que l’échantillon et l’étiquette soient orientés vers le haut.Appuyez sur le bouton LED pour abaisser le plateau et permettre à l’instrument de commencer la numérisation et la reconnaissance des diapositives. Cliquez sur le bouton Démarrer pour commencer l’expérience. Une fois l’exécution terminée, appuyez sur le bouton LED lorsqu’il clignote en vert.Retirez le plateau de l’instrument et soulevez délicatement les carreaux de couvercle de chaque glissière. Placez les lames dans la solution saline tamponnée au phosphate 1X. Retirez l’excès de tampon et délimitez chaque section de tissu avec un stylo hydrophobe pour créer une barrière hydrophobe.Faire une solution d’oligo PC anticorps en ajoutant huit microlitres de chaque anticorps par lame et en utilisant Buffer W pour atteindre un volume final de 200 microlitres. Ensuite, appliquez la solution oligo d’anticorps PC sur les lames et incuber les lames pendant une nuit à quatre degrés Celsius. Après l’incubation, placez les lames dans un plateau humidifié et lavez trois fois pendant 10 minutes dans 1X TBST.Post-fixation dans 4% de paraformaldéhyde pendant 30 minutes à température ambiante, suivi d’un lavage deux fois pendant cinq minutes dans 1X TBST. Ajouter la coloration nucléaire SYTO 13 pendant 15 minutes à température ambiante, puis laver deux fois avec 1X TBST. Passez la souris sur Collecte de données dans le Centre de contrôle et sélectionnez Nouveau ou Continuer l’exécution.Placez la diapositive dans le porte-diapositive avec l’étiquette vers l’utilisateur. Abaissez la pince du plateau coulissant, en veillant à ce que le tissu soit visible dans la fenêtre allongée. Ajoutez six millilitres de Buffer S.Suivez les instructions du Centre de contrôle.Effectuez un zoom entre différents axes à l’aide des curseurs x et y pour délimiter une région à numériser. Sélectionnez Scan, puis laissez l’analyse se poursuivre jusqu’à ce que toute la zone cible définie ait été imagée. Générez une image 20 fois.Définissez les ROI en sélectionnant trois ROI circulaires de taille égale d’un diamètre de 250 micromètres pour chaque noyau tissulaire. Approuvez le retour sur investissement en cliquant sur le bouton Quitter l’espace de travail d’analyse. Attendez ensuite que la lumière UV clive les oligos des anticorps.Une fois le processus de nettoyage de l’instrument terminé, sélectionnez Nouvelle collecte de données pour continuer avec les diapositives ou la plaque actuelles. Ouvrez la fenêtre de la plaque finalisée en double-cliquant sur la zone de l’icône de la plaque. Entrez le numéro de lot du pack de codes d’hybridation et cliquez sur Mettre à jour.Cliquez ensuite sur Finaliser. Détachez le support de glissière et la plaque de collecte en suivant les instructions. Conservez les lames dans TBST ou recouvrez-les d’un milieu aqueux et d’un couvercle pour un stockage à long terme.Scellez les plaques à l’aide d’un joint perméable et séchez les aspirats à 65 degrés Celsius dans un thermocycleur avec le couvercle ouvert. Ajouter sept microlitres d’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle et mélanger. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes, puis tourner rapidement.Préparez le mélange de tampons de sonde en choisissant les équations appropriées de la sonde R et de la sonde U en appliquant l’équation décrite dans le protocole texte. Ajouter 84 microlitres de mélange tampon de sonde à chaque paquet de codes d’hybridation. Dans une nouvelle plaque d’hybridation de 96 puits, ajouter huit microlitres de chaque mélange maître de code d’hybridation dans les 12 puits de la rangée indiquée.Transférer sept microlitres de la plaque de collecte DSP au puits correspondant dans la plaque d’hybridation. Thermoscellez, faites tourner la plaque et incuberez-la pendant la nuit à 67 degrés Celsius. Après l’incubation, refroidissez l’assiette sur de la glace et faites tourner rapidement.Regrouper les produits d’hybridation de chaque puits dans un tube en bande, en pipetant doucement chaque puits cinq fois. Faites tourner vers le bas et chargez les tubes de bande dans le système d’analyse. Sur l’instrument DSP, enregistrez le fichier CDF sur une clé USB et transférez les données vers l’analyseur numérique.À l’écran, appuyez sur Démarrer le traitement. Sélectionnez Haute sensibilité puis Suivant. Appuyez sur Sélectionner tout pour le nombre de puits contenant des échantillons, puis sur Terminer, puis sur Suivant dans la notification par e-mail.Cliquez ensuite sur Démarrer. Une fois la station de préparation terminée, scellez la cartouche et transférez-la dans l’analyseur numérique. Appuyez sur Commencer le décompte.Sélectionnez Position de la scène. Appuyez sur Charger le fichier CDF existant et sélectionnez Fichier précédemment téléchargé. Appuyez sur Terminé.Sélectionnez à nouveau Position de la scène, appuyez sur Terminé, puis sur Démarrer pour exécuter le programme. Enregistrez le fichier ZIP des fichiers de conversion du décompte du rapporteur du système d’analyse sur une clé USB. Insérez le lecteur dans la machine DSP.Dans le Centre de contrôle DSP, passez la souris sur Collecte de données, puis cliquez sur Télécharger des comptes. Sélectionnez le fichier ZIP approprié. Cliquez sur Enregistrements dans le centre de contrôle DSP.Pour afficher les analyses dans la file d’attente, sélectionnez Ajouter les analyses sélectionnées à la file d’attente, puis Ma file d’attente d’analyse. Sélectionnez Nouvelle étude dans la file d’attente en survolant l’option Analyse des données dans le Centre de contrôle. L’expérience DSP a été réalisée sur des échantillons de glioblastome, et les résultats ont été visualisés sous forme de carte thermique.Les lignes représentent les cibles protéiques, et chaque colonne correspond à une région d’intérêt. Le niveau d’expression est représenté par une gamme de couleurs variant du bleu, montrant une expression faible, au rouge, ce qui indique une expression élevée. La variabilité de la couleur au sein d’une rangée reflète l’hétérogénéité régionale des protéines et suggère une association spatiale possible avec l’expression différentielle des protéines.Dans cette expérience, S100 et CD-56 étaient universellement élevés, car ce sont des marqueurs neuronaux. Les marqueurs présentant la plus grande variabilité comprennent B7-H3, KI-67, CD-44 et la fibronectine, qui sont connus pour être associés à la prolifération tumorale, à la migration et aux métastases. À partir d’un large éventail de cibles candidates, DSP peut identifier celles qui présentent des variations régionales importantes.Cela jette les bases de l’étude des facteurs associés à la variabilité et de leur pertinence pour la maladie.

Research

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