Name: digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma
Uploaded: 2022-09-13T12:50:00
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Die Autoren würdigen die Unterstützung des Labors für klinische Genomik und fortschrittliche Technologie in der Abteilung für Pathologie und Labormedizin des Dartmouth Hitchcock Health System. Die Autoren erkennen auch die Pathology Shared Resource am Dartmouth Cancer Center mit NCI Cancer Center Support Grant 5P30 CA023108-37 an.

Das unten beschriebene Protokoll folgt den Richtlinien des Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Die Einwilligungserklärung wurde von den Patienten eingeholt, deren Gewebeproben in diese Studie eingeschlossen wurden. Weitere Informationen zu allen Materialien, Reagenzien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie im Abschnitt Materialtabelle .
1. Objektträgervorbereitung17
<ol><li>Gew...

<ol>
	<li>Pedersen, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+patterns+of+lac-z+transfected+human+glioma+cells+in+the+rat+brain.">Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain.</a> International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).</li><li>Iwadate, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+in+glioblastoma+progression.">Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression.</a> Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).</li><li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+and+prognosis+analysis+of+epithelial-mesenchymal+transition+in+glioma.">Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Barthel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+molecular+signature+and+crossroads+with+tumor+microenvironment.">Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).</li><li>Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-apoptosis+mechanisms+in+malignant+gliomas.">Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).</li><li>Berghoff, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death+ligand+1+expression+and+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+glioblastoma.">Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).</li><li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue.">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li><li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling.">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li><li>Garcia-Pardo, M., Calles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-1+NSCLC+therapy+resistance+mechanism.">ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism.</a> Precision Cancer Medicine. , (2021).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+spatial+profiling+of+individual+glomeruli+from+patients+with+anti-neutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+glomerulonephritis.">Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).</li><li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+GeoMx+digital+spatial+profiler.">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456 (2021).</li><li>Brady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-+and+intra-tumor+heterogeneity+of+metastatic+prostate+cancer+determined+by+digital+spatial+gene+expression+profiling.">Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling.</a> Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).</li><li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+digital+spatial+profiling+of+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+patients.">Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients.</a> Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).</li><li>Wang, D. Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study:+Digital+spatial+profiling+of+metastatic+clear+cell+carcinoma+reveals+intra-tumor+heterogeneity+in+epithelial-mesenchymal+gradient.">Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>GeoMx DSP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+slide+preparation+user+manual.">Automated slide preparation user manual.</a> GeoMx DSP. , (2022).</li><li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).</li><li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoadjuvant+versus+adjuvant+ipilimumab+plus+nivolumab+in+macroscopic+stage+III+melanoma.">Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).</li><li>Matthews, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-enriched+hyaluronan+binding+(BEHAB)/brevican+cleavage+in+a+glioma+cell+line+is+mediated+by+a+disintegrin+and+metalloproteinase+with+thrombospondin+motifs+(ADAMTS)+family+member.">Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).</li><li>Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+infiltration+into+central+nervous+system+tissue+in+vitro:+involvement+of+a+metalloprotease.">Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease.</a> Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).</li><li>Beli&#235;n, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-type+1+matrix+metalloprotease+(MT1-MMP)+enables+invasive+migration+of+glioma+cells+in+central+nervous+system+white+matter.">Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter.</a> Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).</li><li>Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+antigens+recognized+by+T+lymphocytes:+At+the+core+of+cancer+immunotherapy.">Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).</li><li>Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+for+cancer+prevention:+a+practical+and+feasible+approach+to+the+cancer+epidemic.">Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Chen, L., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-PD-1/PD-L1+therapy+of+human+cancer:+past,+present,+and+future.">Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-Associated+stromal+cells+stimulate+glioma+malignancy+by+regulating+the+tumor+immune+microenvironment.">Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).</li><li>Ishii, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+characterization+of+the+tumorigenic+&amp;#34;peri-necrotic+niche&amp;#34;+harboring+quiescent+stem-like+tumor+cells+in+glioblastoma.">Histological characterization of the tumorigenic &amp;#34;peri-necrotic niche&amp;#34; harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma.</a> PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).</li><li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments.">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).</li><li>NanoString. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CosMx+Spatial+Molecular+Imager:+True+Single-Cell+In+Situ+Solution.">CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution.</a> NanoString. , (2022).</li></ol>

Angesichts der Vielfalt der Proteine, die möglicherweise die Aggressivität von Gliomen beeinflussen könnten, und der Vorstellung, dass mehrere dieser Proteine unentdeckt bleiben, ist eine Hochdurchsatz-Proteinquantifizierungsmethode ein idealer technologischer Ansatz. Da räumliche Daten in onkologischen Proben häufig mit der differentiellen Expressionkorrelieren 18, ermöglicht die Einbeziehung räumlicher Profile in den Proteinquantifizierungsansatz eine effektivere Analyse.
<p class="jo...

Diffus infiltrierende Gliome sind die häufigste Form von bösartigen Hirntumoren bei Erwachsenen und sind ausnahmslos tödlich. Die Neigung von Gliomzellen, extensiv im Gehirn zu wandern, ist eine große therapeutische Herausforderung. Der Mechanismus, durch den sie sich ausbreiten, beinhaltet gezielte Migration und unkontrollierte Invasion. Es wurde gezeigt, dass invasive Gliomzellen Tropismus und Migration entlang der Bahnen der weißen Substanz aufweisen1, wobei neuere Forschungen die Demyelinisierung dieser Trakte als aktives, protumorigenes Merkmal implizieren2. Die Invasion wird durch einen epithelialen zu mesenchymalen Übergang vermittelt, bei dem Gliomzellen mesenchymale Eigenschaften erwerben, indem sie die Expression von Genen reduzieren, die extrazelluläre Matrixproteine und Zelladhäsionsmoleküle kodieren, die Migration verstärken und die Ausbreitung durch die Tumormikroumgebung erleichtern 3,4,5.
Auf molekularer Ebene wurde die Störung mehrerer Proteine nachgewiesen, die zelluläre Stabilität verleihen und mit immunogenen Komponenten interagieren6. Es ist bekannt, dass infiltrative Gliome eine Unterdrückung von Proteinen mit anti-apoptotischen (z. B. PTEN) Eigenschaften durchlaufen7. Sie überexprimieren auch Proteine, die die Umgehung der Immunantwort des Wirts fördern (z. B. PD1 / PDL1)8. Die Fehlregulation dieser komplexen Signalwege erhöht die Tumorigenität und erhöht das maligne Potenzial.
Innerhalb von Proben invasiver Gliome bestand das Ziel darin, die differentielle Expression von Proteinen zu bewerten, die für das Wachstum, Überleben und die Proliferation von Zellen sowie für die strukturelle Integrität der Mikroumgebung zwischen invasiven und nicht-invasiven Komponenten entscheidend sind. Darüber hinaus versuchten wir, die differentielle Regulation von Proteinen mit einer aktiven immunogenen Rolle zu untersuchen und Einblicke in den Mechanismus zu geben, durch den kompromittierte Immunabwehr des Wirts das proliferative und invasive Potenzial von Gliomen verbessern kann. Dies ist besonders relevant angesichts der jüngsten Breite der Forschung, die zeigt, wie Immunmarker und Treiber von Dysregulation bei Malignität als Ziele der Immuntherapie dienen können. Die Identifizierung praktikabler therapeutischer Ziele unter den vielen Proteinen, die an der Immunüberwachung und Reaktivität beteiligt sind, erfordert einen hochsensiblen und umfassenden Ansatz.
Angesichts der breiten Palette von Kandidatenproteinen, die untersucht werden können, suchten wir nach einer Methode, die der Immunhistochemie ähnelt, aber mit verbesserter Datenverarbeitungseffizienz. Im Bereich der Krebsbiologie hat sich DSP zu einer leistungsstarken Technologie mit wichtigen Vorteilen gegenüber alternativen Werkzeugen für die Proteomanalyse und -quantifizierung entwickelt. Das Markenzeichen von DSP ist seine Hochdurchsatz-Multiplexing-Fähigkeit, die die gleichzeitige Untersuchung mehrerer verschiedener Proteine innerhalb einer Probe ermöglicht, was einen wichtigen Unterschied zu Standard-, aber Low-Plex-Technologien wie der Immunhistochemie (IHC) darstellt9,10. Die Multiplex-Funktion von DSP beeinträchtigt nicht seine Treue als quantitatives und analytisches Werkzeug, wie Studien zeigen, in denen DSP mit IHC verglichen wird. Bei der Verwendung zur proteomischen Quantifizierung von nicht-kleinzelligen Lungenkrebsproben hat DSP beispielsweise ähnliche Ergebnisse wie IHC11. Darüber hinaus bietet DSP eine anpassbare regionale Spezifikation, in der Benutzer manuell Regionen definieren können, in denen proteomische Analysen durchgeführt werden sollen. Dies stellt einen Vorteil gegenüber Ganzsektions-Multiplex-Methoden10,12 dar. In einer einzigen Verarbeitungsrunde bietet DSP somit mehrere Analyseebenen, indem mehrere Proteinziele in mehreren Regionen von Interesse untersucht werden.
DSP hat Anwendungen in verschiedenen pathologischen Einstellungen. DSP ist besonders vorteilhaft in der onkologischen Analyse, da räumliche Variation mit zellulärer Transformation und differentieller Proteinexpression korrelieren kann. Zum Beispiel wurde DSP verwendet, um das proteomische Profil von Brustkrebs mit der benachbarten Tumormikroumgebung zu vergleichen. Dies hat wichtige Implikationen für das Verständnis des natürlichen Verlaufs dieses Tumors und seines Fortschreitens sowie für ein mögliches Ansprechen auf die Behandlung13. Weitere Kontexte, die die Vielseitigkeit der DSP veranschaulichen, umfassen die räumliche Quantifizierung der Proteindiversität bei Prostatakrebs14, die Assoziation der Immunzellmarkerexpression mit der Krankheitsprogression beim Kopf- und Halsplattenepithelkarzinom 15 und die Demonstration eines epithelial-mesenchymalen Gradienten der Proteinexpression, der metastasierten von primärem klarzelligem Ovarialkarzinom unterscheidet16 . Durch die Implementierung von DSP charakterisieren wir die räumliche Topographie von Proteinen, die die Tumorgenese und Invasion von Gliomen beeinflussen könnten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BOND Research Detection System</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DS9455</td>
			<td>Open detection system containing open containers in a reagent tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Wash</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>AR950</td>
			<td>10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer W</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 conjugation kit</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>AB188287</td>
			<td>Cy3 fluorescent antibody conjugation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>System for imaging and characterizing protein and RNA targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx DSP Instrument BufferKit</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100471</td>
			<td>Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Hyb Code Pack_Protein</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300401</td>
			<td>Controls for running GeoMX DSP experiemtns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300101</td>
			<td>Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300105</td>
			<td>Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Protein Slide Prep FFPE</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300308</td>
			<td>Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDH1-R132H antibody</td>
			<td>Dianova, Hamburg, Germany</td>
			<td>DIA-H09</td>
			<td>Monoclonal antibody against human IDH1 R132H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Bond RX</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Fully automated IHC stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Kit--12 reactions</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100052</td>
			<td>Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCounter Analysis System</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Master II</td>
			<td>3DHistech Ltd., Budapest, Hungary</td>
			<td></td>
			<td>To create the tissue microarray block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma

Diffus infiltrierende Gliome sind aufgrund der infiltrativen Natur der Tumorausbreitung mit hoher Morbidität und Mortalität verbunden. Sie sind morphologisch komplexe Tumoren mit einem hohen Grad an proteomischer Variabilität sowohl über den Tumor selbst als auch über seine heterogene Mikroumgebung. Das bösartige Potenzial dieser Tumoren wird durch die Dysregulation von Proteinen verstärkt, die an mehreren Schlüsselwegen beteiligt sind, einschließlich Prozessen, die die zelluläre Stabilität aufrechterhalten und die strukturelle Integrität der Mikroumgebung bewahren. Obwohl es zahlreiche Massen- und Einzelzell-Gliomanalysen gab, gibt es einen relativen Mangel an räumlicher Schichtung dieser proteomischen Daten. Das Verständnis der Unterschiede in der räumlichen Verteilung von tumorigenen Faktoren und Immunzellpopulationen zwischen dem intrinsischen Tumor, dem invasiven Rand und der Mikroumgebung bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen, die der Tumorproliferation und -ausbreitung zugrunde liegen. Digital Spatial Profiling (DSP) stellt eine leistungsstarke Technologie dar, die die Grundlage für diese wichtigen Mehrschichtanalysen bilden kann.
DSP ist eine Methode, die die Proteinexpression innerhalb benutzerdefinierter räumlicher Regionen in einer Gewebeprobe effizient quantifiziert. DSP ist ideal für die Untersuchung der differentiellen Expression mehrerer Proteine innerhalb und zwischen Regionen der Unterscheidung und ermöglicht mehrere Ebenen der quantitativen und qualitativen Analyse. Das DSP-Protokoll ist systematisch und benutzerfreundlich und ermöglicht eine maßgeschneiderte räumliche Analyse von Proteomdaten. In diesem Experiment werden Gewebe-Microarrays aus archivierten Glioblastom-Kernbiopsien konstruiert. Als nächstes wird ein Panel von Antikörpern ausgewählt, die auf Proteine von Interesse in der Probe abzielen. Die Antikörper, die an UV-photospaltbare DNA-Oligonukleotide vorkonjugiert werden, werden dann über Nacht mit der Gewebeprobe inkubiert. Unter fluoreszenzmikroskopischer Visualisierung der Antikörper werden mit den Proben Interessengebiete (ROIs) definiert, innerhalb derer die Proteinexpression quantifiziert werden kann. UV-Licht wird dann auf jeden ROI gerichtet und spaltet die DNA-Oligonukleotide. Die Oligonukleotide werden mikroaspiriert und innerhalb jedes ROI gezählt, wobei das entsprechende Protein auf räumlicher Basis quantifiziert wird.

Abbildung 4 zeigt die repräsentativen Ergebnisse eines DSP-Experiments, das an Proben von Glioblastomen durchgeführt wurde. Es wird eine Heatmap vorgestellt, die eine der Methoden zur visuellen Erfassung von Daten mit der DSP-Software veranschaulicht. Zeilen stellen Proteinziele dar, und jede Spalte entspricht einer Region von Interesse. Ein Farbbereich von Blau bis Rot bedeutet einen niedrigen bzw. hohen Ausdruck. Die Variabilität der Farbe innerhalb einer Reihe spiegelt die regionale Pr...

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Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Proteomische Dysregulation spielt eine wichtige Rolle bei der Ausbreitung diffus infiltrierender Gliome, aber mehrere relevante Proteine bleiben unidentifiziert. Digital Spatial Processing (DSP) bietet einen effizienten Hochdurchsatzansatz zur Charakterisierung der differentiellen Expression von Kandidatenproteinen, die zur Invasion und Migration infiltrativer Gliome beitragen können.

Digitales räumliches Profiling zur Charakterisierung der Mikroumgebung bei diffus infiltrierenden Gliomen im Erwachsenentyp

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

Digital Spatial Profiling, kurz DSP, bietet eine effiziente Methode zur räumlich geschichteten Proteinquantifizierung. Seine Implementierung ermöglicht es uns, die Proteinexpression über verschiedene Regionen eines Tumors und die Mikroumgebung hinweg zu charakterisieren. Ein wesentliches Merkmal von DSP ist seine Multiplexing-Fähigkeit, die eine Datenverarbeitung mit hohem Durchsatz ermöglicht.Die Möglichkeit, benutzerdefinierte Regionen von Interesse zu definieren, bietet der Datenanalyse zusätzlich eine räumliche Dimension. DSP kann auf jede Probe angewendet werden, in der die räumliche Quantifizierung von Protein- oder RNA-Expression helfen kann, einen pathologischen oder physiologischen Prozess aufzuklären. Dies ist besonders relevant in der Onkologie, wo die regionale Zielvariabilität mit malignem Wachstum oder Invasion korrelieren kann.Das Verfahren wird von Scott Palisoul, einem Histotechnologen, und Rachael Barney, einer genomischen Technologin, demonstriert. Um Objektträger vorzubereiten, nehmen Sie zunächst mehrere Zwei-Millimeter-Kerne aus jeder Biopsie und legen sie in einen einzelnen Gewebe-Microarray-Block. Schneiden Sie vier Mikrometer Abschnitte aus dem Block und montieren Sie sie auf Glasobjektträgern.Legen Sie jeden Objektträger in die Schlittenhalterdichtung und inkubieren Sie ihn 30 Minuten lang bei 60 Grad Celsius. Im halbautomatischen IHC-System den Behälter in Position eins mit 150 Mikrolitern Waschpuffer pro Objektträger plus fünf Milliliter Totvolumen befüllen und den Deckel offen lassen. Füllen Sie die gleiche Menge der Blockierlösung in den Behälter an Position zwei.Legen Sie den Reagenzienbehälterträger auf die Maschine. Wählen Sie im Dropdownfeld des Felds Marker die Option IHC verarbeiten aus, gefolgt von dem Namen der Lösung blockieren. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie für alle Folien auf Schließen.Klicken Sie dann auf Etiketten drucken, aktivieren Sie Alle noch nicht gedruckten Folienetiketten und klicken Sie auf Drucken. Kleben Sie Beschriftungen oben auf den Folien. Legen Sie die Objektträger auf das Objektträgerfach und stellen Sie sicher, dass die Proben- und Etikettenseite nach oben gerichtet ist.Drücken Sie die LED-Taste, um das Fach abzusenken, und lassen Sie das Gerät mit dem Scannen und Erkennen von Dias beginnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um das Experiment zu starten. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, drücken Sie die LED-Taste, wenn sie grün blinkt.Entfernen Sie das Fach aus dem Instrument, und heben Sie die Abdeckplatten vorsichtig von jedem Objektträger ab. Legen Sie die Objektträger in die 1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Entfernen Sie überschüssigen Puffer und umreißen Sie jeden Gewebeabschnitt mit einem hydrophoben Stift, um eine hydrophobe Barriere zu schaffen.Stellen Sie eine Antikörper-PC-Oligo-Lösung her, indem Sie acht Mikroliter jedes Antikörpers pro Objektträger hinzufügen und Buffer W verwenden, um ein Endvolumen von 200 Mikrolitern zu erreichen. Dann die Antikörper-PC-Oligo-Lösung auf die Objektträger auftragen und die Objektträger über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation legen Sie die Objektträger in eine befeuchtete Schale und waschen Sie sie dreimal für 10 Minuten in 1X TBST.Nachfixieren in 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von zweimaligem Waschen für fünf Minuten in 1X TBST. Fügen Sie SYTO 13 Kernfärbung für 15 Minuten bei Raumtemperatur hinzu, gefolgt von zweimaligem Waschen mit 1X TBST. Bewegen Sie den Mauszeiger über die Datenerfassung im Kontrollzentrum, und wählen Sie Neu oder Ausführen fortsetzen.Legen Sie das Dia in den Diahalter mit dem Etikett in Richtung des Benutzers. Senken Sie die Klemme des Objektträgerfachs ab, um sicherzustellen, dass das Gewebe im länglichen Fenster sichtbar ist. Fügen Sie sechs Milliliter Puffer S hinzu.Folgen Sie den Anweisungen im Control Center.Zoomen Sie mit den x- und y-Schiebereglern zwischen verschiedenen Achsen, um einen Bereich zum Scannen abzugrenzen. Wählen Sie Scannen und lassen Sie den Scan fortfahren, bis der gesamte definierte Zielbereich abgebildet wurde. Erzeugen Sie ein 20-faches Bild.Definieren Sie die ROIs, indem Sie drei gleich große kreisförmige ROIs mit einem Durchmesser von 250 Mikrometern für jeden Gewebekern auswählen. Genehmigen Sie die ROIs, indem Sie auf die Schaltfläche Scan-Arbeitsbereich beenden klicken. Warten Sie dann, bis das UV-Licht die Oligos von den Antikörpern trennt.Wählen Sie nach Abschluss des Reinigungsgerätevorgangs Neue Datensammlung aus, um mit den aktuellen Objektträgern oder der aktuellen Platte fortzufahren. Öffnen Sie das fertige Plattenfenster, indem Sie auf den Plattensymbolbereich doppelklicken. Geben Sie die Chargennummer des Hybridisierungscodepakets ein und klicken Sie auf Aktualisieren.Klicken Sie dann auf Abschließen. Trennen Sie den Diahalter und die Sammelplatte, indem Sie den Anweisungen folgen. Bewahren Sie die Objektträger in TBST auf oder decken Sie sie mit einem wässrigen Medium und einem Deckbeleg für die Langzeitlagerung ab.Versiegeln Sie die Platten mit einer durchlässigen Dichtung und trocknen Sie die Aspirate bei 65 Grad Celsius in einem Thermocycler mit geöffnetem Oberteil. Fügen Sie sieben Mikroliter mit Diethylpyrocarbonat behandeltes Wasser hinzu und mischen Sie. Bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubieren und dann schnell herunterdrehen.Bereiten Sie die Sondenpuffermischung vor, indem Sie die entsprechenden Gleichungen für die Sonde R und die Sonde U auswählen, wobei die Gleichung wie im Textprotokoll beschrieben angewendet wird. Fügen Sie jedem Hybridisierungscodepaket 84 Mikroliter Sondenpuffermischung hinzu. In einer frischen 96-Well-Hybridisierungsplatte fügen Sie acht Mikroliter jeder Hybridisierungscode-Mastermischung in alle 12 Vertiefungen der angegebenen Reihe hinzu.Sieben Mikroliter von der DSP-Sammelplatte in die entsprechende Vertiefung in der Hybridisierungsplatte überführen. Heißsiegeln, die Platte schleudern und über Nacht bei 67 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Platte auf Eis abkühlen lassen und eine schnelle Drehung durchführen.Bündeln Sie die Hybridisierungsprodukte aus jedem Bohrloch in einem Streifenrohr und pipettieren Sie jedes Loch vorsichtig fünfmal. Drehen Sie die Bandrohre herunter und laden Sie sie in das Analysesystem. Speichern Sie die CDF-Datei auf dem DSP-Gerät auf einem USB-Laufwerk und übertragen Sie die Daten an den digitalen Analysator.Drücken Sie auf dem Bildschirm auf Verarbeitung starten. Wählen Sie High Sensitivity (Hohe Empfindlichkeit) und dann Next (Weiter). Klicken Sie auf Alle auswählen, um die Anzahl der Bohrlöcher mit Proben anzuzeigen, dann auf Fertig stellen, gefolgt von Weiter in der E-Mail-Benachrichtigung.Klicken Sie dann auf Start. Sobald die Vorbereitungsstation fertig ist, versiegeln Sie die Kartusche und übertragen Sie sie auf den digitalen Analysator. Drücken Sie Zählen starten.Wählen Sie Bühnenposition. Klicken Sie auf Vorhandene CDF-Datei laden und wählen Sie die zuvor hochgeladene Datei aus. Drücken Sie Fertig.Wählen Sie erneut Bühnenposition, drücken Sie Fertig, und starten Sie dann, um das Programm auszuführen. Speichern Sie die ZIP-Datei der Reporterzählerkonvertierungsdateien aus dem Analysesystem auf einem USB-Laufwerk. Setzen Sie das Laufwerk in den DSP-Computer ein.Bewegen Sie den Mauszeiger im DSP-Kontrollzentrum über Datenerfassung und klicken Sie dann auf Konten hochladen. Wählen Sie die entsprechende ZIP-Datei aus. Klicken Sie im DSP Control Center auf Records.Um Scans in der Warteschlange anzuzeigen, wählen Sie Ausgewählte Scans zur Warteschlange hinzufügen und dann Meine Analysewarteschlange. Wählen Sie Neue Studie aus Warteschlange aus, indem Sie den Mauszeiger über die Option Datenanalyse im Kontrollzentrum bewegen. Das DSP-Experiment wurde an Proben von Glioblastomen durchgeführt und die Ergebnisse wurden als Heatmap visualisiert.Zeilen stellen Proteinziele dar, und jede Spalte entspricht einer Region von Interesse. Die Ausdrucksebene wird durch einen Farbbereich dargestellt, der von Blau mit niedrigem Ausdruck bis Rot variiert, was einen hohen Ausdruck bedeutet. Die Variabilität der Farbe innerhalb einer Reihe spiegelt die regionale Proteinheterogenität wider und deutet auf eine mögliche räumliche Assoziation mit differentieller Proteinexpression hin.In diesem Experiment waren S100 und CD-56 universell hoch, weil sie neuronale Marker sind. Zu den Markern mit der größten Variabilität gehören B7-H3, KI-67, CD-44 und Fibronektin, von denen bekannt ist, dass sie mit Tumorproliferation, Migration und Metastasierung assoziiert sind. Aus einer Vielzahl von Kandidatenzielen kann DSP diejenigen identifizieren, die signifikante regionale Unterschiede aufweisen.Dies legt die Grundlage für die Untersuchung von Faktoren, die mit Variabilität und ihrer Relevanz für Krankheiten verbunden sind.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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