Name: digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma
Uploaded: 2022-09-13T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma at JoVE.com

המחברים מודים על תמיכת המעבדה לגנומיקה קלינית וטכנולוגיה מתקדמת במחלקה לפתולוגיה ורפואה מעבדתית של מערכת הבריאות של דארטמות' היצ'קוק. המחברים גם מכירים במשאב המשותף לפתולוגיה במרכז הסרטן של דארטמות' עם מענק תמיכה של מרכז הסרטן של NCI 5P30 CA023108-37.

הפרוטוקול המפורט להלן תואם את ההנחיות של ועדת האתיקה למחקר אנושי של דארטמות'-היצ'קוק. הסכמה מדעת התקבלה מהמטופלים שדגימות הרקמה שלהם נכללו במחקר זה. עיין בסעיף טבלת חומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים, הציוד והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הכנת ש?...

<ol>
	<li>Pedersen, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+patterns+of+lac-z+transfected+human+glioma+cells+in+the+rat+brain.">Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain.</a> International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).</li><li>Iwadate, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+in+glioblastoma+progression.">Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression.</a> Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).</li><li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+and+prognosis+analysis+of+epithelial-mesenchymal+transition+in+glioma.">Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Barthel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+molecular+signature+and+crossroads+with+tumor+microenvironment.">Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).</li><li>Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-apoptosis+mechanisms+in+malignant+gliomas.">Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).</li><li>Berghoff, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death+ligand+1+expression+and+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+glioblastoma.">Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).</li><li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue.">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li><li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling.">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li><li>Garcia-Pardo, M., Calles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-1+NSCLC+therapy+resistance+mechanism.">ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism.</a> Precision Cancer Medicine. , (2021).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+spatial+profiling+of+individual+glomeruli+from+patients+with+anti-neutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+glomerulonephritis.">Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).</li><li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+GeoMx+digital+spatial+profiler.">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456 (2021).</li><li>Brady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-+and+intra-tumor+heterogeneity+of+metastatic+prostate+cancer+determined+by+digital+spatial+gene+expression+profiling.">Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling.</a> Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).</li><li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+digital+spatial+profiling+of+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+patients.">Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients.</a> Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).</li><li>Wang, D. Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study:+Digital+spatial+profiling+of+metastatic+clear+cell+carcinoma+reveals+intra-tumor+heterogeneity+in+epithelial-mesenchymal+gradient.">Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>GeoMx DSP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+slide+preparation+user+manual.">Automated slide preparation user manual.</a> GeoMx DSP. , (2022).</li><li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).</li><li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoadjuvant+versus+adjuvant+ipilimumab+plus+nivolumab+in+macroscopic+stage+III+melanoma.">Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).</li><li>Matthews, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-enriched+hyaluronan+binding+(BEHAB)/brevican+cleavage+in+a+glioma+cell+line+is+mediated+by+a+disintegrin+and+metalloproteinase+with+thrombospondin+motifs+(ADAMTS)+family+member.">Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).</li><li>Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+infiltration+into+central+nervous+system+tissue+in+vitro:+involvement+of+a+metalloprotease.">Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease.</a> Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).</li><li>Beli&#235;n, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-type+1+matrix+metalloprotease+(MT1-MMP)+enables+invasive+migration+of+glioma+cells+in+central+nervous+system+white+matter.">Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter.</a> Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).</li><li>Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+antigens+recognized+by+T+lymphocytes:+At+the+core+of+cancer+immunotherapy.">Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).</li><li>Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+for+cancer+prevention:+a+practical+and+feasible+approach+to+the+cancer+epidemic.">Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Chen, L., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-PD-1/PD-L1+therapy+of+human+cancer:+past,+present,+and+future.">Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-Associated+stromal+cells+stimulate+glioma+malignancy+by+regulating+the+tumor+immune+microenvironment.">Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).</li><li>Ishii, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+characterization+of+the+tumorigenic+&amp;#34;peri-necrotic+niche&amp;#34;+harboring+quiescent+stem-like+tumor+cells+in+glioblastoma.">Histological characterization of the tumorigenic &amp;#34;peri-necrotic niche&amp;#34; harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma.</a> PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).</li><li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments.">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).</li><li>NanoString. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CosMx+Spatial+Molecular+Imager:+True+Single-Cell+In+Situ+Solution.">CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution.</a> NanoString. , (2022).</li></ol>

בהתחשב במגוון החלבונים שעשויים להשפיע על האגרסיביות של גליומות והרעיון שכמה מהחלבונים האלה עדיין לא התגלו, שיטת כימות חלבונים בתפוקה גבוהה היא גישה טכנולוגית אידיאלית. בנוסף, בהתחשב בכך שנתונים מרחביים בדגימות אונקולוגיות מתואמים לעתים קרובות עם ביטוי דיפרנציאלי18, שילוב פ?...

גליומות מסתננות מפוזרות הן הסוג הנפוץ ביותר של גידול מוח ממאיר במבוגרים והן תמיד קטלניות. הנטייה של תאי גליומה לנדוד באופן נרחב במוח היא אתגר טיפולי גדול. המנגנון שבאמצעותו הם מתפשטים כרוך בהגירה מכוונת ובפלישה לא מבוקרת. תאי גליומה פולשניים הוכחו כמפגינים טרופיזם והגירה לאורך דרכי החומר הלבן1, כאשר מחקרים אחרונים מצביעים על דה-מיאלינציה של דרכי אלה כתכונה פעילה ופרוטומוריגנית2. הפלישה מתווכת על ידי מעבר אפיתליאלי למזנכימלי, שבו תאי גליומה רוכשים תכונות מזנכימליות על ידי הפחתת הביטוי של גנים המקודדים חלבוני מטריצה חוץ-תאית ומולקולות הידבקות תאים, הגברת הנדידה והקלה על התפשטות דרך המיקרו-סביבה של הגידול 3,4,5.
ברמה המולקולרית, הודגם שיבוש של מספר חלבונים המעניקים יציבות תאית וממשק עם רכיבים אימונוגניים6. גליומות מסתננות ידועות כעוברות דיכוי של חלבונים בעלי תכונות אנטי-אפופטוטיות (למשל, PTEN)7. הם גם מבטאים יתר על המידה חלבונים המקדמים התחמקות מהתגובה החיסונית של המארח (למשל, PD1/PDL1)8. הדיסרגולציה של מסלולים מורכבים אלה משפרת את הגידוליות ומגדילה את הפוטנציאל הממאיר.
בדגימות של גליומה פולשנית, המטרה הייתה להעריך את הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים המפתח לגדילה, הישרדות ושגשוג של תאים, ולשלמות מבנית של מיקרו-סביבה בין מרכיבים פולשניים ולא פולשניים. בנוסף, ביקשנו לחקור את הוויסות הדיפרנציאלי של חלבונים בעלי תפקיד אימונוגני פעיל, ולהציע תובנה לגבי המנגנון שבאמצעותו הגנות חיסוניות של פונדקאי שנפגעות עשויות להגביר את הפוטנציאל השגשוג והפולשני של גליומות. זה רלוונטי במיוחד בהתחשב ברוחב המחקרים האחרונים המדגימים כיצד סמנים חיסוניים ומניעים של חוסר ויסות בממאירות יכולים לשמש כמטרות של אימונותרפיה. זיהוי מטרות טיפוליות ברות קיימא מבין החלבונים הרבים המעורבים במעקב חיסוני ובתגובתיות דורש גישה רגישה ומקיפה ביותר.
בהתחשב במגוון הרחב של חלבונים מועמדים שניתן לחקור, חיפשנו שיטה הדומה לאימונוהיסטוכימיה אך עם יעילות עיבוד נתונים משופרת. בתחום הביולוגיה של הסרטן, DSP התפתחה כטכנולוגיה רבת עוצמה עם יתרונות חשובים על פני כלים חלופיים לניתוח וכימות פרוטאומי. סימן ההיכר של DSP הוא יכולת הריבוב שלו בתפוקה גבוהה, המאפשרת מחקר סימולטני של מספר חלבונים שונים בתוך דגימה, מה שמסמן הבדל חשוב מטכנולוגיות סטנדרטיות אך בעלות פלקס נמוך יותר כגון אימונוהיסטוכימיה (IHC)9,10. תכונת המולטיפלקס של DSP אינה פוגעת בנאמנותו ככלי כמותי ואנליטי, כפי שמודגם על ידי מחקרים המשווים את DSP ל- IHC. כאשר משתמשים בו לכימות פרוטאומי של דגימות סרטן ריאה של תאים לא קטנים, למשל, הוכח כי DSP משיג תוצאות דומות ל-IHC11. בנוסף, DSP מציעה מפרט אזורי הניתן להתאמה אישית, שבו משתמשים יכולים להגדיר באופן ידני אזורים שבתוכם ניתן לבצע ניתוח פרוטאומי. זה מציג יתרון על פני שיטות מולטיפלקס של מקטע שלם10,12. בסבב אחד של עיבוד, DSP מציעה אפוא שכבות מרובות של ניתוח על ידי סקר מספר מטרות חלבון על פני אזורי עניין מרובים.
DSP יש יישומים במספר הגדרות פתולוגיות שונות. DSP הוא יתרון במיוחד בניתוח אונקולוגי, שכן שונות מרחבית יכולה להיות בקורלציה עם טרנספורמציה תאית וביטוי חלבונים דיפרנציאליים. לדוגמה, DSP שימש להשוואת הפרופיל הפרוטאומי של סרטן השד למיקרו-סביבה של הגידול הסמוך. לכך השלכות חשובות על הבנת ההיסטוריה הטבעית של גידול זה והתקדמותו, כמו גם על התגובה הפוטנציאלית לטיפול13. הקשרים נוספים הממחישים את הרבגוניות של DSP כוללים כימות מרחבי של מגוון החלבונים בסרטן הערמונית14, קשר של ביטוי סמן תאי חיסון עם התקדמות המחלה בקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר15, והדגמה של שיפוע אפיתל-מזנכימלי של ביטוי חלבונים המבחין בין סרטן שחלות גרורתי לסרטן שחלות ראשוני צלול16 . על ידי יישום DSP, אנו מאפיינים את הטופוגרפיה המרחבית של חלבונים שיכולים להשפיע על גידולים ופלישה של גליומות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BOND Research Detection System</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DS9455</td>
			<td>Open detection system containing open containers in a reagent tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Wash</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>AR950</td>
			<td>10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer W</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 conjugation kit</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>AB188287</td>
			<td>Cy3 fluorescent antibody conjugation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>System for imaging and characterizing protein and RNA targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx DSP Instrument BufferKit</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100471</td>
			<td>Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Hyb Code Pack_Protein</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300401</td>
			<td>Controls for running GeoMX DSP experiemtns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300101</td>
			<td>Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300105</td>
			<td>Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Protein Slide Prep FFPE</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300308</td>
			<td>Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDH1-R132H antibody</td>
			<td>Dianova, Hamburg, Germany</td>
			<td>DIA-H09</td>
			<td>Monoclonal antibody against human IDH1 R132H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Bond RX</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Fully automated IHC stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Kit--12 reactions</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100052</td>
			<td>Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCounter Analysis System</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Master II</td>
			<td>3DHistech Ltd., Budapest, Hungary</td>
			<td></td>
			<td>To create the tissue microarray block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma

גליומות מסתננות באופן מפוזר קשורות לתחלואה ותמותה גבוהות בשל האופי המסתנן של התפשטות הגידול. הם גידולים מורכבים מבחינה מורפולוגית, עם רמה גבוהה של שונות פרוטאומית הן על פני הגידול עצמו והן על פני המיקרו-סביבה ההטרוגנית שלו. הפוטנציאל הממאיר של גידולים אלה מועצם על ידי דיסרגולציה של חלבונים המעורבים במספר מסלולים מרכזיים, כולל תהליכים השומרים על יציבות התאים ושומרים על השלמות המבנית של המיקרו-סביבה. אף על פי שהיו מספר רב של ניתוחי גליומה בתפזורת וחד-תאית, יש מיעוט יחסי של ריבוד מרחבי של נתונים פרוטאומיים אלה. הבנת ההבדלים בהתפלגות המרחבית של גורמי הגידול ואוכלוסיות תאי מערכת החיסון בין הגידול הפנימי, הקצה הפולשני והמיקרו-סביבה מציעה תובנה רבת ערך לגבי המנגנונים העומדים בבסיס התפשטות והתפשטות הגידול. פרופיל מרחבי דיגיטלי (DSP) מייצג טכנולוגיה רבת-עוצמה שיכולה להוות את הבסיס לניתוחים רב-שכבתיים חשובים אלה.
DSP היא שיטה המכמתת ביעילות ביטוי חלבונים בתוך אזורים מרחביים שצוינו על ידי המשתמש בדגימת רקמה. DSP אידיאלי לחקר הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים מרובים בתוך ובין אזורי הבחנה, ומאפשר רמות מרובות של ניתוח כמותי ואיכותי. פרוטוקול DSP הוא שיטתי וידידותי למשתמש, ומאפשר ניתוח מרחבי מותאם אישית של נתונים פרוטאומיים. בניסוי זה, מיקרו-מערכים של רקמות בנויים מביופסיות ליבה של גליובלסטומה בארכיון. לאחר מכן, נבחר פאנל של נוגדנים, המכוונים לחלבונים בעלי עניין בתוך הדגימה. הנוגדנים, אשר מצומדים מראש לאוליגונוקלאוטידים של דנ"א הניתנים לפוטו-קלאוטידים, מודגרים לאחר מכן עם דגימת הרקמה למשך הלילה. תחת הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית של הנוגדנים, אזורי עניין (ROIs) שבתוכם ניתן לכמת את ביטוי החלבון מוגדרים עם הדגימות. לאחר מכן, אור UV מופנה לכל החזר על ההשקעה, ומבקע את האוליגונוקלאוטידים של הדנ"א. האוליגונוקלאוטידים עוברים מיקרו-אספירציה ונספרים בתוך כל החזר השקעה, מה שמכמת את החלבון המתאים על בסיס מרחבי.

איור 4 מציג את התוצאות המייצגות מניסוי DSP שבוצע על דגימות של גליובלסטומה. מוצגת מפת חום, הממחישה את אחת השיטות שבאמצעותן ניתן ללכוד נתונים באופן חזותי באמצעות תוכנת DSP. שורות מייצגות מטרות חלבון, וכל עמודה מתאימה לאזור עניין. טווח צבעים של כחול עד אדום מציין הבעה נמוכה עד גבו...

Watch this Scientific Journal Video about Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma at JoVE.com

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

דיסרגולציה פרוטאומית ממלאת תפקיד חשוב בהתפשטות של גליומות המסתננות באופן מפוזר, אך מספר חלבונים רלוונטיים נותרו בלתי מזוהים. עיבוד מרחבי דיגיטלי (DSP) מציע גישה יעילה בעלת תפוקה גבוהה לאפיון הביטוי הדיפרנציאלי של חלבונים מועמדים שעשויים לתרום לפלישה ולנדידה של גליומות מסתננות.

פרופיל מרחבי דיגיטלי לאפיון המיקרו-סביבה בגליומה מסוג בוגר המסתנן באופן מפוזר

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

פרופיל מרחבי דיגיטלי, או DSP, מציע שיטה יעילה לכימות חלבונים מרובד מרחבית. יישומו מאפשר לנו לאפיין את ביטוי החלבון על פני אזורים שונים של הגידול והמיקרו-סביבה. תכונה מרכזית של DSP היא יכולת הריבוב שלו, המאפשרת עיבוד נתונים בתפוקה גבוהה.היכולת להגדיר אזורי עניין מותאמים אישית מספקת בנוסף ממד מרחבי לניתוח נתונים. DSP יכול להיות מיושם על כל דגימה שבה כימות מרחבי חלבון, או ביטוי RNA עשוי לעזור להבהיר תהליך פתולוגי, או פיזיולוגי. זה רלוונטי במיוחד באונקולוגיה, שם השתנות היעד האזורית עשויה להיות מתואמת עם צמיחה ממאירה, או פלישה.המדגימים את ההליך יהיו סקוט פליסול, היסטוטכנולוגית, ורייצ'ל בארני, טכנולוגית גנומית. כדי להכין שקופיות, התחל על ידי לקיחת כמה ליבות של שני מילימטרים מכל ביופסיה, והכנסתן לבלוק מיקרו-מערך רקמתי יחיד. חותכים חלקים של ארבעה מיקרון מהבלוק, ומרכיבים אותם על מגלשות זכוכית.הניחו כל שקופית בתוך אטם מחזיק השקופיות, ודגרו אותו בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. במערכת IHC האוטומטית למחצה, מלא את המיכל במצב אחד עם 150 מיקרוליטר של מאגר כביסה לכל שקופית, בתוספת חמישה מיליליטר של נפח מת, והשאר את המכסה פתוח. מלא את אותה כמות של תמיסת חסימה במיכל במצב שתיים.טען את מגש מיכל הריאגנטים על המכשיר. בחר את תהליך IHC, ולאחר מכן חסום את שם הפתרון בתיבה הנפתחת של השדה סמן. לאחר שתסיים עבור כל השקופיות, לחץ על סגור.לאחר מכן לחץ על הדפס תוויות, סמן את כל תוויות השקופיות שעדיין לא הודפסו, ולחץ על הדפס. הדבק תוויות לחלק העליון של השקופיות. טען את השקופיות על מגש השקופיות, כדי להבטיח את פני הדגימה והתווית כלפי מעלה.לחץ על לחצן ה-LED כדי להנמיך את המגש, ואפשר למכשיר להתחיל בסריקה ובזיהוי של שקופיות. לחץ על כפתור התחל כדי להתחיל את הניסוי. בסיום הריצה, לחץ על לחצן ה-LED כאשר הוא מהבהב בירוק.הסר את המגש מהמכשיר והרם בזהירות את אריחי הכיסוי מכל שקופית. מקמו את השקופיות במי מלח עם אגירת פוספט 1X. הסר את המאגר העודף, והתווה כל מקטע רקמה בעט הידרופובי כדי ליצור מחסום הידרופובי.צור תמיסת אוליגו PC נוגדנים על ידי הוספת שמונה מיקרוליטרים מכל נוגדן לכל שקופית ושימוש ב- Buffer W כדי להגיע לנפח סופי של 200 מיקרוליטר. לאחר מכן החל את תמיסת אוליגו PC נוגדנים על השקופיות ודגירה של המגלשות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הניחו את המגלשות במגש לח, ושטפו שלוש דקות במשך 10 דקות ב-1X TBST.לאחר תיקון ב-4% פרפורמלדהיד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן יש לשטוף פעמיים במשך חמש דקות ב-1X TBST. יש להוסיף כתם גרעיני SYTO 13 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם 1X TBST. רחף עם העכבר מעל איסוף נתונים במרכז הבקרה ובחר חדש, או המשך הפעלה.מקם את השקופית במחזיק השקופיות עם התווית לכיוון המשתמש. הנמיכו את מהדק מגש ההחלקות, וודאו שהרקמה נראית בחלון המוארך. הוסף שישה מיליליטר של Buffer S.בצע את ההנחיות במרכז הבקרה.התקרב בין צירים שונים באמצעות המחוונים x ו- y כדי לתחום אזור לסריקה. בחרו 'סרוק', ואפשרו לסריקה להמשיך עד שכל אזור היעד שהוגדר צולם. צור תמונה של 20 פעמים.הגדר את ה- ROIs על-ידי בחירת שלושה ROIs עגולים בגודל שווה בקוטר של 250 מיקרומטר עבור כל ליבת רקמה. אשר את ה- ROIs על-ידי לחיצה על לחצן יציאה מסביבת עבודה של סריקה. לאחר מכן המתן לאור ה- UV כדי לבקע את האוליגוס מהנוגדנים.לאחר השלמת תהליך מכשיר הניקוי, בחר איסוף נתונים חדשים כדי להמשיך עם השקופיות או הלוח הנוכחיים. פתח את חלון הלוח הסופי על ידי לחיצה כפולה על אזור סמל הלוחית. הזן את מספר הלוט של חבילת קוד ההיברידיות ולחץ על עדכן.לאחר מכן לחץ על סיום. נתק את מחזיק השקופיות ואת לוח האיסוף על-ידי ביצוע ההנחיות. אחסן את השקופיות ב- TBST, או כסה אותן במדיום מימי והחלקת כיסוי לאחסון לטווח ארוך.אטמו את הצלחות באמצעות חותם חדיר וייבשו את השואפות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס במתקן תרמי כשהחלק העליון פתוח. מוסיפים שבעה מיקרוליטרים של מים מטופלים בדיתיל פירוקרבונט ומערבבים. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולאחר מכן הסתחררו במהירות.הכן את תערובת מאגר הבדיקה על-ידי בחירת משוואות הבדיקה R ו- Probe U המתאימות המיישמות את המשוואה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף 84 מיקרוליטרים של תערובת מאגר בדיקה לכל חבילת קוד היברידיזציה. בלוח הכלאה רענן של 96 בארות, הוסף שמונה מיקרוליטרים של כל תערובת מאסטר של קוד הכלאה לכל 12 הבארות של השורה המצוינת.העבר שבעה מיקרוליטרים מצלחת האיסוף DSP לבאר המתאימה בלוח ההכלאה. אטמו את החום, סובבו את הצלחת ודגרו עליה למשך הלילה בחום של 67 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, מקררים את הצלחת על קרח, ומבצעים סיבוב מהיר.איחד את מוצרי ההכלאה מכל באר לתוך צינור רצועה, תוך ניפוח עדין של כל באר חמש פעמים. סובבו כלפי מטה, והעמיסו את צינורות הרצועה לתוך מערכת הניתוח. במכשיר DSP, שמור את קובץ ה- CDF בכונן USB והעבר את הנתונים למנתח הדיגיטלי.על המסך, לחץ על התחל עיבוד. בחר רגישות גבוהה ואחריה הבא. לחץ על בחר הכל עבור מספר הבארות עם דוגמאות, לאחר מכן על סיום, ולאחר מכן על הבא בהודעת הדואר האלקטרוני.לאחר מכן לחץ על התחל. לאחר סיום תחנת ההכנה, אטם את המחסנית והעבר אותה למנתח הדיגיטלי. לחץ על התחל לספור.בחר מיקום במה. הקש על טען קובץ CDF קיים ובחר קובץ שהועלה בעבר. לחץ על סיום.בחר/י שוב ״מיקום שלב״, לחץ/י על ״סיום״ ולאחר מכן על ״התחל״ כדי להפעיל את התוכנית. שמור את קובץ ה-ZIP של קובצי ההמרה של ספירת הכתבים ממערכת הניתוח לכונן USB. הכנס את הכונן למחשב DSP.במרכז הבקרה של DSP, רחף מעל איסוף נתונים ולאחר מכן לחץ על העלה חשבונות. בחר את קובץ ה-ZIP הרלוונטי. לחץ על רשומות במרכז הבקרה של DSP.כדי להציג סריקות בתור, בחר הוסף סריקות נבחרות לתור ולאחר מכן את תור הניתוח שלי. בחר מחקר חדש מהתור על-ידי ריחוף מעל האפשרות ניתוח נתונים במרכז הבקרה. ניסוי DSP בוצע על דגימות של גליובלסטומה, והתוצאות הודגמו כמפת חום.שורות מייצגות מטרות חלבון, וכל עמודה מתאימה לאזור עניין. רמת הביטוי מתוארת על-ידי טווח צבעים המשתנה מכחול, המציג הבעה נמוכה, לאדום, המציין ביטוי גבוה. השתנות הצבע בשורה משקפת הטרוגניות של חלבונים אזוריים, ומציעה קשר מרחבי אפשרי עם ביטוי חלבון דיפרנציאלי.בניסוי זה, S100 ו- CD-56 היו גבוהים באופן אוניברסלי, מכיוון שהם סמנים עצביים. סמנים עם השונות הרבה ביותר כוללים B7-H3, KI-67, CD-44 ופיברונקטין, אשר ידועים כקשורים להתפשטות גידולים, נדידה וגרורות. מתוך מגוון רחב של יעדים מועמדים, DSP יכול לזהות את אלה המציגים שונות אזורית משמעותית.זה מניח את היסודות לחקר גורמים הקשורים לשונות והרלוונטיות שלהם למחלות.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

פרוטוקול תרבית תאי ראפיד פוסט מורטם של Glioma Pontine המפוזר העצמותי (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

אין ויוו הערכת EPR pH, pO2, מצב חמצון-חיזור, ואת ריכוזים של פוספט גלוטתיון ב Microenvironment הגידול

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

הערכה של סמנים Glioma מאת אימונוהיסטוכימיה על תרבויות Neurosphere פרפין-מוטבע Glioma תלת-ממד

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

הדור של הלבלב אורתוטואט גידולים ואפיון Vivo Ex של תאים הסתננות של הגידול תא T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

ניתוח אוכלוסיית הצד בקווי תאים סרטניים מלאים

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

השתלת גידול להערכת הדינמיקה של תאי T המסתננים לגידולים CD8+ בעכברים

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

פרופיל מרחבי של ביטוי חלבונים ורנ"א ברקמות: גישה לכוונון עדין של מיקרו-דיסקציה וירטואלית

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

בדיקות אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים של גליומה מפושטת בקו האמצע בילדים

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

מיקרו-דיסקציה מתועשת, מונחית בינה מלאכותית בלייזר לניתוח פרוטאומי בקנה מידה זעיר של המיקרו-סביבה של הגידול

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

ניתוח תמונת ברקוד מרובה פרופיל חיסוני ואפיון מיפוי מרחבי באנליזה חד-תאית של דגימות רקמת פרפין

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...