Name: digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma
Uploaded: 2022-09-13T12:50:00
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Gli autori riconoscono il supporto del Laboratorio di genomica clinica e tecnologia avanzata nel Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio del Dartmouth Hitchcock Health System. Gli autori riconoscono anche la risorsa condivisa di patologia presso il Dartmouth Cancer Center con NCI Cancer Center Support Grant 5P30 CA023108-37.

Il protocollo descritto di seguito segue le linee guida del Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti i cui campioni di tessuto sono stati inclusi in questo studio. Vedere la sezione Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti, le apparecchiature e il software utilizzati in questo protocollo.
1. Preparazione della diapositiva17
<ol><li>Re...

<ol>
	<li>Pedersen, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+patterns+of+lac-z+transfected+human+glioma+cells+in+the+rat+brain.">Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain.</a> International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).</li><li>Iwadate, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+in+glioblastoma+progression.">Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression.</a> Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).</li><li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+and+prognosis+analysis+of+epithelial-mesenchymal+transition+in+glioma.">Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Barthel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+molecular+signature+and+crossroads+with+tumor+microenvironment.">Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).</li><li>Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-apoptosis+mechanisms+in+malignant+gliomas.">Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).</li><li>Berghoff, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death+ligand+1+expression+and+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+glioblastoma.">Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).</li><li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue.">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li><li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling.">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li><li>Garcia-Pardo, M., Calles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-1+NSCLC+therapy+resistance+mechanism.">ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism.</a> Precision Cancer Medicine. , (2021).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+spatial+profiling+of+individual+glomeruli+from+patients+with+anti-neutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+glomerulonephritis.">Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).</li><li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+GeoMx+digital+spatial+profiler.">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456 (2021).</li><li>Brady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-+and+intra-tumor+heterogeneity+of+metastatic+prostate+cancer+determined+by+digital+spatial+gene+expression+profiling.">Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling.</a> Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).</li><li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+digital+spatial+profiling+of+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+patients.">Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients.</a> Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).</li><li>Wang, D. Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study:+Digital+spatial+profiling+of+metastatic+clear+cell+carcinoma+reveals+intra-tumor+heterogeneity+in+epithelial-mesenchymal+gradient.">Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>GeoMx DSP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+slide+preparation+user+manual.">Automated slide preparation user manual.</a> GeoMx DSP. , (2022).</li><li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).</li><li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoadjuvant+versus+adjuvant+ipilimumab+plus+nivolumab+in+macroscopic+stage+III+melanoma.">Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).</li><li>Matthews, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-enriched+hyaluronan+binding+(BEHAB)/brevican+cleavage+in+a+glioma+cell+line+is+mediated+by+a+disintegrin+and+metalloproteinase+with+thrombospondin+motifs+(ADAMTS)+family+member.">Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).</li><li>Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+infiltration+into+central+nervous+system+tissue+in+vitro:+involvement+of+a+metalloprotease.">Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease.</a> Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).</li><li>Beli&#235;n, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-type+1+matrix+metalloprotease+(MT1-MMP)+enables+invasive+migration+of+glioma+cells+in+central+nervous+system+white+matter.">Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter.</a> Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).</li><li>Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+antigens+recognized+by+T+lymphocytes:+At+the+core+of+cancer+immunotherapy.">Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).</li><li>Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+for+cancer+prevention:+a+practical+and+feasible+approach+to+the+cancer+epidemic.">Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Chen, L., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-PD-1/PD-L1+therapy+of+human+cancer:+past,+present,+and+future.">Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-Associated+stromal+cells+stimulate+glioma+malignancy+by+regulating+the+tumor+immune+microenvironment.">Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).</li><li>Ishii, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+characterization+of+the+tumorigenic+&amp;#34;peri-necrotic+niche&amp;#34;+harboring+quiescent+stem-like+tumor+cells+in+glioblastoma.">Histological characterization of the tumorigenic &amp;#34;peri-necrotic niche&amp;#34; harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma.</a> PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).</li><li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments.">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).</li><li>NanoString. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CosMx+Spatial+Molecular+Imager:+True+Single-Cell+In+Situ+Solution.">CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution.</a> NanoString. , (2022).</li></ol>

Data la diversità delle proteine che potrebbero potenzialmente influenzare l'aggressività dei gliomi e l'idea che molte di queste proteine rimangono sconosciute, un metodo di quantificazione delle proteine ad alto rendimento è un approccio tecnologico ideale. Inoltre, dato che i dati spaziali nei campioni oncologici sono spesso correlati con l'espressione differenziale18, incorporare la profilazione spaziale nell'approccio di quantificazione delle proteine consente un'analisi più efficace....

I gliomi diffusamente infiltranti sono il tipo più comune di tumore cerebrale maligno negli adulti e sono invariabilmente letali. La propensione delle cellule di glioma a migrare ampiamente nel cervello è una grande sfida terapeutica. Il meccanismo con cui si diffondono comporta la migrazione diretta e l'invasione incontrollata. Le cellule di glioma invasive hanno dimostrato di esibire tropismo e migrazione lungo i tratti di sostanza bianca1, con recenti ricerche che implicano la demielinizzazione di questi tratti come una caratteristica protumorigenica attiva2. L'invasione è mediata da una transizione epiteliale-mesenchimale, in cui le cellule di glioma acquisiscono proprietà mesenchimali riducendo l'espressione di geni codificanti proteine della matrice extracellulare e molecole di adesione cellulare, amplificando la migrazione e facilitando la propagazione attraverso il microambiente tumorale 3,4,5.
A livello molecolare, è stata dimostrata la rottura di diverse proteine che conferiscono stabilità cellulare e interfaccia con componenti immunogenici6. È noto che i gliomi infiltrativi subiscono la soppressione di proteine con proprietà anti-apoptotiche (ad esempio, PTEN)7. Inoltre sovraesprimono proteine che promuovono l'evasione della risposta immunitaria dell'ospite (ad esempio, PD1 / PDL1)8. La disregolazione di queste vie complesse aumenta la tumorigenicità e aumenta il potenziale maligno.
All'interno di campioni di glioma invasivo, l'obiettivo era quello di valutare l'espressione differenziale di proteine chiave per la crescita, la sopravvivenza e la proliferazione cellulare e per l'integrità strutturale del microambiente tra componenti invasive e non invasive. Inoltre, abbiamo cercato di studiare la regolazione differenziale delle proteine con un ruolo immunogenico attivo, offrendo informazioni sul meccanismo attraverso il quale le difese immunitarie dell'ospite compromesso possono aumentare il potenziale proliferativo e invasivo dei gliomi. Ciò è particolarmente rilevante data la recente ampiezza della ricerca che dimostra come i marcatori immunitari e i driver della disregolazione nella malignità possano servire come bersagli dell'immunoterapia. L'identificazione di bersagli terapeutici praticabili tra le molte proteine coinvolte nell'immunosorveglianza e nella reattività richiede un approccio altamente sensibile e completo.
Data l'ampia gamma di proteine candidate che possono essere studiate, abbiamo cercato un metodo simile all'immunoistochimica ma con una maggiore efficienza di elaborazione dei dati. Nel campo della biologia del cancro, DSP è emersa come una potente tecnologia con importanti vantaggi rispetto agli strumenti alternativi per l'analisi proteomica e la quantificazione. Il segno distintivo del DSP è la sua capacità di multiplexing ad alto rendimento, che consente lo studio simultaneo di diverse proteine all'interno di un campione, segnando un'importante distinzione dalle tecnologie standard ma a basso plex come l'immunoistochimica (IHC)9,10. La caratteristica multiplex del DSP non ne compromette la fedeltà come strumento quantitativo e analitico, come dimostrato da studi che confrontano DSP e IHC. Quando viene utilizzato per la quantificazione proteomica di campioni di carcinoma polmonare non a piccole cellule, ad esempio, DSP ha dimostrato di avere risultati simili a IHC11. Inoltre, DSP offre specifiche regionali personalizzabili, in cui gli utenti possono definire manualmente le regioni all'interno delle quali eseguire l'analisi proteomica. Ciò presenta un vantaggio rispetto ai metodi multiplex a sezione intera10,12. In un unico ciclo di elaborazione, DSP offre quindi più livelli di analisi esaminando diversi bersagli proteici in più regioni di interesse.
DSP ha applicazioni in diversi contesti patologici. La DSP è particolarmente vantaggiosa nell'analisi oncologica, poiché la variazione spaziale può essere correlata alla trasformazione cellulare e all'espressione differenziale delle proteine. Ad esempio, DSP è stato utilizzato per confrontare il profilo proteomico del cancro al seno con il microambiente tumorale adiacente. Ciò comporta importanti implicazioni per la comprensione della storia naturale di questo tumore e della sua progressione, nonché della potenziale risposta al trattamento13. Ulteriori contesti che illustrano la versatilità della DSP includono la quantificazione spaziale della diversità proteica nel carcinoma prostatico14, l'associazione dell'espressione dei marcatori delle cellule immunitarie con la progressione della malattia nel carcinoma a cellule squamose della testa e del collo 15 e la dimostrazione di un gradiente epiteliale-mesenchimale dell'espressione proteica che distingue il carcinoma ovarico metastatico da quello primario a cellule chiare16 . Implementando la DSP, caratterizziamo la topografia spaziale delle proteine che potrebbero influenzare la tumorigenesi e l'invasione dei gliomi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BOND Research Detection System</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DS9455</td>
			<td>Open detection system containing open containers in a reagent tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Wash</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>AR950</td>
			<td>10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer W</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 conjugation kit</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>AB188287</td>
			<td>Cy3 fluorescent antibody conjugation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>System for imaging and characterizing protein and RNA targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx DSP Instrument BufferKit</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100471</td>
			<td>Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Hyb Code Pack_Protein</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300401</td>
			<td>Controls for running GeoMX DSP experiemtns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300101</td>
			<td>Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300105</td>
			<td>Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Protein Slide Prep FFPE</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300308</td>
			<td>Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDH1-R132H antibody</td>
			<td>Dianova, Hamburg, Germany</td>
			<td>DIA-H09</td>
			<td>Monoclonal antibody against human IDH1 R132H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Bond RX</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Fully automated IHC stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Kit--12 reactions</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100052</td>
			<td>Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCounter Analysis System</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Master II</td>
			<td>3DHistech Ltd., Budapest, Hungary</td>
			<td></td>
			<td>To create the tissue microarray block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma

I gliomi diffusamente infiltranti sono associati ad elevata morbilità e mortalità a causa della natura infiltrativa della diffusione del tumore. Sono tumori morfologicamente complessi, con un alto grado di variabilità proteomica sia nel tumore stesso che nel suo microambiente eterogeneo. Il potenziale maligno di questi tumori è potenziato dalla disregolazione delle proteine coinvolte in diversi percorsi chiave, compresi i processi che mantengono la stabilità cellulare e preservano l'integrità strutturale del microambiente. Sebbene ci siano state numerose analisi di glioma bulk e monocellulari, c'è una relativa scarsità di stratificazione spaziale di questi dati proteomici. La comprensione delle differenze nella distribuzione spaziale dei fattori tumorigenici e delle popolazioni di cellule immunitarie tra il tumore intrinseco, il bordo invasivo e il microambiente offre preziose informazioni sui meccanismi alla base della proliferazione e della propagazione del tumore. La profilazione spaziale digitale (DSP) rappresenta una potente tecnologia che può costituire la base per queste importanti analisi multistrato.
DSP è un metodo che quantifica in modo efficiente l'espressione proteica all'interno di regioni spaziali specificate dall'utente in un campione di tessuto. La DSP è ideale per studiare l'espressione differenziale di più proteine all'interno e tra le regioni di distinzione, consentendo più livelli di analisi quantitativa e qualitativa. Il protocollo DSP è sistematico e facile da usare, consentendo un'analisi spaziale personalizzata dei dati proteomici. In questo esperimento, i microarray tissutali sono costruiti da biopsie del nucleo di glioblastoma archiviate. Successivamente, viene selezionato un pannello di anticorpi, mirando alle proteine di interesse all'interno del campione. Gli anticorpi, che sono preconiugati a oligonucleotidi del DNA fotoscisvivi UV, vengono quindi incubati con il campione di tessuto durante la notte. Sotto la visualizzazione al microscopio a fluorescenza degli anticorpi, le regioni di interesse (ROI) all'interno delle quali quantificare l'espressione proteica sono definite con i campioni. La luce UV viene quindi diretta ad ogni ROI, fendendo gli oligonucleotidi del DNA. Gli oligonucleotidi sono microaspirati e contati all'interno di ciascun ROI, quantificando la proteina corrispondente su base spaziale.

La Figura 4 mostra i risultati rappresentativi di un esperimento DSP eseguito su campioni di glioblastoma. Viene presentata una mappa di calore, che illustra uno dei metodi con cui acquisire visivamente i dati utilizzando il software DSP. Le righe rappresentano i bersagli proteici e ogni colonna corrisponde a una regione di interesse. Una gamma di colori dal blu al rosso denota rispettivamente un'espressione da bassa ad alta. La variabilità del colore all'interno di una riga riflette l'eter...

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Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

La disregolazione proteomica svolge un ruolo importante nella diffusione dei gliomi diffusamente infiltranti, ma diverse proteine rilevanti rimangono non identificate. L'elaborazione spaziale digitale (DSP) offre un approccio efficiente e ad alto rendimento per caratterizzare l'espressione differenziale di proteine candidate che possono contribuire all'invasione e alla migrazione dei gliomi infiltrativi.

Profilazione spaziale digitale per la caratterizzazione del microambiente in gliomi diffusamente infiltranti di tipo adulto

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

Il Digital Spatial Profiling, o DSP, offre un metodo efficiente per la quantificazione delle proteine stratificate spazialmente. La sua implementazione ci consente di caratterizzare l'espressione proteica attraverso regioni distinte di un tumore e del microambiente. Una caratteristica chiave del DSP è la sua capacità di multiplexing, che consente l'elaborazione dei dati ad alto throughput.La capacità di definire regioni di interesse personalizzate fornisce inoltre una dimensione spaziale all'analisi dei dati. Il DSP può essere applicato a qualsiasi campione in cui la quantificazione spaziale della proteina o l'espressione dell'RNA possono aiutare a chiarire un processo patologico o fisiologico. Ciò è particolarmente rilevante in oncologia, dove la variabilità del target regionale può essere correlata alla crescita maligna o all'invasione.A dimostrare la procedura saranno Scott Palisoul, un istotecnologo, e Rachael Barney, un tecnologo genomico. Per preparare i vetrini, iniziare prendendo diversi nuclei di due millimetri da ogni biopsia e mettendoli in un singolo blocco di microarray tissutale. Tagliare sezioni da quattro micron dal blocco e montarle su vetrini.Posizionare ogni diapositiva all'interno della guarnizione del portaslitta e incubarla a 60 gradi Celsius per 30 minuti. Nel sistema IHC semiautomatico, riempire il contenitore nella posizione uno con 150 microlitri di tampone di lavaggio per vetrino, più cinque millilitri di volume morto, e lasciare il coperchio aperto. Riempire la stessa quantità di soluzione bloccante nel contenitore nella posizione due.Caricare il vassoio del contenitore del reagente sulla macchina. Selezionare Processo IHC, seguito da Blocco nome soluzione nella casella a discesa del campo Marcatore. Una volta terminato per tutte le diapositive, fare clic su Chiudi.Quindi fare clic su Stampa etichette e selezionare Tutte le etichette diapositiva non ancora stampate e fare clic su Stampa. Applicare etichette sulla parte superiore delle diapositive. Caricare le diapositive sul vassoio di scorrimento, assicurandosi che il campione e l'etichetta siano rivolti verso l'alto.Premere il pulsante LED per abbassare il vassoio e consentire allo strumento di iniziare la scansione e il riconoscimento delle diapositive. Fare clic sul pulsante Start per iniziare l'esperimento. Al termine della corsa, premere il pulsante LED quando lampeggia in verde.Rimuovere il vassoio dallo strumento e sollevare con attenzione le piastrelle di copertura da ogni vetrino. Posizionare i vetrini nella soluzione salina tamponata con fosfato 1X. Rimuovere il tampone in eccesso e delineare ogni sezione di tessuto con una penna idrofobica per creare una barriera idrofobica.Realizzare una soluzione oligo di anticorpi PC aggiungendo otto microlitri di ciascun anticorpo per vetrino e utilizzando Buffer W per raggiungere un volume finale di 200 microlitri. Quindi applicare la soluzione oligo di anticorpi PC ai vetrini e incubare i vetrini durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, posizionare i vetrini in un vassoio umidificato e lavare tre volte per 10 minuti in 1X TBST.Post-fix in paraformaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente, seguito da lavaggio due volte per cinque minuti in 1X TBST. Aggiungere la macchia nucleare SYTO 13 per 15 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare due volte con 1X TBST. Passare il mouse sulla raccolta dati nel Centro di controllo e selezionare Nuovo o Continua esecuzione.Posizionare la diapositiva nel portavetrini con l'etichetta rivolta verso l'utente. Abbassare il morsetto del vassoio di scorrimento, assicurandosi che il tessuto sia visibile nella finestra allungata. Aggiungere sei millilitri di Buffer S.Seguire le istruzioni nel Centro di controllo.Ingrandisci tra assi diversi con i cursori x e y per delineare un'area per la scansione. Selezionare Scansione e consentire l'esecuzione della scansione fino a quando non è stata creata l'immagine dell'intera area di destinazione definita. Genera un'immagine 20 volte.Definisci i ROI selezionando tre ROI circolari di uguali dimensioni di un diametro di 250 micrometri per ciascun nucleo di tessuto. Approvare i ROI facendo clic sul pulsante Esci dall'area di lavoro di scansione. Quindi attendere che la luce UV scindono gli oligo dagli anticorpi.Dopo aver completato il processo dello strumento di pulizia, selezionare Nuova raccolta dati per continuare con le diapositive o la piastra corrente. Aprire la finestra della piastra finalizzata facendo doppio clic sull'area dell'icona Piatto. Immettere il numero di lotto del codice di ibridazione e fare clic su Aggiorna.Quindi fare clic su Finalizza. Staccare il portavetrini e la piastra di raccolta seguendo le istruzioni. Conservare i vetrini in TBST o coprirli con un mezzo acquoso e un vetrino di copertura per la conservazione a lungo termine.Sigillare le piastre utilizzando una guarnizione permeabile e asciugare le aspirate a 65 gradi Celsius in un termociclatore con la parte superiore aperta. Aggiungere sette microlitri di acqua trattata con dietil pirocarbonato e mescolare. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi centrifugare rapidamente.Preparare la miscela tampone della sonda scegliendo le equazioni appropriate della sonda R e della sonda U applicando l'equazione come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere 84 microlitri di miscela tampone sonda a ciascun pacchetto di codici di ibridazione. In una nuova piastra di ibridazione a 96 pozzetti, aggiungere otto microlitri di ciascun master mix di codice di ibridazione in tutti i 12 pozzetti della fila indicata.Trasferire sette microlitri dalla piastra di raccolta DSP al pozzetto corrispondente nella piastra di ibridazione. Sigillare a caldo, girare la piastra e incubarla durante la notte a 67 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, raffreddare la piastra sul ghiaccio ed eseguire un rapido giro.Raggruppare i prodotti di ibridazione da ciascun pozzetto in un tubo a striscia, pipettando delicatamente ogni pozzetto cinque volte. Ruotare verso il basso e caricare i tubi a nastro nel sistema di analisi. Sullo strumento DSP, salvare il file CDF su un'unità USB e trasferire i dati all'analizzatore digitale.Sullo schermo, premere Avvia elaborazione. Selezionare Alta sensibilità seguita da Avanti. Premere Seleziona tutto per il numero di pozzi con campioni, quindi Fine, seguito da Avanti nella notifica e-mail.Quindi fare clic su Start. Una volta terminata la stazione di preparazione, sigillare la cartuccia e trasferirla all'analizzatore digitale. Premere Inizia conteggio.Selezionare Posizione stage. Premere Carica file CDF esistente e selezionare il file caricato in precedenza. Premere Fine.Selezionare nuovamente Posizione stage, premere Fine, quindi avviare per eseguire il programma. Salvare il file ZIP dei file di conversione del conteggio dei reporter dal sistema di analisi a un'unità USB. Inserire l'unità nella macchina DSP.Nel Centro di controllo DSP, passare il puntatore del mouse su Raccolta dati, quindi fare clic su Carica account. Selezionare il file ZIP pertinente. Fare clic su Record nel Centro di controllo DSP.Per visualizzare le scansioni nella coda, selezionare Aggiungi scansioni selezionate alla coda, quindi Coda di analisi personali. Selezionare Nuovo studio dalla coda passando il puntatore del mouse sull'opzione Analisi dati nel Centro di controllo. L'esperimento DSP è stato eseguito su campioni di glioblastoma e i risultati sono stati visualizzati come una mappa di calore.Le righe rappresentano i bersagli proteici e ogni colonna corrisponde a una regione di interesse. Il livello di espressione è rappresentato da una gamma di colori che varia dal blu, che mostra bassa espressione, al rosso, che denota un'espressione elevata. La variabilità del colore all'interno di una riga riflette l'eterogeneità proteica regionale e suggerisce una possibile associazione spaziale con l'espressione differenziale delle proteine.In questo esperimento, S100 e CD-56 erano universalmente alti, perché sono marcatori neurali. I marcatori con la maggiore variabilità includono B7-H3, KI-67, CD-44 e fibronectina, che sono noti per essere associati alla proliferazione, alla migrazione e alle metastasi del tumore. Da una vasta gamma di target candidati, DSP può identificare quelli che presentano variazioni regionali significative.Ciò pone le basi per studiare i fattori associati alla variabilità e la loro rilevanza per la malattia.

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