Name: digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma
Uploaded: 2022-09-13T12:50:00
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著者らは、ダートマスヒッチコックヘルスシステムの病理学および検査医学部門の臨床ゲノミクスおよび先端技術研究所の支援を認めています。著者らはまた、ダートマスがんセンターの病理学共有リソースとNCIがんセンターサポート助成金5P30 CA023108-37を認めています。

以下に概説するプロトコルは、ダートマス-ヒッチコック人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。インフォームドコンセントは、組織サンプルがこの研究に含まれた患者から得られました。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、機器、およびソフトウェアに関連する詳細については、「 材料の表 」セクションを参照してください。
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<ol>
	<li>Pedersen, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+patterns+of+lac-z+transfected+human+glioma+cells+in+the+rat+brain.">Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain.</a> International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).</li><li>Iwadate, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+in+glioblastoma+progression.">Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression.</a> Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).</li><li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+and+prognosis+analysis+of+epithelial-mesenchymal+transition+in+glioma.">Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Barthel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+molecular+signature+and+crossroads+with+tumor+microenvironment.">Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).</li><li>Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-apoptosis+mechanisms+in+malignant+gliomas.">Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).</li><li>Berghoff, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death+ligand+1+expression+and+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+glioblastoma.">Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).</li><li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue.">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li><li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling.">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li><li>Garcia-Pardo, M., Calles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-1+NSCLC+therapy+resistance+mechanism.">ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism.</a> Precision Cancer Medicine. , (2021).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+spatial+profiling+of+individual+glomeruli+from+patients+with+anti-neutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+glomerulonephritis.">Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).</li><li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+GeoMx+digital+spatial+profiler.">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456 (2021).</li><li>Brady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-+and+intra-tumor+heterogeneity+of+metastatic+prostate+cancer+determined+by+digital+spatial+gene+expression+profiling.">Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling.</a> Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).</li><li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+digital+spatial+profiling+of+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+patients.">Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients.</a> Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).</li><li>Wang, D. Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study:+Digital+spatial+profiling+of+metastatic+clear+cell+carcinoma+reveals+intra-tumor+heterogeneity+in+epithelial-mesenchymal+gradient.">Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>GeoMx DSP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+slide+preparation+user+manual.">Automated slide preparation user manual.</a> GeoMx DSP. , (2022).</li><li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).</li><li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoadjuvant+versus+adjuvant+ipilimumab+plus+nivolumab+in+macroscopic+stage+III+melanoma.">Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).</li><li>Matthews, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-enriched+hyaluronan+binding+(BEHAB)/brevican+cleavage+in+a+glioma+cell+line+is+mediated+by+a+disintegrin+and+metalloproteinase+with+thrombospondin+motifs+(ADAMTS)+family+member.">Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).</li><li>Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+infiltration+into+central+nervous+system+tissue+in+vitro:+involvement+of+a+metalloprotease.">Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease.</a> Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).</li><li>Beli&#235;n, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-type+1+matrix+metalloprotease+(MT1-MMP)+enables+invasive+migration+of+glioma+cells+in+central+nervous+system+white+matter.">Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter.</a> Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).</li><li>Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+antigens+recognized+by+T+lymphocytes:+At+the+core+of+cancer+immunotherapy.">Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).</li><li>Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+for+cancer+prevention:+a+practical+and+feasible+approach+to+the+cancer+epidemic.">Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Chen, L., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-PD-1/PD-L1+therapy+of+human+cancer:+past,+present,+and+future.">Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-Associated+stromal+cells+stimulate+glioma+malignancy+by+regulating+the+tumor+immune+microenvironment.">Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).</li><li>Ishii, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+characterization+of+the+tumorigenic+&amp;#34;peri-necrotic+niche&amp;#34;+harboring+quiescent+stem-like+tumor+cells+in+glioblastoma.">Histological characterization of the tumorigenic &amp;#34;peri-necrotic niche&amp;#34; harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma.</a> PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).</li><li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments.">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).</li><li>NanoString. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CosMx+Spatial+Molecular+Imager:+True+Single-Cell+In+Situ+Solution.">CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution.</a> NanoString. , (2022).</li></ol>

神経膠腫の攻撃性に影響を与える可能性のあるタンパク質の多様性と、これらのタンパク質のいくつかが未発見のままであるという考えを考えると、ハイスループットタンパク質定量法は理想的な技術的アプローチです。さらに、腫瘍学的サンプル中の空間データは示差的発現18と相関することが多いため、空間プロファイリングをタンパク質定量アプローチに組み込むこ?...

びまん性浸潤性神経膠腫は、成人の悪性脳腫瘍の最も一般的なタイプであり、常に致命的です。神経膠腫細胞が脳内で広範囲に移動する傾向は、主要な治療上の課題です。それらが広がるメカニズムには、指示された移動とチェックされていない侵入が含まれます。浸潤性グリオーマ細胞は、白質路に沿った向性と遊走を示すことが示されており1、最近の研究では、これらの管の脱髄が活性で腫瘍形成性の特徴として関与しています2。浸潤は上皮から間葉への移行によって媒介され、グリオーマ細胞は、細胞外マトリックスタンパク質および細胞接着分子をコードする遺伝子の発現を低下させ、遊走を増幅し、腫瘍微小環境を介した増殖を促進することによって間葉系特性を獲得する3,4,5。
分子レベルでは、細胞の安定性と免疫原性成分との界面を付与するいくつかのタンパク質の破壊が実証されています6。浸潤性神経膠腫は、抗アポトーシス性(PTENなど)特性を有するタンパク質の抑制を受けることが知られている7。また、宿主の免疫応答の回避を促進するタンパク質(PD1/PDL1など)を過剰発現しています8。これらの複雑な経路の調節不全は、腫瘍形成性を高め、悪性の可能性を高めます。
浸潤性神経膠腫のサンプル内で、目的は、細胞の成長、生存、増殖、および侵襲性成分と非侵襲性成分の間の微小環境構造的完全性に鍵となるタンパク質の発現差を評価することでした。さらに、能動的免疫原性の役割を持つタンパク質の異なる制御を研究し、宿主の免疫防御の損なわれが神経膠腫の増殖性および侵襲性の可能性を高めるメカニズムへの洞察を提供しようとしました。これは、悪性腫瘍の免疫マーカーと調節不全のドライバーが免疫療法の標的としてどのように役立つかを示す最近の幅広い研究を考えると、特に重要です。免疫監視と反応性に関与する多くのタンパク質の中から実行可能な治療標的を特定するには、高感度で包括的なアプローチが必要です。
研究可能な候補タンパク質が多岐にわたることから、免疫組織化学に類似し、データ処理効率を高めた方法を探しました。がん生物学の分野では、DSPはプロテオミクス解析と定量のための代替ツールよりも重要な利点を持つ強力な技術として浮上しています。DSPの特徴は、サンプル内の複数の異なるタンパク質を同時に研究できるハイスループットマルチプレックス機能であり、免疫組織化学(IHC)9,10などの標準的ではあるが低プレックス技術との重要な違いを示しています。DSPのマルチプレックス機能は、DSPとIHCを比較した研究で示されているように、定量的および分析ツールとしての忠実度を損なうことはありません。非小細胞肺癌標本のプロテオミクス定量に用いた場合、例えば、DSPはIHC11と同様の結果を有することが示されている。さらに、DSPはカスタマイズ可能な地域仕様を提供し、ユーザーはプロテオーム解析を実行する領域を手動で定義できます。これは、全セクション多重化方式10、12よりも有利である。したがって、DSPは、1回の処理で、複数の関心領域にわたる複数のタンパク質ターゲットを調査することにより、複数の分析層を提供します。
DSPは、いくつかの異なる病理学的設定でアプリケーションを持っています。DSPは、空間的変動が細胞形質転換および異なるタンパク質発現と相関する可能性があるため、腫瘍学的分析において特に有利です。例えば、DSPは、乳癌のプロテオミクスプロファイルを隣接する腫瘍微小環境と比較するために使用されている。これは、この腫瘍とその進行の自然史、および治療に対する潜在的な反応を理解する上で重要な意味を持ちます13。DSPの多様性を示す追加のコンテキストには、前立腺癌におけるタンパク質多様性の空間的定量化14、頭頸部扁平上皮癌における免疫細胞マーカー発現と疾患進行との関連15、および原発性明細胞卵巣癌から転移性を区別するタンパク質発現の上皮間葉系勾配の実証が含まれます16.DSPを実装することにより、腫瘍形成と神経膠腫の浸潤に影響を与える可能性のあるタンパク質の空間的トポグラフィーを特徴付けます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BOND Research Detection System</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DS9455</td>
			<td>Open detection system containing open containers in a reagent tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Wash</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>AR950</td>
			<td>10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer W</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 conjugation kit</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>AB188287</td>
			<td>Cy3 fluorescent antibody conjugation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>System for imaging and characterizing protein and RNA targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx DSP Instrument BufferKit</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100471</td>
			<td>Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Hyb Code Pack_Protein</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300401</td>
			<td>Controls for running GeoMX DSP experiemtns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300101</td>
			<td>Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300105</td>
			<td>Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Protein Slide Prep FFPE</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300308</td>
			<td>Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDH1-R132H antibody</td>
			<td>Dianova, Hamburg, Germany</td>
			<td>DIA-H09</td>
			<td>Monoclonal antibody against human IDH1 R132H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Bond RX</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Fully automated IHC stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Kit--12 reactions</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100052</td>
			<td>Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCounter Analysis System</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Master II</td>
			<td>3DHistech Ltd., Budapest, Hungary</td>
			<td></td>
			<td>To create the tissue microarray block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma

びまん性浸潤性神経膠腫は、腫瘍転移の浸潤性の性質のために、高い罹患率および死亡率と関連している。それらは形態学的に複雑な腫瘍であり、腫瘍自体とその不均一な微小環境の両方にわたって高度なプロテオミクス変動性を有する。これらの腫瘍の悪性化の可能性は、細胞の安定性を維持し、微小環境の構造的完全性を維持するプロセスを含む、いくつかの重要な経路に関与するタンパク質の調節不全によって増強されます。バルクおよび単一細胞神経膠腫の解析は数多く行われていますが、これらのプロテオミクスデータの空間層別化は比較的不足しています。内因性腫瘍、浸潤端、微小環境の間の腫瘍形成因子と免疫細胞集団の空間分布の違いを理解することは、腫瘍の増殖と伝播の根底にあるメカニズムへの貴重な洞察を提供します。デジタル空間プロファイリング(DSP)は、これらの重要な多層解析の基盤を形成できる強力なテクノロジーです。
DSPは、組織標本中のユーザー指定の空間領域内のタンパク質発現を効率的に定量化する方法です。DSPは、区別領域内および領域間での複数のタンパク質の発現差を研究するのに理想的であり、複数のレベルの定量的および定性的分析を可能にします。DSPプロトコルは体系的でユーザーフレンドリーであり、プロテオミクスデータのカスタマイズされた空間分析を可能にします。この実験では、組織マイクロアレイは、アーカイブされた膠芽腫コア生検から構築されます。次に、サンプル内の目的のタンパク質を標的とする抗体のパネルが選択されます。次に、UV光切断可能なDNAオリゴヌクレオチドにプレコンジュゲートされた抗体を組織サンプルとともに一晩インキュベートします。抗体の蛍光顕微鏡による可視化下で、タンパク質発現を定量するための関心領域(ROI)がサンプルとともに定義されます。次に、UV光が各ROIに向けられ、DNAオリゴヌクレオチドが切断されます。オリゴヌクレオチドはマイクロ吸引され、各ROI内でカウントされ、対応するタンパク質を空間ベースで定量します。

図4 は、膠芽腫のサンプルに対して実施されたDSP実験の代表的な結果を示す。ヒートマップが表示され、DSPソフトウェアを使用してデータを視覚的にキャプチャする方法の1つが示されています。行はタンパク質ターゲットを表し、各列は関心領域に対応します。青から赤の色の範囲は、それぞれ低表現から高表現を示します。列内の色のばらつきは、地域のタンパク質?...

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Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

プロテオミクス調節不全は、びまん性浸潤性神経膠腫の蔓延に重要な役割を果たしますが、いくつかの関連タンパク質は未同定のままです。デジタル空間処理(DSP)は、浸潤性神経膠腫の浸潤および遊走に寄与する可能性のある候補タンパク質の発現差を特徴付けるための効率的でハイスループットなアプローチを提供します。

成人型びまん性浸潤神経膠腫における微小環境のキャラクタリゼーションのためのディジタル空間プロファイリング

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

デジタル空間プロファイリング(DSP)は、空間的に層別化されたタンパク質定量のための効率的な方法を提供します。その実装により、腫瘍と微小環境の異なる領域にわたるタンパク質発現を特徴付けることができます。DSPの重要な機能は、高スループットのデータ処理を可能にする多重化機能です。カスタマイズされた対象領域を定義する機能により、データ分析に空間的次元がさらに提供されます。DSPは、空間的に定量するタンパク質またはRNA発現が病理学的または生理学的プロセスの解明に役立つ可能性のあるあらゆるサンプルに適用できます。これは、地域の標的変動が悪性の成長または浸潤と相関する可能性がある腫瘍学に特に関連しています。手順を実演するのは、組織技術者のスコット・パリソウルとゲノム技術者のレイチェル・バーニーです。スライドを準備するには、まず、各生検からいくつかの2ミリメートルコアを取り出し、それらを単一の組織マイクロアレイブロックに入れます。ブロックから4ミクロンの切片を切り取り、スライドガラスに取り付けます。各スライドをスライドホルダーガスケットの内側に置き、摂氏60度で30分間インキュベートします。半自動IHCシステムでは、スライドあたり150マイクロリットルの洗浄バッファーと5ミリリットルのデッドボリュームを位置1の容器に充填し、蓋を開けたままにします。同量のブロッキング溶液を容器の位置2に充填する。試薬容器トレイを機械にロードします。[IHC の処理] を選択し、[マーカー] フィールドのドロップダウン ボックスでソリューション名をブロックする を選択します。すべてのスライドが終了したら、[閉じる]をクリックします。次に、[ラベルの印刷]をクリックし、[まだ印刷されていないすべてのスライドラベル]をオンにして、[印刷]をクリックします。スライドの上部にラベルを貼り付けます。スライドをスライドトレイにセットし、サンプルとラベルが上向きであることを確認します。LEDボタンを押してトレイを下げ、機器がスライドのスキャンと認識を開始できるようにします。[開始] ボタンをクリックして、実験を開始します。実行が完了したら、LEDボタンが緑色に点滅したらを押します。トレイを機器から取り外し、各スライドからカバータイルを慎重に持ち上げます。スライドを1Xリン酸緩衝生理食塩水に入れます。余分なバッファーを取り除き、疎水性ペンで各組織切片の輪郭を描き、疎水性バリアを作成します。スライドごとに8マイクロリットルの各抗体を添加し、バッファーWを使用して最終容量200マイクロリットルに到達することにより、抗体PCオリゴ溶液を作成します。次に、抗体PCオリゴ溶液をスライドに塗布し、スライドを摂氏4度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、スライドを加湿トレイに入れ、1X TBSTで10分間3回洗浄します。室温で4%パラホルムアルデヒドで30分間ポストフィックスした後、1X TBSTで5分間2回洗浄します。SYTO 13核染色剤を室温で15分間加えた後、1X TBSTで2回洗浄します。コントロールセンターのデータ収集の上にマウスを置き、[新規]または[実行の続行]を選択します。ラベルをユーザーの方に向けてスライドホルダーにスライドを置きます。スライドトレイクランプを下げ、細長い窓に組織が見えるようにします。6ミリリットルのバッファSを追加します。コントロールセンターの画面の指示に従います。xスライダーとyスライダーを使用して異なる軸間をズームし、スキャンする領域を描画します。[スキャン]を選択し、定義されたターゲット領域全体が画像化されるまでスキャンを続行します。20倍の画像を生成します。各組織コアに対して直径250マイクロメートルの3つの等しいサイズの円形ROIを選択して、ROIを定義します。ROI を承認するには、[スキャン ワークスペースの終了] ボタンをクリックします。次に、UV光が抗体からオリゴを切断するのを待ちます。クリーニング機器のプロセスが完了したら、[新しいデータ収集]を選択して、現在のスライドまたはプレートを続行します。プレートアイコン領域をダブルクリックして、完成したプレートウィンドウを開きます。ハイブリダイゼーションコードパックのロット番号を入力し、[更新]をクリックします。次に、[確定]をクリックします。プロンプトに従って、スライドホルダーと収集プレートを取り外します。スライドをTBSTで保管するか、水性媒体で覆い、長期保存のためにスリップを覆います。透水性シールを使用してプレートをシールし、上部を開いた状態でサーマルサイクラーで摂氏65度で吸引液を乾燥させます。7マイクロリットルのジエチル炭酸塩処理水を加えて混合する。室温で10分間インキュベートした後、すばやくスピンダウンします。テキストプロトコルで説明されている式を適用して、適切なプローブRおよびプローブU方程式を選択して、プローブバッファーミックスを準備します。84マイクロリットルのプローブバッファーミックスを各ハイブリダイゼーションコードパックに追加します。新鮮な96ウェルハイブリダイゼーションプレートに、8マイクロリットルの各ハイブリダイゼーションコードマスターミックスを、示された行の12ウェルすべてに加える。7マイクロリットルをDSP収集プレートからハイブリダイゼーションプレート内の対応するウェルに移す。ヒートシールし、プレートを回転させ、摂氏67度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、プレートを氷上で冷却し、素早く回転させます。各ウェルからのハイブリダイゼーション産物をストリップチューブにプールし、各ウェルを5回穏やかにピペッティングします。スピンダウンし、ストリップチューブを分析システムにロードします。DSP計測器でCDFファイルをUSBドライブに保存し、データをデジタルアナライザに転送します。画面で、[処理の開始]を押します。[高感度]、[次へ]の順に選択します。サンプルを含むウェルの数に対して [すべて選択] を押し、電子メール通知で [完了]、[次へ] の順に押します。次に、[開始]をクリックします。準備ステーションが完了したら、カートリッジを密封してデジタルアナライザに移します。カウント開始を押します。[ステージ位置] を選択します。[既存のCDFファイルをロード]を押し、以前にアップロードしたファイルを選択します。[完了]を押します。もう一度[ステージ位置]を選択し、[完了]、[開始]の順に押してプログラムを実行します。解析システムからのレポーター数変換ファイルのZIPファイルをUSBドライブに保存します。ドライブをDSPマシンに挿入します。DSPコントロールセンターで、[データ収集]にカーソルを合わせ、[アカウントのアップロード]をクリックします。関連する ZIP ファイルを選択します。DSPコントロールセンターの[レコード]をクリックします。キュー内のスキャンを表示するには、[選択したスキャンをキューに追加]、[マイ分析キュー] の順に選択します。コントロールセンターのデータ分析オプションにカーソルを合わせて、キューから新しいスタディを選択します。DSP実験は膠芽腫のサンプルに対して行われ、その結果はヒートマップとして視覚化されました。行はタンパク質ターゲットを表し、各列は関心領域に対応します。発現レベルは、低い発現を示す青から、高い発現を示す赤まで変化する色の範囲で表される。列内の色のばらつきは、地域のタンパク質の不均一性を反映しており、タンパク質発現の違いとの空間的関連の可能性を示唆しています。この実験では、S100とCD-56は神経マーカーであるため、普遍的に高かった。最も変動性の高いマーカーには、腫瘍の増殖、遊走、転移に関連することが知られているB7-H3、KI-67、CD-44、およびフィブロネクチンが含まれます。DSPは、膨大な数の候補ターゲットから、大きな地域差を示すターゲットを特定できます。これは、変動性に関連する要因と病気との関連性を調査するための基礎を築きます。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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