Name: digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma
Uploaded: 2022-09-13T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma at JoVE.com

저자는 다트머스 히치콕 건강 시스템의 병리학 및 실험실 의학과에서 임상 유전체학 및 첨단 기술 연구소의 지원을 인정합니다. 저자는 또한 NCI 암 센터 지원 보조금 5P30 CA023108-37과 함께 다트머스 암 센터의 병리학 공유 리소스를 인정합니다.

아래에 설명 된 프로토콜은 Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee의 지침을 따릅니다. 이 연구에 조직 샘플이 포함 된 환자로부터 정보에 입각 한 동의를 얻었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약, 장비 및 소프트웨어와 관련된 자세한 내용은 재료 표 섹션을 참조하십시오.
1. 슬라이드 준비17
<ol><li>인간 성인형 미만성...

<ol>
	<li>Pedersen, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+patterns+of+lac-z+transfected+human+glioma+cells+in+the+rat+brain.">Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain.</a> International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).</li><li>Iwadate, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+in+glioblastoma+progression.">Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression.</a> Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).</li><li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+and+prognosis+analysis+of+epithelial-mesenchymal+transition+in+glioma.">Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Barthel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+molecular+signature+and+crossroads+with+tumor+microenvironment.">Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).</li><li>Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-apoptosis+mechanisms+in+malignant+gliomas.">Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).</li><li>Berghoff, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death+ligand+1+expression+and+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+glioblastoma.">Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).</li><li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue.">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li><li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling.">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li><li>Garcia-Pardo, M., Calles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-1+NSCLC+therapy+resistance+mechanism.">ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism.</a> Precision Cancer Medicine. , (2021).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+spatial+profiling+of+individual+glomeruli+from+patients+with+anti-neutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+glomerulonephritis.">Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).</li><li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+GeoMx+digital+spatial+profiler.">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456 (2021).</li><li>Brady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-+and+intra-tumor+heterogeneity+of+metastatic+prostate+cancer+determined+by+digital+spatial+gene+expression+profiling.">Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling.</a> Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).</li><li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+digital+spatial+profiling+of+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+patients.">Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients.</a> Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).</li><li>Wang, D. Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study:+Digital+spatial+profiling+of+metastatic+clear+cell+carcinoma+reveals+intra-tumor+heterogeneity+in+epithelial-mesenchymal+gradient.">Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>GeoMx DSP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+slide+preparation+user+manual.">Automated slide preparation user manual.</a> GeoMx DSP. , (2022).</li><li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).</li><li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoadjuvant+versus+adjuvant+ipilimumab+plus+nivolumab+in+macroscopic+stage+III+melanoma.">Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).</li><li>Matthews, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-enriched+hyaluronan+binding+(BEHAB)/brevican+cleavage+in+a+glioma+cell+line+is+mediated+by+a+disintegrin+and+metalloproteinase+with+thrombospondin+motifs+(ADAMTS)+family+member.">Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).</li><li>Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+infiltration+into+central+nervous+system+tissue+in+vitro:+involvement+of+a+metalloprotease.">Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease.</a> Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).</li><li>Beli&#235;n, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-type+1+matrix+metalloprotease+(MT1-MMP)+enables+invasive+migration+of+glioma+cells+in+central+nervous+system+white+matter.">Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter.</a> Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).</li><li>Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+antigens+recognized+by+T+lymphocytes:+At+the+core+of+cancer+immunotherapy.">Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).</li><li>Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+for+cancer+prevention:+a+practical+and+feasible+approach+to+the+cancer+epidemic.">Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Chen, L., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-PD-1/PD-L1+therapy+of+human+cancer:+past,+present,+and+future.">Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-Associated+stromal+cells+stimulate+glioma+malignancy+by+regulating+the+tumor+immune+microenvironment.">Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).</li><li>Ishii, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+characterization+of+the+tumorigenic+&amp;#34;peri-necrotic+niche&amp;#34;+harboring+quiescent+stem-like+tumor+cells+in+glioblastoma.">Histological characterization of the tumorigenic &amp;#34;peri-necrotic niche&amp;#34; harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma.</a> PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).</li><li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments.">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).</li><li>NanoString. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CosMx+Spatial+Molecular+Imager:+True+Single-Cell+In+Situ+Solution.">CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution.</a> NanoString. , (2022).</li></ol>

신경교종의 공격성에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 단백질의 다양성과 이러한 단백질 중 일부가 발견되지 않은 상태로 남아 있다는 개념을 감안할 때 고처리량 단백질 정량 방법은 이상적인 기술적 접근 방식입니다. 또한 종양학 샘플의 공간 데이터가 종종 차등 발현18과 상관 관계가 있다는 점을 감안할 때 공간 프로파일링을 단백질 정량화 접근 방식에 통합하면 보다 효과?...

확산 성 신경 교종은 성인에서 가장 흔한 유형의 악성 뇌종양이며 항상 치명적입니다. 신경 교종 세포가 뇌에서 광범위하게 이동하는 경향은 주요 치료 과제입니다. 그들이 확산되는 메커니즘에는 직접 이주와 확인되지 않은 침략이 포함됩니다. 침습성 신경교종 세포는 백질 관1을 따라 향성과 이동을 나타내는 것으로 나타났으며, 최근 연구에서는 이러한 관의 탈수초화를 활성 원발성 특징2으로 암시합니다. 침습은 상피에서 중간엽으로의 전이에 의해 매개되며, 여기서 신경교종 세포는 세포외 기질 단백질 및 세포 부착 분자를 코딩하는 유전자의 발현을 감소시키고, 이동을 증폭하고, 종양 미세 환경을 통한 전파를 촉진함으로써 중간엽 특성을 획득한다 3,4,5.
분자 수준에서 세포 안정성을 부여하고 면역 원성 성분과의 인터페이스를 부여하는 여러 단백질의 파괴가 입증되었습니다6. 침윤성 신경교종은 항-세포사멸(예를 들어, PTEN) 특성을 갖는 단백질의 억제를 겪는 것으로 알려져 있다7. 또한 숙주 면역 반응의 회피를 촉진하는 단백질(예: PD1/PDL1)을 과발현합니다8. 이러한 복잡한 경로의 조절 장애는 종양 유발성을 향상시키고 악성 가능성을 증가시킵니다.
침습성 신경교종 샘플 내에서 목표는 세포 성장, 생존 및 증식에 중요한 단백질의 차등 발현과 침습성 및 비침습적 구성 요소 간의 미세 환경 구조적 무결성을 평가하는 것이었습니다. 또한, 우리는 활성 면역원성 역할을 하는 단백질의 차등 조절을 연구하여 손상된 숙주 면역 방어가 신경교종의 증식 및 침습 잠재력을 향상시킬 수 있는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고자 했습니다. 이것은 면역 마커와 악성 종양의 조절 장애 동인이 면역 요법의 표적이 될 수 있음을 보여주는 최근의 광범위한 연구를 고려할 때 특히 관련이 있습니다. 면역감시 및 반응성에 관여하는 많은 단백질 중에서 실행 가능한 치료 표적을 식별하려면 매우 민감하고 포괄적인 접근 방식이 필요합니다.
연구할 수 있는 다양한 후보 단백질을 감안할 때, 우리는 면역조직화학과 유사하지만 데이터 처리 효율성이 향상된 방법을 모색했습니다. 암 생물학 분야에서 DSP는 단백질체학 분석 및 정량화를 위한 대체 도구에 비해 중요한 이점을 가진 강력한 기술로 부상했습니다. DSP의 특징은 시료 내 여러 단백질을 동시에 연구할 수 있는 고처리량 멀티플렉싱 기능으로, 면역조직화학(IHC)9,10과 같은 표준이지만 낮은 플렉스 기술과 중요한 차이점을 나타냅니다. DSP의 멀티플렉스 기능은 DSP와 IHC를 비교한 연구에서 입증된 바와 같이 정량적 및 분석 도구로서의 충실도를 손상시키지 않습니다. 예를 들어 비소세포 폐암 표본의 단백질체학적 정량화에 사용되는 경우, DSP는 IHC11과 유사한 결과를 갖는 것으로 나타났다. 또한 DSP는 사용자가 단백질체 분석을 수행할 영역을 수동으로 정의할 수 있는 사용자 지정 가능한 지역 사양을 제공합니다. 이것은 전체 섹션 멀티플렉스 방법10,12에 비해 이점을 제공합니다. 따라서 DSP는 단일 처리 라운드에서 여러 관심 영역에 걸쳐 여러 단백질 표적을 조사하여 여러 계층의 분석을 제공합니다.
DSP는 여러 가지 병리학 적 환경에서 적용됩니다. DSP는 공간적 변이가 세포 형질전환 및 차등 단백질 발현과 상관관계가 있을 수 있기 때문에 종양학적 분석에서 특히 유리합니다. 예를 들어, DSP는 유방암의 단백질체학 프로파일을 인접한 종양 미세환경과 비교하는데 사용되었다. 이것은 이 종양의 자연사와 그 진행, 그리고 치료13에 대한 잠재적 반응을 이해하는 데 중요한 의미를 담고 있습니다. DSP의 다양성을 보여주는 추가 컨텍스트에는 전립선암14에서 단백질 다양성의 공간 정량화, 두경부 편평 세포 암종에서 면역 세포 마커 발현과 질병 진행의 연관성15, 전이성과 원발성 투명 세포 난소암을 구별하는 단백질 발현의 상피-중간엽 구배의 입증16 . DSP를 구현함으로써 우리는 종양 발생 및 신경교종의 침습에 영향을 미칠 수 있는 단백질의 공간 지형을 특성화합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BOND Research Detection System</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DS9455</td>
			<td>Open detection system containing open containers in a reagent tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Wash</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>AR950</td>
			<td>10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer W</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 conjugation kit</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>AB188287</td>
			<td>Cy3 fluorescent antibody conjugation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>System for imaging and characterizing protein and RNA targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx DSP Instrument BufferKit</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100471</td>
			<td>Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Hyb Code Pack_Protein</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300401</td>
			<td>Controls for running GeoMX DSP experiemtns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300101</td>
			<td>Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300105</td>
			<td>Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Protein Slide Prep FFPE</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300308</td>
			<td>Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDH1-R132H antibody</td>
			<td>Dianova, Hamburg, Germany</td>
			<td>DIA-H09</td>
			<td>Monoclonal antibody against human IDH1 R132H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Bond RX</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Fully automated IHC stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Kit--12 reactions</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100052</td>
			<td>Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCounter Analysis System</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Master II</td>
			<td>3DHistech Ltd., Budapest, Hungary</td>
			<td></td>
			<td>To create the tissue microarray block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma

확산 침윤성 신경 교종은 종양 확산의 침윤성 특성으로 인해 높은 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 그들은 형태학적으로 복잡한 종양으로, 종양 자체와 이질적인 미세 환경 모두에서 높은 수준의 단백질체 가변성을 가지고 있습니다. 이러한 종양의 악성 잠재력은 세포 안정성을 유지하고 미세 환경의 구조적 완전성을 보존하는 과정을 포함하여 여러 주요 경로에 관여하는 단백질의 조절 장애에 의해 향상됩니다. 수많은 벌크 및 단일 세포 신경교종 분석이 있었지만 이러한 단백질체 데이터의 공간적 계층화가 상대적으로 부족합니다. 내인성 종양, 침습성 가장자리 및 미세 환경 간의 종양 발생 인자와 면역 세포 집단의 공간적 분포의 차이를 이해하면 종양 증식 및 전파의 기본 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 디지털 공간 프로파일링(DSP)은 이러한 중요한 다층 분석의 토대를 형성할 수 있는 강력한 기술입니다.
DSP는 조직 표본의 사용자 지정 공간 영역 내에서 단백질 발현을 효율적으로 정량화하는 방법입니다. DSP는 구별 영역 내 및 여러 단백질의 차별적 발현을 연구하는 데 이상적이며 여러 수준의 정량적 및 정성 분석이 가능합니다. DSP 프로토콜은 체계적이고 사용자 친화적이어서 단백질체 데이터의 맞춤형 공간 분석이 가능합니다. 이 실험에서 조직 마이크로 어레이는 보관 된 교 모세포종 코어 생검으로 구성됩니다. 다음으로, 항체 패널이 선택되어 샘플 내에서 관심 단백질을 표적으로 합니다. UV 광절단 가능한 DNA 올리고뉴클레오티드에 전접합된 항체는 밤새 조직 샘플과 함께 배양됩니다. 항체의 형광 현미경 시각화에서 단백질 발현을 정량화할 관심 영역(ROI)이 샘플과 함께 정의됩니다. 그런 다음 UV 광선이 각 ROI로 향하여 DNA 올리고뉴클레오티드를 절단합니다. 올리고뉴클레오티드는 각 ROI 내에서 미세 흡기 및 계수되어 공간 기준으로 해당 단백질을 정량화합니다.

도 4 는 교모세포종의 샘플에 대해 수행된 DSP 실험으로부터의 대표적인 결과를 나타낸다. DSP 소프트웨어를 사용하여 데이터를 시각적으로 캡처하는 방법 중 하나를 보여주는 히트 맵이 제공됩니다. 행은 단백질 표적을 나타내며 각 열은 관심 영역에 해당합니다. 파란색에서 빨간색의 색상 범위는 각각 낮은 표현에서 높은 표현을 나타냅니다. 행 내 색상의 가변성은 지역 단?...

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Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

단백질체 조절 장애는 확산 침윤성 신경교종의 확산에 중요한 역할을 하지만 몇 가지 관련 단백질은 아직 확인되지 않았습니다. 디지털 공간 처리(DSP)는 침윤성 신경교종의 침습 및 이동에 기여할 수 있는 후보 단백질의 차등 발현을 특성화하기 위한 효율적인 고처리량 접근 방식을 제공합니다.

성인형 미만성 침윤성 신경교종의 미세환경 특성화를 위한 디지털 공간 프로파일링

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

디지털 공간 프로파일링(DSP)은 공간적으로 계층화된 단백질 정량화를 위한 효율적인 방법을 제공합니다. 이를 구현하면 종양과 미세 환경의 별개 영역에서 단백질 발현을 특성화 할 수 있습니다. DSP의 주요 기능은 높은 처리량의 데이터 처리를 가능하게 하는 멀티플렉싱 기능입니다.사용자 지정된 관심 영역을 정의하는 기능은 데이터 분석에 공간 차원을 추가로 제공합니다. DSP는 공간적으로 정량화하는 단백질 또는 RNA 발현이 병리학적 또는 생리학적 과정을 밝히는 데 도움이 될 수 있는 모든 샘플에 적용될 수 있습니다. 이것은 특히 지역 표적 변동성이 악성 성장 또는 침습과 관련이있을 수있는 종양학과 관련이 있습니다.이 절차를 시연하는 것은 조직 공학자 인 Scott Palisoul과 게놈 기술자 인 Rachael Barney입니다. 슬라이드를 준비하려면 먼저 각 생검에서 여러 개의 2mm 코어를 가져와 단일 조직 마이크로 어레이 블록에 넣습니다. 블록에서 4 미크론 섹션을 잘라 유리 슬라이드에 장착하십시오.각 슬라이드를 슬라이드 홀더 개스킷 안에 넣고 섭씨 60도에서 30분 동안 배양합니다. 반자동 IHC 시스템에서 슬라이드 당 150 마이크로 리터의 세척 버퍼와 5 밀리리터의 데드 볼륨으로 위치 1의 용기를 채우고 뚜껑을 열어 둡니다. 용기의 위치 2에 동일한 양의 차단 용액을 채 웁니다.시약 용기 트레이를 기계에 로드합니다. 프로세스 IHC를 선택한 다음 마커 필드의 드롭다운 상자에서 차단 솔루션 이름을 선택합니다. 모든 슬라이드에 대해 완료되면 닫기를 클릭합니다.그런 다음 레이블 인쇄를 클릭하고 모든 슬라이드 레이블이 아직 인쇄되지 않음을 선택하고 인쇄를 클릭합니다. 슬라이드 상단에 레이블을 부착합니다. 슬라이드를 슬라이드 트레이에 올려 샘플과 라벨이 위를 향하도록 합니다.LED 버튼을 눌러 트레이를 내리고 기기가 슬라이드 스캔 및 인식을 시작하도록 합니다. 시작 버튼을 클릭하여 실험을 시작합니다. 주행이 완료되면 녹색으로 깜박이면 LED 버튼을 누릅니다.기기에서 트레이를 제거하고 각 슬라이드에서 커버 타일을 조심스럽게 들어 올립니다. 슬라이드를 1X 인산염 완충 식염수에 넣습니다. 과도한 완충액을 제거하고 소수성 펜으로 각 조직 섹션의 윤곽을 그리며 소수성 장벽을 만듭니다.슬라이드 당 각 항체의 8 마이크로리터를 첨가하고 버퍼 W를 사용하여 200 마이크로리터의 최종 부피에 도달함으로써 항체 PC 올리고 용액을 만든다. 이어서, 항체 PC 올리고 용액을 슬라이드에 적용하고, 슬라이드를 섭씨 4도에서 밤새 배양한다. 배양 후 슬라이드를 가습 트레이에 넣고 1X TBST에서 10분 동안 세 번 세척합니다.실온에서 30분 동안 4%파라포름알데히드에 사후 고정한 후 1X TBST에서 5분 동안 두 번 세척합니다. 실온에서 15분 동안 SYTO 13 핵 염색을 첨가한 다음, 1X TBST로 2회 세척하였다. 제어 센터의 데이터 수집 위에 마우스를 놓고 새로 만들기 또는 계속 실행을 선택합니다.레이블이 사용자를 향하도록 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 트레이 cl을 내립니다.amp 길쭉한 창에서 조직이 보이도록 합니다. 6밀리리터의 버퍼 S를 추가합니다.제어 센터의 지시를 따릅니다.x 및 y 슬라이더로 여러 축 사이를 확대하여 스캔할 영역을 표시합니다. 스캔(Scan)을 선택하고 정의된 전체 대상 영역이 이미징될 때까지 스캔을 진행합니다. 20 번 이미지를 생성합니다.각 조직 코어에 대해 직경이 250마이크로미터인 동일한 크기의 원형 ROI 3개를 선택하여 ROI를 정의합니다. 스캔 작업 영역 종료 버튼을 클릭하여 ROI를 승인합니다. 그런 다음 UV 광선이 항체에서 올리고를 절단할 때까지 기다립니다.장비 청소 프로세스를 완료한 후 새 데이터 수집을 선택하여 현재 슬라이드 또는 플레이트를 계속 진행합니다. 플레이트 아이콘 영역을 두 번 클릭하여 완성된 플레이트 창을 엽니다. 하이브리드화 코드 팩 로트 번호를 입력하고 업데이트를 클릭합니다.그런 다음 완료를 클릭하십시오. 프롬프트에 따라 슬라이드 홀더와 수집 플레이트를 분리합니다. 슬라이드를 TBST에 보관하거나 수성 매체로 덮고 장기 보관을 위해 슬립을 덮으십시오.투과성 씰을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 상단이 열린 상태에서 열 순환기에서 섭씨 65도에서 흡인물을 건조시킵니다. 7마이크로리터의 디에틸 피로카보네이트 처리된 물을 넣고 혼합합니다. 실온에서 10 분 동안 배양 한 다음 빠르게 회전시킵니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 방정식을 적용하는 적절한 프로브 R 및 프로브 U 방정식을 선택하여 프로브 버퍼 믹스를 준비합니다. 84마이크로리터의 프로브 버퍼 혼합물을 각 하이브리드화 코드 팩에 추가합니다. 새로운 96웰 하이브리드화 플레이트에서 각 하이브리드화 코드 마스터 믹스 8마이크로리터를 표시된 행의 12웰 모두에 추가합니다.7 마이크로리터를 DSP 수집 플레이트로부터 하이브리드화 플레이트의 상응하는 웰로 옮긴다. 가열 밀봉하고 플레이트를 회전시킨 다음 섭씨 67도에서 밤새 배양합니다. 배양 후, 얼음 위에서 플레이트를 식히고 빠른 회전을 수행하십시오.각 웰의 하이브리드화 제품을 스트립 튜브에 모으고 각 웰을 5회 부드럽게 피펫팅합니다. 스핀다운하고 스트립 튜브를 분석 시스템에 로드합니다. DSP 기기에서 CDF 파일을 USB 드라이브에 저장하고 데이터를 디지털 분석기로 전송합니다.화면에서 처리 시작을 누릅니다. 고감도를 선택하고 다음을 선택합니다. 샘플이 있는 웰 수에 대해 모두 선택을 누른 다음 Finish(마침)를 누른 후 이메일 알림에서 다음을 누릅니다.그런 다음 시작을 클릭하십시오. 준비 스테이션이 완료되면 카트리지를 밀봉하고 디지털 분석기로 옮깁니다. 계산 시작을 누릅니다.스테이지 위치를 선택합니다. 기존 CDF 파일 로드를 누르고 이전에 업로드한 파일을 선택합니다. 완료를 누릅니다.스테이지 위치를 다시 선택하고 완료를 누른 다음 시작을 눌러 프로그램을 실행합니다. 리포터 카운트 변환 파일의 ZIP 파일을 분석 시스템에서 USB 드라이브로 저장합니다. 드라이브를 DSP 시스템에 삽입합니다.DSP 제어 센터에서 데이터 수집 위로 마우스를 가져간 다음 계정 업로드를 클릭합니다. 관련 ZIP 파일을 선택합니다. DSP 제어 센터에서 레코드를 클릭합니다.대기열에서 스캔을 보려면 선택한 스캔을 대기열에 추가, 내 분석 대기열을 차례로 선택합니다. 제어 센터의 데이터 분석 옵션 위로 마우스를 가져가 대기열에서 새 스터디를 선택합니다. 교모세포종 샘플에 대해 DSP 실험을 수행하였고, 그 결과를 히트맵으로 시각화하였다.행은 단백질 표적을 나타내며 각 열은 관심 영역에 해당합니다. 표현 수준은 낮은 표현을 나타내는 파란색에서 높은 표현을 나타내는 빨간색까지 다양한 색상 범위로 표시됩니다. 행 내 색상의 가변성은 지역 단백질 이질성을 반영하며 차등 단백질 발현과의 가능한 공간적 연관성을 시사합니다.이 실험에서 S100과 CD-56은 신경 마커이기 때문에 보편적으로 높았습니다. 가장 가변성이 높은 마커에는 B7-H3, KI-67, CD-44 및 피브로넥틴이 포함되며, 이들은 종양 증식, 이동 및 전이와 관련된 것으로 알려져 있습니다. 광범위한 후보 대상 중에서 DSP는 상당한 지역적 차이를 보이는 대상을 식별할 수 있습니다.이것은 변동성 및 질병과의 관련성과 관련된 요인을 조사하기위한 토대를 마련합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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연구

암 연구학

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