Name: digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma
Uploaded: 2022-09-13T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner støtten fra Laboratoriet for klinisk genomikk og avansert teknologi ved Institutt for patologi og laboratoriemedisin i Dartmouth Hitchcock Health System. Forfatterne anerkjenner også Pathology Shared Resource ved Dartmouth Cancer Center med NCI Cancer Center Support Grant 5P30 CA023108-37.

Protokollen som er skissert nedenfor følger retningslinjene til Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Informert samtykke ble innhentet fra pasientene som fikk vevsprøver inkludert i denne studien. Se delen Materialtabell for detaljer knyttet til alle materialer, reagenser, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen.
1. Lysbilde forberedelse17
<ol><li>Hent eller klargjør formalinfast, parafin-innebygd vev fr...

<ol>
	<li>Pedersen, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+patterns+of+lac-z+transfected+human+glioma+cells+in+the+rat+brain.">Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain.</a> International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).</li><li>Iwadate, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+in+glioblastoma+progression.">Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression.</a> Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).</li><li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+and+prognosis+analysis+of+epithelial-mesenchymal+transition+in+glioma.">Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Barthel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+molecular+signature+and+crossroads+with+tumor+microenvironment.">Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).</li><li>Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-apoptosis+mechanisms+in+malignant+gliomas.">Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).</li><li>Berghoff, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death+ligand+1+expression+and+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+glioblastoma.">Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).</li><li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue.">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li><li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling.">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li><li>Garcia-Pardo, M., Calles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-1+NSCLC+therapy+resistance+mechanism.">ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism.</a> Precision Cancer Medicine. , (2021).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+spatial+profiling+of+individual+glomeruli+from+patients+with+anti-neutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+glomerulonephritis.">Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).</li><li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+GeoMx+digital+spatial+profiler.">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456 (2021).</li><li>Brady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-+and+intra-tumor+heterogeneity+of+metastatic+prostate+cancer+determined+by+digital+spatial+gene+expression+profiling.">Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling.</a> Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).</li><li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+digital+spatial+profiling+of+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+patients.">Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients.</a> Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).</li><li>Wang, D. Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study:+Digital+spatial+profiling+of+metastatic+clear+cell+carcinoma+reveals+intra-tumor+heterogeneity+in+epithelial-mesenchymal+gradient.">Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>GeoMx DSP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+slide+preparation+user+manual.">Automated slide preparation user manual.</a> GeoMx DSP. , (2022).</li><li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).</li><li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoadjuvant+versus+adjuvant+ipilimumab+plus+nivolumab+in+macroscopic+stage+III+melanoma.">Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).</li><li>Matthews, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-enriched+hyaluronan+binding+(BEHAB)/brevican+cleavage+in+a+glioma+cell+line+is+mediated+by+a+disintegrin+and+metalloproteinase+with+thrombospondin+motifs+(ADAMTS)+family+member.">Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).</li><li>Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+infiltration+into+central+nervous+system+tissue+in+vitro:+involvement+of+a+metalloprotease.">Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease.</a> Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).</li><li>Beli&#235;n, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-type+1+matrix+metalloprotease+(MT1-MMP)+enables+invasive+migration+of+glioma+cells+in+central+nervous+system+white+matter.">Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter.</a> Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).</li><li>Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+antigens+recognized+by+T+lymphocytes:+At+the+core+of+cancer+immunotherapy.">Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).</li><li>Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+for+cancer+prevention:+a+practical+and+feasible+approach+to+the+cancer+epidemic.">Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Chen, L., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-PD-1/PD-L1+therapy+of+human+cancer:+past,+present,+and+future.">Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-Associated+stromal+cells+stimulate+glioma+malignancy+by+regulating+the+tumor+immune+microenvironment.">Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).</li><li>Ishii, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+characterization+of+the+tumorigenic+&amp;#34;peri-necrotic+niche&amp;#34;+harboring+quiescent+stem-like+tumor+cells+in+glioblastoma.">Histological characterization of the tumorigenic &amp;#34;peri-necrotic niche&amp;#34; harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma.</a> PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).</li><li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments.">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).</li><li>NanoString. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CosMx+Spatial+Molecular+Imager:+True+Single-Cell+In+Situ+Solution.">CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution.</a> NanoString. , (2022).</li></ol>

Gitt mangfoldet av proteiner som potensielt kan påvirke aggressiviteten til gliomer og forestillingen om at flere av disse proteinene forblir uoppdaget, er en proteinkvantifiseringsmetode med høy gjennomstrømning en ideell teknologisk tilnærming. I tillegg, gitt at romlige data i onkologiske prøver ofte korrelerer med differensialuttrykk18, gir inkorporering av romlig profilering i proteinkvantifiseringsmetoden mer effektiv analyse.
Den høye gjennomstrømningsmeto...

Diffust infiltrerende gliomer er den vanligste typen ondartet hjernesvulst hos voksne og er alltid dødelig. Tilbøyeligheten til gliomceller til å migrere mye i hjernen er en stor terapeutisk utfordring. Mekanismen som de sprer innebærer rettet migrasjon og ukontrollert invasjon. Invasive gliomceller har vist seg å utvise tropisme og migrasjon langs hvite substanskanaler1, med nyere forskning som impliserer demyelinisering av disse kanalene som en aktiv, protumorigen funksjon2. Invasjon er mediert av en epitel-til-mesenkymal overgang, hvor gliomceller oppnår mesenkymale egenskaper ved å redusere uttrykket av gener som koder for ekstracellulære matriksproteiner og celleadhesjonsmolekyler, forsterker migrasjon og letter forplantning gjennom tumormikromiljøet 3,4,5.
På molekylært nivå erdet påvist forstyrrelse av flere proteiner som gir cellulær stabilitet og grensesnitt med immunogene komponenter. Infiltrative gliomer er kjent for å gjennomgå undertrykkelse av proteiner med anti-apoptotiske (f.eks. PTEN) egenskaper7. De overuttrykker også proteiner som fremmer unnvikelse av vertsimmunresponsen (f.eks. PD1 / PDL1)8. Dysreguleringen av disse komplekse banene forbedrer tumorigenitet og øker ondartet potensial.
Innenfor prøver av invasive gliomer var målet å evaluere differensialuttrykket av proteiner som er nøkkelen til cellevekst, overlevelse og spredning, og til mikromiljøets strukturelle integritet mellom invasive og ikke-invasive komponenter. I tillegg søkte vi å studere differensialreguleringen av proteiner med en aktiv immunogen rolle, og ga innsikt i mekanismen der kompromittert vertsimmunforsvar kan forbedre det proliferative og invasive potensialet til gliomer. Dette er spesielt relevant gitt den siste bredden av forskning som viser hvordan immunmarkører og drivere for dysregulering i malignitet kan tjene som mål for immunterapi. Å identifisere levedyktige terapeutiske mål blant de mange proteinene som er involvert i immunovervåkning og reaktivitet krever en svært sensitiv og omfattende tilnærming.
Gitt det brede utvalget av kandidatproteiner som kan studeres, søkte vi en metode som ligner på immunhistokjemi, men med forbedret databehandlingseffektivitet. Innen kreftbiologi har DSP dukket opp som en kraftig teknologi med viktige fordeler i forhold til alternative verktøy for proteomisk analyse og kvantifisering. Kjennetegnet ved DSP er dens høykapasitetsmultipleksingsevne, noe som muliggjør samtidig studier av flere forskjellige proteiner i en prøve, og markerer et viktig skille fra standard, men lavere plex-teknologier som immunhistokjemi (IHC) 9,10. Multiplex-funksjonen til DSP kompromitterer ikke dens troskap som et kvantitativt og analytisk verktøy, som demonstrert av studier som sammenligner DSP med IHC. Når det brukes til proteomisk kvantifisering av ikke-småcellede lungekreftprøver, har DSP for eksempel vist seg å ha lignende resultater som IHC11. I tillegg tilbyr DSP tilpassbar regional spesifikasjon, der brukere manuelt kan definere regioner innenfor hvilke de skal utføre proteomisk analyse. Dette gir en fordel i forhold til helseksjonsmultipleksmetoder10,12. I en enkelt runde med behandling tilbyr DSP dermed flere lag med analyse ved å kartlegge flere proteinmål på tvers av flere interesseområder.
DSP har applikasjoner i flere forskjellige patologiske innstillinger. DSP er spesielt fordelaktig i onkologisk analyse, da romlig variasjon kan korrelere med cellulær transformasjon og differensial proteinuttrykk. For eksempel har DSP blitt brukt til å sammenligne den proteomiske profilen til brystkreft med det tilstøtende tumormikromiljøet. Dette har viktige implikasjoner for å forstå den naturlige historien til denne svulsten og dens progresjon, samt potensiell respons på behandling13. Ytterligere kontekster som illustrerer allsidigheten til DSP inkluderer romlig kvantifisering av proteindiversitet i prostatakreft14, assosiasjon av immuncellemarkøruttrykk med sykdomsprogresjon i hode- og nakkeplateepitelkarsinom 15, og demonstrasjon av en epitel-mesenkymal gradient av proteinuttrykk som skiller metastatisk fra primær klarcellet eggstokkreft16 . Ved å implementere DSP karakteriserer vi den romlige topografien til proteiner som kan påvirke tumorigenese og invasjon av gliomer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BOND Research Detection System</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DS9455</td>
			<td>Open detection system containing open containers in a reagent tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Wash</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>AR950</td>
			<td>10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer W</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 conjugation kit</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>AB188287</td>
			<td>Cy3 fluorescent antibody conjugation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>System for imaging and characterizing protein and RNA targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx DSP Instrument BufferKit</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100471</td>
			<td>Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Hyb Code Pack_Protein</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300401</td>
			<td>Controls for running GeoMX DSP experiemtns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300101</td>
			<td>Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300105</td>
			<td>Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Protein Slide Prep FFPE</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300308</td>
			<td>Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDH1-R132H antibody</td>
			<td>Dianova, Hamburg, Germany</td>
			<td>DIA-H09</td>
			<td>Monoclonal antibody against human IDH1 R132H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Bond RX</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Fully automated IHC stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Kit--12 reactions</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100052</td>
			<td>Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCounter Analysis System</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Master II</td>
			<td>3DHistech Ltd., Budapest, Hungary</td>
			<td></td>
			<td>To create the tissue microarray block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma

Diffust infiltrerende gliomer er forbundet med høy morbiditet og dødelighet på grunn av den infiltrative karakteren av tumorspredning. De er morfologisk komplekse svulster, med en høy grad av proteomisk variabilitet over både selve svulsten og dens heterogene mikromiljø. Det ondartede potensialet til disse svulstene forbedres av dysreguleringen av proteiner involvert i flere viktige veier, inkludert prosesser som opprettholder cellulær stabilitet og bevarer mikromiljøets strukturelle integritet. Selv om det har vært mange bulk- og encellede gliomanalyser, er det en relativ mangel på romlig stratifisering av disse proteomiske dataene. Å forstå forskjeller i romlig fordeling av tumorogene faktorer og immuncellepopulasjoner mellom den indre svulsten, invasiv kant og mikromiljø gir verdifull innsikt i mekanismene som ligger til grunn for tumorproliferasjon og forplantning. Digital romprofilering (DSP) representerer en kraftig teknologi som kan danne grunnlaget for disse viktige flerlagsanalysene.
DSP er en metode som effektivt kvantifiserer proteinuttrykk innenfor brukerspesifiserte romlige regioner i en vevsprøve. DSP er ideell for å studere differensialuttrykket av flere proteiner innenfor og på tvers av skilleregioner, noe som muliggjør flere nivåer av kvantitativ og kvalitativ analyse. DSP-protokollen er systematisk og brukervennlig, noe som muliggjør tilpasset romlig analyse av proteomiske data. I dette eksperimentet er vevsmikromatriser konstruert fra arkiverte glioblastomkjernebiopsier. Deretter velges et panel av antistoffer, rettet mot proteiner av interesse i prøven. Antistoffene, som er prekonjugert til UV-fotospaltbare DNA-oligonukleotider, inkuberes deretter med vevsprøven over natten. Under fluorescensmikroskopi visualisering av antistoffene, regioner av interesse (ROIs) innenfor hvilke å kvantifisere proteinuttrykk er definert med prøvene. UV-lys blir deretter rettet mot hver avkastning, og spalter DNA-oligonukleotidene. Oligonukleotidene mikroaspireres og telles innenfor hver avkastning, og kvantifiserer det tilsvarende proteinet på romlig basis.

Figur 4 viser de representative resultatene fra et DSP-eksperiment utført på prøver av glioblastom. Et varmekart presenteres, som illustrerer en av metodene for å fange data visuelt ved hjelp av DSP-programvaren. Rader representerer proteinmål, og hver kolonne tilsvarer et område av interesse. Et fargeområde fra blått til rødt angir henholdsvis lavt til høyt uttrykk. Variabilitet av farge i en rad reflekterer regional protein heterogenitet og antyder en mulig romlig tilknytning til...

Watch this Scientific Journal Video about Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma at JoVE.com

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Proteomisk dysregulering spiller en viktig rolle i spredningen av diffust infiltrerende gliomer, men flere relevante proteiner forblir uidentifiserte. Digital romlig prosessering (DSP) tilbyr en effektiv, høy gjennomstrømningsmetode for å karakterisere differensialuttrykket av kandidatproteiner som kan bidra til invasjon og migrasjon av infiltrative gliomer.

Digital romlig profilering for karakterisering av mikromiljøet i voksen type diffust infiltrerende gliom

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

Digital romlig profilering, eller DSP, tilbyr en effektiv metode for romlig stratifisert proteinkvantifisering. Implementeringen gjør det mulig for oss å karakterisere proteinuttrykk på tvers av forskjellige regioner av en svulst og mikromiljøet. En viktig funksjon i DSP er multipleksingsevnen, noe som muliggjør databehandling med høy gjennomstrømning.Evnen til å definere tilpassede områder av interesse gir i tillegg en romlig dimensjon til dataanalyse. DSP kan brukes på en hvilken som helst prøve der romlig kvantifiserende protein eller RNA-uttrykk kan bidra til å belyse en patologisk eller fysiologisk prosess. Dette er spesielt relevant i onkologi, hvor regional målvariabilitet kan korrelere med ondartet vekst eller invasjon.Demonstrere prosedyren vil være Scott Palisoul, en histotechnologist, og Rachael Barney, en genomisk teknolog. For å forberede lysbilder, begynn med å ta flere to millimeter kjerner fra hver biopsi, og legg dem i en enkelt vevsmikromatriseblokk. Klipp fire mikron seksjoner fra blokken, og monter dem på glassglass.Plasser hvert lysbilde inne i glideholderpakningen, og inkuber den ved 60 grader Celsius i 30 minutter. I det halvautomatiske IHC-systemet fyller du beholderen i posisjon en med 150 mikroliter vaskebuffer per lysbilde, pluss fem milliliter dødvolum, og lar lokket stå åpent. Fyll samme mengde blokkeringsløsning i beholderen i posisjon to.Legg beholderbrettet for reagens på maskinen. Velg Process IHC, etterfulgt av blokkering av løsningsnavn i rullegardinlisten i-feltet. Når du er ferdig for alle lysbildene, klikker du på Lukk.Klikk deretter på Skriv ut etiketter, og merk av for Alle lysbildeetiketter som ennå ikke er skrevet ut, og klikk på Skriv ut. Fest etiketter på toppen av lysbildene. Legg lysbildene på glidebrettet, og sørg for at prøven og etiketten vender oppover.Trykk på LED-knappen for å senke skuffen, og la instrumentet starte skanningen og gjenkjenningen av lysbilder. Klikk på Start-knappen for å starte eksperimentet. Når kjøringen er fullført, trykker du på LED-knappen når den blinker grønt.Fjern brettet fra instrumentet, og løft dekselflisene forsiktig fra hvert lysbilde. Plasser lysbildene i 1X fosfatbufret saltvann. Fjern overflødig buffer, og skisser hver vevsseksjon med en hydrofob penn for å skape en hydrofob barriere.Lag et antistoff PC oligo-løsning ved å legge til åtte mikroliter av hvert antistoff per lysbilde og bruke Buffer W for å nå et endelig volum på 200 mikroliter. Påfør deretter antistoffet PC oligo-løsningen på lysbildene og inkuber lysbildene over natten ved fire grader Celsius. Etter inkubasjon, legg lysbildene i en fuktet skuff, og vask tre ganger i 10 minutter i 1X TBST.Post-fix i 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av vask to ganger i fem minutter i 1X TBST. Tilsett SYTO 13 kjernefysisk flekk i 15 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av vask to ganger med 1X TBST. Hold musen over datainnsamlingen i kontrollsenteret, og velg Ny eller Fortsett kjøring.Plasser lysbildet i lysbildeholderen med etiketten mot brukeren. Senk glidebrettklemmen, slik at vevet er synlig i det langstrakte vinduet. Legg til seks milliliter buffer S.Følg instruksjonene i kontrollsenteret.Zoom mellom forskjellige akser med x- og y-glidebryterne for å avgrense et område for skanning. Velg Skann, og la skanningen fortsette til hele det definerte målområdet er avbildet. Generer et bilde 20 ganger.Definer avkastningen ved å velge tre like store sirkulære avkastninger med en diameter på 250 mikrometer for hver vevskjerne. Godkjenn avkastningen ved å klikke på Avslutt skannearbeidsområde-knappen. Vent deretter til UV-lyset spalter oligoene fra antistoffene.Når du har fullført rengjøringsinstrumentprosessen, velger du Innsamling av nye data for å fortsette med gjeldende lysbilder eller plate. Åpne det ferdige platevinduet ved å dobbeltklikke på plateikonområdet. Skriv inn hybridiseringskodepakkenummeret, og klikk på Oppdater.Klikk deretter på Fullfør. Koble fra lysbildeholderen og oppsamlingsplaten ved å følge instruksjonene. Oppbevar lysbildene i TBST, eller dekk dem med et vandig medium og dekselslipp for langtidsoppbevaring.Forsegl platene ved hjelp av en permeabel tetning og tørk aspiratene ved 65 grader Celsius i en termisk syklus med toppen åpen. Tilsett syv mikroliter dietylpyrokarbonatbehandlet vann og bland. Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter, og spinn deretter raskt ned.Klargjør sondebufferblandingen ved å velge passende sonde R- og sonde U-ligninger ved å bruke ligningen som beskrevet i tekstprotokollen. Tilsett 84 mikroliter sondebufferblanding til hver hybridiseringskodepakke. I en fersk 96-brønns hybridiseringsplate legger du til åtte mikroliter av hver hybridiseringskodemesterblanding i alle de 12 brønnene i den angitte raden.Overfør syv mikroliter fra DSP-oppsamlingsplaten til den tilsvarende brønnen i hybridiseringsplaten. Varm tetning, spinn platen og inkuber den over natten ved 67 grader Celsius. Etter inkubasjon, avkjøl platen på is, og utfør et raskt spinn.Samle hybridiseringsproduktene fra hver brønn inn i et striperør, forsiktig pipettering hver brønn fem ganger. Spinn ned, og last strimmelrørene inn i analysesystemet. På DSP-instrumentet lagrer du CDF-filen på en USB-stasjon og overfører dataene til den digitale analysatoren.Trykk på Start behandling på skjermen. Velg Høy følsomhet etterfulgt av Neste. Trykk på Velg alle for antall brønner med prøver, deretter Fullfør, etterfulgt av Neste i e-postvarselet.Klikk deretter på Start. Når prep-stasjonen er ferdig, forsegler du kassetten og overfører den til den digitale analysatoren. Trykk på Start telling.Velg Stage Position. Trykk Last inn eksisterende CDF-fil, og velg tidligere opplastet fil. Trykk på Ferdig.Velg Stage Position (Stage Position) på nytt, trykk på Done (Ferdig) og deretter Start for å kjøre programmet. Lagre ZIP-filen til konverteringsfilene for reporterantall fra analysesystemet til en USB-stasjon. Sett stasjonen inn i DSP-maskinen.Hold markøren over Datainnsamling i DSP Control Center, og klikk deretter på Last opp kontoer. Velg den aktuelle ZIP-filen. Klikk på Records i DSP Control Center.Hvis du vil vise skanninger i køen, velger du Legg til valgte skanninger i kø og deretter Min analysekø. Velg Ny studie fra kø ved å holde musepekeren over dataanalysealternativet i kontrollsenteret. DSP-eksperiment ble utført på prøver av glioblastom, og resultatene ble visualisert som et varmekart.Rader representerer proteinmål, og hver kolonne tilsvarer et område av interesse. Uttrykksnivå avbildes av et fargespekter som varierer fra blått, som viser lavt uttrykk, til rødt, som angir høyt uttrykk. Variabilitet av farge i en rad gjenspeiler regional protein heterogenitet, og antyder en mulig romlig tilknytning til differensial proteinuttrykk.I dette eksperimentet var S100 og CD-56 universelt høye, fordi de er nevrale markører. Markører med mest variabilitet inkluderer B7-H3, KI-67, CD-44 og fibronektin, som er kjent for å være assosiert med tumorproliferasjon, migrasjon og metastase. Fra et stort utvalg av kandidatmål kan DSP identifisere de som viser betydelig regional variasjon.Dette legger grunnlaget for å undersøke faktorer knyttet til variabilitet og deres relevans for sykdom.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokoll for Rapid Post mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

I Vivo EPR vurdering av pH, pO2, Redox Status, og konsentrasjoner av fosfat og glutation i svulst Microenvironment

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Evaluering av Biomarkers i Glioma av immunhistokjemi på parafin-Embedded 3D Glioma Neurosphere kulturer

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av Orthotopic bukspyttkjertel svulster og ex vivo karakterisering av tumor-infiltrere T Cell cytotoksisitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse av sidepopulasjon i faste tumorcellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumortransplantasjon for å vurdere dynamikken i tumorinfiltrerende CD8 + T-celler hos mus

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Romlig profilering av protein- og RNA-uttrykk i vev: En tilnærming til finjustering av virtuell mikrodisseksjon

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Live-3D-celle immunocytokjemi analyser av pediatrisk diffus midtlinje gliom

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Industrialisert, kunstig intelligens-guidet lasermikrodesisseksjon for mikroskalert proteomisk analyse av tumormikromiljøet

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed Barcoding bildeanalyse for immunprofilering og romlig kartlegging karakterisering i enkeltcelleanalyse av parafinvevsprøver

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...