Name: digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma
Uploaded: 2022-09-13T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma at JoVE.com

Os autores reconhecem o apoio do Laboratório de Genômica Clínica e Tecnologia Avançada do Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial do Dartmouth Hitchcock Health System. Os autores também reconhecem o Recurso Compartilhado de Patologia no Dartmouth Cancer Center com o NCI Cancer Center Support Grant 5P30 CA023108-37.

O protocolo descrito abaixo segue as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos de Dartmouth-Hitchcock. O consentimento informado foi obtido dos pacientes cujas amostras de tecido foram incluídas neste estudo. Consulte a seção Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes, equipamentos e softwares usados neste protocolo.
1. Preparação de slides17
<ol><li>Recupere ou prepar...

<ol>
	<li>Pedersen, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+patterns+of+lac-z+transfected+human+glioma+cells+in+the+rat+brain.">Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain.</a> International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).</li><li>Iwadate, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+in+glioblastoma+progression.">Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression.</a> Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).</li><li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+and+prognosis+analysis+of+epithelial-mesenchymal+transition+in+glioma.">Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Barthel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+molecular+signature+and+crossroads+with+tumor+microenvironment.">Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).</li><li>Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-apoptosis+mechanisms+in+malignant+gliomas.">Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).</li><li>Berghoff, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death+ligand+1+expression+and+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+glioblastoma.">Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).</li><li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue.">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li><li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling.">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li><li>Garcia-Pardo, M., Calles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-1+NSCLC+therapy+resistance+mechanism.">ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism.</a> Precision Cancer Medicine. , (2021).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+spatial+profiling+of+individual+glomeruli+from+patients+with+anti-neutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+glomerulonephritis.">Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).</li><li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+GeoMx+digital+spatial+profiler.">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456 (2021).</li><li>Brady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-+and+intra-tumor+heterogeneity+of+metastatic+prostate+cancer+determined+by+digital+spatial+gene+expression+profiling.">Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling.</a> Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).</li><li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+digital+spatial+profiling+of+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+patients.">Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients.</a> Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).</li><li>Wang, D. Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study:+Digital+spatial+profiling+of+metastatic+clear+cell+carcinoma+reveals+intra-tumor+heterogeneity+in+epithelial-mesenchymal+gradient.">Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>GeoMx DSP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+slide+preparation+user+manual.">Automated slide preparation user manual.</a> GeoMx DSP. , (2022).</li><li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).</li><li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoadjuvant+versus+adjuvant+ipilimumab+plus+nivolumab+in+macroscopic+stage+III+melanoma.">Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).</li><li>Matthews, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-enriched+hyaluronan+binding+(BEHAB)/brevican+cleavage+in+a+glioma+cell+line+is+mediated+by+a+disintegrin+and+metalloproteinase+with+thrombospondin+motifs+(ADAMTS)+family+member.">Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).</li><li>Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+infiltration+into+central+nervous+system+tissue+in+vitro:+involvement+of+a+metalloprotease.">Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease.</a> Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).</li><li>Beli&#235;n, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-type+1+matrix+metalloprotease+(MT1-MMP)+enables+invasive+migration+of+glioma+cells+in+central+nervous+system+white+matter.">Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter.</a> Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).</li><li>Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+antigens+recognized+by+T+lymphocytes:+At+the+core+of+cancer+immunotherapy.">Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).</li><li>Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+for+cancer+prevention:+a+practical+and+feasible+approach+to+the+cancer+epidemic.">Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Chen, L., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-PD-1/PD-L1+therapy+of+human+cancer:+past,+present,+and+future.">Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-Associated+stromal+cells+stimulate+glioma+malignancy+by+regulating+the+tumor+immune+microenvironment.">Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).</li><li>Ishii, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+characterization+of+the+tumorigenic+&amp;#34;peri-necrotic+niche&amp;#34;+harboring+quiescent+stem-like+tumor+cells+in+glioblastoma.">Histological characterization of the tumorigenic &amp;#34;peri-necrotic niche&amp;#34; harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma.</a> PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).</li><li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments.">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).</li><li>NanoString. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CosMx+Spatial+Molecular+Imager:+True+Single-Cell+In+Situ+Solution.">CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution.</a> NanoString. , (2022).</li></ol>

Dada a diversidade de proteínas que poderiam potencialmente influenciar a agressividade dos gliomas e a noção de que várias dessas proteínas permanecem desconhecidas, um método de quantificação de proteínas de alto rendimento é uma abordagem tecnológica ideal. Além disso, dado que os dados espaciais em amostras oncológicas muitas vezes se correlacionam com a expressão diferencial18, a incorporação do perfil espacial na abordagem de quantificação de proteínas permite uma análise...

Gliomas de infiltração difusa são o tipo mais comum de tumor cerebral maligno em adultos e são invariavelmente letais. A propensão para as células do glioma migrarem extensivamente no cérebro é um grande desafio terapêutico. O mecanismo pelo qual eles se espalham envolve migração dirigida e invasão descontrolada. Demonstrou-se que as células invasivas do glioma exibem tropismo e migração ao longo dos tratos da substância branca1, com pesquisas recentes implicando a desmielinização desses tratos como uma característica ativa e protumorigênica2. A invasão é mediada por uma transição epitelial-mesenquimal, na qual as células do glioma adquirem propriedades mesenquimais, reduzindo a expressão de genes que codificam proteínas da matriz extracelular e moléculas de adesão celular, amplificando a migração e facilitando a propagação através do microambiente tumoral 3,4,5.
No nível molecular, tem sido demonstrada a ruptura de diversas proteínas que conferem estabilidade celular e interface com componentes imunogênicos6. Sabe-se que os gliomas infiltrativos sofrem supressão de proteínas com propriedades antiapoptóticas (por exemplo, PTEN)7. Eles também superexpressam proteínas que promovem a evasão da resposta imune do hospedeiro (por exemplo, PD1/PDL1)8. A desregulação dessas vias complexas aumenta a tumorigenicidade e aumenta o potencial maligno.
Dentro de amostras de glioma invasivo, o objetivo foi avaliar a expressão diferencial de proteínas fundamentais para o crescimento, sobrevivência e proliferação celular, e para a integridade estrutural do microambiente entre componentes invasivos e não invasivos. Além disso, procuramos estudar a regulação diferencial de proteínas com um papel imunogênico ativo, oferecendo informações sobre o mecanismo pelo qual as defesas imunológicas comprometidas do hospedeiro podem aumentar o potencial proliferativo e invasivo dos gliomas. Isso é especialmente relevante, dada a recente amplitude de pesquisas que demonstram como os marcadores imunológicos e os fatores de desregulação na malignidade podem servir como alvos da imunoterapia. A identificação de alvos terapêuticos viáveis entre as muitas proteínas envolvidas na imunovigilância e reatividade requer uma abordagem altamente sensível e abrangente.
Dada a ampla gama de proteínas candidatas que podem ser estudadas, buscamos um método semelhante à imuno-histoquímica, mas com maior eficiência no processamento de dados. Dentro do campo da biologia do câncer, o DSP emergiu como uma tecnologia poderosa com vantagens importantes sobre ferramentas alternativas para análise e quantificação proteômica. A marca registrada do DSP é sua capacidade de multiplexação de alto rendimento, permitindo o estudo simultâneo de várias proteínas diferentes dentro de uma amostra, marcando uma distinção importante das tecnologias padrão, mas de baixo plexo, como a imuno-histoquímica (IHC)9,10. A característica multiplex do DSP não compromete sua fidelidade como ferramenta quantitativa e analítica, como demonstrado por estudos comparando DSP com IHC. Quando usado para quantificação proteômica de espécimes de câncer de pulmão de células não pequenas, por exemplo, o DSP demonstrou ter resultados semelhantes aos da IHC11. Além disso, o DSP oferece especificação regional personalizável, na qual os usuários podem definir manualmente as regiões dentro das quais executar a análise proteômica. Isso apresenta uma vantagem sobre os métodos multiplex de seção inteira10,12. Em uma única rodada de processamento, o DSP oferece várias camadas de análise, pesquisando vários alvos de proteínas em várias regiões de interesse.
DSP tem aplicações em vários contextos patológicos diferentes. A DSP é especialmente vantajosa na análise oncológica, pois a variação espacial pode se correlacionar com a transformação celular e a expressão diferencial de proteínas. Por exemplo, o DSP tem sido usado para comparar o perfil proteômico do câncer de mama com o microambiente tumoral adjacente. Isso traz implicações importantes para a compreensão da história natural desse tumor e sua progressão, bem como para a potencial resposta ao tratamento13. Contextos adicionais que ilustram a versatilidade do DSP incluem quantificação espacial da diversidade proteica no câncer de próstata14, associação da expressão de marcadores de células imunes com a progressão da doença no carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço 15 e demonstração de um gradiente epitelial-mesenquimal de expressão proteica distinguindo o câncer de ovário metastático de células claras primário16 . Ao implementar o DSP, caracterizamos a topografia espacial de proteínas que poderiam impactar a tumorigênese e a invasão de gliomas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BOND Research Detection System</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DS9455</td>
			<td>Open detection system containing open containers in a reagent tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Wash</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>AR950</td>
			<td>10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer W</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 conjugation kit</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>AB188287</td>
			<td>Cy3 fluorescent antibody conjugation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>System for imaging and characterizing protein and RNA targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx DSP Instrument BufferKit</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100471</td>
			<td>Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Hyb Code Pack_Protein</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300401</td>
			<td>Controls for running GeoMX DSP experiemtns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300101</td>
			<td>Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300105</td>
			<td>Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Protein Slide Prep FFPE</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300308</td>
			<td>Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDH1-R132H antibody</td>
			<td>Dianova, Hamburg, Germany</td>
			<td>DIA-H09</td>
			<td>Monoclonal antibody against human IDH1 R132H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Bond RX</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Fully automated IHC stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Kit--12 reactions</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100052</td>
			<td>Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCounter Analysis System</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Master II</td>
			<td>3DHistech Ltd., Budapest, Hungary</td>
			<td></td>
			<td>To create the tissue microarray block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma

Gliomas de infiltração difusa estão associados a alta morbidade e mortalidade devido à natureza infiltrativa da disseminação tumoral. São tumores morfologicamente complexos, com alto grau de variabilidade proteômica tanto no próprio tumor quanto em seu microambiente heterogêneo. O potencial maligno desses tumores é reforçado pela desregulação de proteínas envolvidas em várias vias-chave, incluindo processos que mantêm a estabilidade celular e preservam a integridade estrutural do microambiente. Embora tenha havido numerosas análises de glioma a granel e unicelular, há uma relativa escassez de estratificação espacial desses dados proteômicos. A compreensão das diferenças na distribuição espacial de fatores tumorigênicos e populações de células imunes entre o tumor intrínseco, a borda invasiva e o microambiente oferece informações valiosas sobre os mecanismos subjacentes à proliferação e propagação do tumor. O perfil espacial digital (DSP) representa uma tecnologia poderosa que pode formar a base para essas importantes análises multicamadas.
O DSP é um método que quantifica eficientemente a expressão de proteínas dentro de regiões espaciais especificadas pelo usuário em uma amostra de tecido. O DSP é ideal para estudar a expressão diferencial de múltiplas proteínas dentro e entre regiões de distinção, permitindo múltiplos níveis de análise quantitativa e qualitativa. O protocolo DSP é sistemático e fácil de usar, permitindo a análise espacial personalizada de dados proteômicos. Neste experimento, microarranjos teciduais são construídos a partir de biópsias de núcleo de glioblastoma arquivadas. Em seguida, um painel de anticorpos é selecionado, visando proteínas de interesse dentro da amostra. Os anticorpos, que são pré-conjugados a oligonucleotídeos de DNA UV-fotoclevíveis, são então incubados com a amostra de tecido durante a noite. Sob a visualização por microscopia de fluorescência dos anticorpos, as regiões de interesse (ROIs) dentro das quais quantificar a expressão proteica são definidas com as amostras. A luz UV é então direcionada para cada ROI, clivando os oligonucleotídeos do DNA. Os oligonucleotídeos são microaspirados e contados dentro de cada ROI, quantificando a proteína correspondente em uma base espacial.

A Figura 4 mostra os resultados representativos de um experimento de DSP realizado em amostras de glioblastoma. Um mapa de calor é apresentado, ilustrando um dos métodos pelos quais capturar dados visualmente usando o software DSP. As linhas representam alvos proteicos e cada coluna corresponde a uma região de interesse. Um intervalo de cores de azul a vermelho denota expressão baixa a alta, respectivamente. A variabilidade da cor dentro de uma linha reflete a heterogeneidade da proteín...

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Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

A desregulação proteômica desempenha um papel importante na disseminação de gliomas difusos infiltrantes, mas várias proteínas relevantes permanecem não identificadas. O processamento espacial digital (DSP) oferece uma abordagem eficiente e de alto rendimento para caracterizar a expressão diferencial de proteínas candidatas que podem contribuir para a invasão e migração de gliomas infiltrativos.

Perfil Espacial Digital para Caracterização do Microambiente em Glioma Infiltrante Difuso do Tipo Adulto

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

O Digital Spatial Profiling, ou DSP, oferece um método eficiente para quantificação de proteínas estratificadas espacialmente. Sua implementação nos permite caracterizar a expressão de proteínas em regiões distintas de um tumor e do microambiente. Uma característica fundamental do DSP é sua capacidade de multiplexação, permitindo o processamento de dados de alta taxa de transferência.A capacidade de definir regiões personalizadas de interesse também fornece uma dimensão espacial para a análise de dados. O DSP pode ser aplicado a qualquer amostra em que a proteína quantificadora espacial ou a expressão de RNA possam ajudar a elucidar um processo patológico ou fisiológico. Isso é especialmente relevante em oncologia, onde a variabilidade do alvo regional pode se correlacionar com o crescimento maligno ou invasão.Demonstrando o procedimento estarão Scott Palisoul, histotecnólogo, e Rachael Barney, tecnóloga genômica. Para preparar lâminas, comece pegando vários núcleos de dois milímetros de cada biópsia e colocando-os em um único bloco de microarray de tecido. Corte seções de quatro mícrons do bloco e monte-as em lâminas de vidro.Coloque cada lâmina dentro da junta do suporte da lâmina e incube-a a 60 graus Celsius por 30 minutos. No sistema IHC semi-automatizado, encha o recipiente na posição um com 150 microlitros de tampão de lavagem por lâmina, além de cinco mililitros de volume morto, e deixe a tampa aberta. Encha a mesma quantidade de solução de bloqueio no recipiente na posição dois.Carregue a bandeja do recipiente do reagente na máquina. Selecione o IHC de processo, seguido pelo nome da solução de bloqueio na caixa suspensa do campo Marcador. Uma vez terminado para todos os slides, clique em Fechar.Em seguida, clique em Imprimir etiquetas e marque Todas as etiquetas de slide ainda não impressas e clique em Imprimir. Afixe etiquetas na parte superior dos slides. Carregue os slides na bandeja deslizante, garantindo que a amostra e o rótulo estejam voltados para cima.Pressione o botão LED para abaixar a bandeja e permitir que o instrumento inicie a digitalização e o reconhecimento de slides. Clique no botão Iniciar para iniciar o experimento. Quando a execução estiver concluída, pressione o botão LED quando ele piscar em verde.Remova a bandeja do instrumento e levante cuidadosamente as telhas da tampa de cada slide. Coloque as lâminas na solução salina tamponada com fosfato 1X. Remova o excesso de tampão e contorne cada seção de tecido com uma caneta hidrofóbica para criar uma barreira hidrofóbica.Faça uma solução de anticorpo PC oligo adicionando oito microlitros de cada anticorpo por lâmina e usando o tampão W para atingir um volume final de 200 microlitros. Em seguida, aplique a solução de anticorpo PC oligo nas lâminas e incube as lâminas durante a noite a quatro graus Celsius. Após a incubação, coloque as lâminas em uma bandeja umidificada e lave três vezes por 10 minutos em 1X TBST.Pós-fixação em paraformaldeído a 4% por 30 minutos à temperatura ambiente, seguida de lavagem duas vezes por cinco minutos em TBST 1X. Adicione a mancha nuclear SYTO 13 por 15 minutos à temperatura ambiente, seguida de lavagem duas vezes com 1X TBST. Passe o mouse sobre a Coleta de Dados na Central de Controle e selecione Novo ou Continuar Executar.Coloque o slide no suporte do slide com o rótulo em direção ao usuário. Abaixe a braçadeira da bandeja deslizante, garantindo que o tecido esteja visível na janela alongada. Adicione seis mililitros de Buffer S.Siga as instruções no Centro de Controle.Aplique zoom entre diferentes eixos com os controles deslizantes x e y para delinear uma região para digitalização. Selecione Digitalizar e permita que a varredura prossiga até que toda a área de destino definida tenha sido visualizada. Gere uma imagem 20 vezes.Defina os ROIs selecionando três ROIs circulares de tamanho igual de um diâmetro de 250 micrômetros para cada núcleo de tecido. Aprove os ROIs clicando no botão Sair do Espaço de Trabalho de Digitalização. Em seguida, espere que a luz UV colha os oligos dos anticorpos.Depois de concluir o processo do instrumento de limpeza, selecione Nova coleta de dados para continuar com os slides ou a placa atuais. Abra a janela da placa finalizada clicando duas vezes na área do ícone da placa. Insira o número de lote do pacote de código de hibridização e clique em Atualizar.Em seguida, clique em Finalizar. Desprenda o suporte do slide e a placa de coleta seguindo as instruções. Guarde as lâminas em TBST ou cubra-as com um meio aquoso e cubra o deslizamento para armazenamento a longo prazo.Selar as placas usando uma vedação permeável e secar os aspirados a 65 graus Celsius em um termociclador com o topo aberto. Adicione sete microlitros de água tratada com pirocarbonato de dietilo e misture. Incube à temperatura ambiente durante 10 minutos e, em seguida, gire para baixo rapidamente.Prepare a mistura de buffer da sonda escolhendo as equações R e U da sonda apropriadas aplicando a equação conforme descrito no protocolo de texto. Adicione 84 microlitros de mistura de buffer de sonda a cada pacote de código de hibridização. Em uma nova placa de hibridização de 96 poços, adicione oito microlitros de cada mistura mestre de código de hibridização em todos os 12 poços da linha indicada.Transfira sete microlitros da placa de coleta DSP para o poço correspondente na placa de hibridização. Sele o calor, gire a placa e incube-a durante a noite a 67 graus Celsius. Após a incubação, resfrie a placa no gelo e realize um giro rápido.Junte os produtos de hibridização de cada poço em um tubo de tira, pipetando suavemente cada poço cinco vezes. Gire para baixo e carregue os tubos da tira no sistema de análise. No instrumento DSP, salve o arquivo CDF em uma unidade USB e transfira os dados para o analisador digital.Na tela, pressione Iniciar processamento. Selecione Alta sensibilidade seguida de Avançar. Pressione Select All para o número de poços com amostras e, em seguida, Finish, seguido por Next na notificação por email.Em seguida, clique em Iniciar. Uma vez que a estação de preparação esteja pronta, sele o cartucho e transfira-o para o analisador digital. Pressione Start Counting.Selecione Posição do palco. Pressione Load Existing CDF file (Carregar arquivo CDF existente) e selecione o arquivo carregado anteriormente. Pressione Concluído.Selecione Posição do Palco novamente, pressione Concluído e Iniciar para executar o programa. Salve o arquivo ZIP dos arquivos de conversão de contagem do repórter do sistema de análise em uma unidade USB. Insira a unidade na máquina DSP.No Centro de Controle de DSP, passe o mouse sobre Coleta de Dados e clique em Carregar Contas. Selecione o arquivo ZIP relevante. Clique em Registros no Centro de Controle DSP.Para exibir varreduras na fila, selecione Adicionar varreduras selecionadas à fila e, em seguida, Minha fila de análise. Selecione Novo Estudo na Fila passando o mouse sobre a opção Análise de Dados na Central de Controle. O experimento de DSP foi realizado em amostras de glioblastoma, e os resultados foram visualizados como um mapa de calor.As linhas representam alvos proteicos e cada coluna corresponde a uma região de interesse. O nível de expressão é representado por um intervalo de cores que varia de azul, mostrando expressão baixa, a vermelho, que denota alta expressão. A variabilidade da cor dentro de uma linha reflete a heterogeneidade da proteína regional e sugere uma possível associação espacial com a expressão diferencial de proteínas.Neste experimento, S100 e CD-56 foram universalmente altos, porque são marcadores neurais. Os marcadores com maior variabilidade incluem B7-H3, KI-67, CD-44 e fibronectina, que são conhecidos por estarem associados à proliferação, migração e metástase tumorais. A partir de uma vasta gama de alvos candidatos, o DSP pode identificar aqueles que exibem variação regional significativa.Isso estabelece as bases para investigar fatores associados à variabilidade e sua relevância para a doença.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Pesquisa do câncer

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

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Na Vivo Avaliação de EPR de pH, pO2, Status Redox e as concentrações de fosfato e glutationa no microambiente do Tumor

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

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Avaliação de biomarcadores em Glioma por imuno-histoquímica na parafina Glioma 3D Neurosphere culturas

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Microdisseção laser industrializada e guiada por inteligência artificial para análise proteômica microescalada do Microambiente tumoral

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Análise de Imagem de Código de Barras Multiplexado para Caracterização de Imunoprofiling e Mapeamento Espacial na Análise Unicelular de Amostras de Parafina

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...