Name: digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma
Uploaded: 2022-09-13T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma at JoVE.com

Авторы признают поддержку Лаборатории клинической геномики и передовых технологий в отделе патологии и лабораторной медицины системы здравоохранения Дартмута Хичкока. Авторы также признают общий ресурс патологии в Дартмутском онкологическом центре с грантом поддержки онкологического центра NCI 5P30 CA023108-37.

Протокол, изложенный ниже, соответствует руководящим принципам Комитета по этике исследований человека Дартмута-Хичкока. Информированное согласие было получено от пациентов, чьи образцы тканей были включены в это исследование. В разделе Таблица материалов приведены подробные</str...

<ol>
	<li>Pedersen, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+patterns+of+lac-z+transfected+human+glioma+cells+in+the+rat+brain.">Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain.</a> International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).</li><li>Iwadate, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+in+glioblastoma+progression.">Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression.</a> Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).</li><li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+and+prognosis+analysis+of+epithelial-mesenchymal+transition+in+glioma.">Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Barthel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+molecular+signature+and+crossroads+with+tumor+microenvironment.">Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).</li><li>Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-apoptosis+mechanisms+in+malignant+gliomas.">Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).</li><li>Berghoff, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death+ligand+1+expression+and+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+glioblastoma.">Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).</li><li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue.">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li><li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling.">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li><li>Garcia-Pardo, M., Calles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-1+NSCLC+therapy+resistance+mechanism.">ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism.</a> Precision Cancer Medicine. , (2021).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+spatial+profiling+of+individual+glomeruli+from+patients+with+anti-neutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+glomerulonephritis.">Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).</li><li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+GeoMx+digital+spatial+profiler.">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456 (2021).</li><li>Brady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-+and+intra-tumor+heterogeneity+of+metastatic+prostate+cancer+determined+by+digital+spatial+gene+expression+profiling.">Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling.</a> Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).</li><li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+digital+spatial+profiling+of+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+patients.">Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients.</a> Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).</li><li>Wang, D. Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study:+Digital+spatial+profiling+of+metastatic+clear+cell+carcinoma+reveals+intra-tumor+heterogeneity+in+epithelial-mesenchymal+gradient.">Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>GeoMx DSP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+slide+preparation+user+manual.">Automated slide preparation user manual.</a> GeoMx DSP. , (2022).</li><li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).</li><li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoadjuvant+versus+adjuvant+ipilimumab+plus+nivolumab+in+macroscopic+stage+III+melanoma.">Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).</li><li>Matthews, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-enriched+hyaluronan+binding+(BEHAB)/brevican+cleavage+in+a+glioma+cell+line+is+mediated+by+a+disintegrin+and+metalloproteinase+with+thrombospondin+motifs+(ADAMTS)+family+member.">Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).</li><li>Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+infiltration+into+central+nervous+system+tissue+in+vitro:+involvement+of+a+metalloprotease.">Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease.</a> Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).</li><li>Beli&#235;n, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-type+1+matrix+metalloprotease+(MT1-MMP)+enables+invasive+migration+of+glioma+cells+in+central+nervous+system+white+matter.">Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter.</a> Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).</li><li>Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+antigens+recognized+by+T+lymphocytes:+At+the+core+of+cancer+immunotherapy.">Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).</li><li>Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+for+cancer+prevention:+a+practical+and+feasible+approach+to+the+cancer+epidemic.">Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Chen, L., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-PD-1/PD-L1+therapy+of+human+cancer:+past,+present,+and+future.">Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-Associated+stromal+cells+stimulate+glioma+malignancy+by+regulating+the+tumor+immune+microenvironment.">Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).</li><li>Ishii, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+characterization+of+the+tumorigenic+&amp;#34;peri-necrotic+niche&amp;#34;+harboring+quiescent+stem-like+tumor+cells+in+glioblastoma.">Histological characterization of the tumorigenic &amp;#34;peri-necrotic niche&amp;#34; harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma.</a> PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).</li><li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments.">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).</li><li>NanoString. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CosMx+Spatial+Molecular+Imager:+True+Single-Cell+In+Situ+Solution.">CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution.</a> NanoString. , (2022).</li></ol>

Учитывая разнообразие белков, которые потенциально могут влиять на агрессивность глиом, и представление о том, что некоторые из этих белков остаются неоткрытыми, высокопроизводительный метод количественной оценки белка является идеальным технологическим подходом. Кроме того, учитыв...

Диффузно инфильтрирующие глиомы являются наиболее распространенным типом злокачественной опухоли головного мозга у взрослых и неизменно летальны. Склонность клеток глиомы к обширной миграции в мозге является серьезной терапевтической проблемой. Механизм, с помощью которого они распространяются, включает в себя направленную миграцию и неконтролируемое вторжение. Было показано, что инвазивные клетки глиомы демонстрируют тропизм и миграцию вдоль трактов белого вещества1, причем недавние исследования предполагают демиелинизацию этих путей в качестве активного протуморигенного признака2. Инвазия опосредована эпителиально-мезенхимальным переходом, при котором клетки глиомы приобретают мезенхимальные свойства за счет снижения экспрессии генов, кодирующих белки внеклеточного матрикса и молекул клеточной адгезии, усиливая миграцию и облегчая распространение через микроокружение опухоли 3,4,5.
На молекулярном уровне было продемонстрировано нарушение работы нескольких белков, которые придают клеточную стабильность и взаимодействие с иммуногенными компонентами6. Инфильтративные глиомы, как известно, подвергаются подавлению белков с антиапоптотическими (например, PTEN) свойствами7. Они также сверхэкспрессируют белки, которые способствуют уклонению иммунного ответа хозяина (например, PD1 / PDL1)8. Дисрегуляция этих сложных путей усиливает опухолегенность и повышает злокачественный потенциал.
В образцах инвазивной глиомы цель состояла в том, чтобы оценить дифференциальную экспрессию белков, имеющих ключевое значение для роста, выживания и пролиферации клеток, а также для структурной целостности микросреды между инвазивными и неинвазивными компонентами. Кроме того, мы стремились изучить дифференциальную регуляцию белков с активной иммуногенной ролью, предлагая понимание механизма, с помощью которого скомпрометированная иммунная защита хозяина может усиливать пролиферативный и инвазивный потенциал глиом. Это особенно актуально, учитывая недавнюю широту исследований, демонстрирующих, как иммунные маркеры и драйверы дисрегуляции злокачественных новообразований могут служить мишенями иммунотерапии. Определение жизнеспособных терапевтических мишеней среди многих белков, участвующих в иммунонадзоре и реактивности, требует высокочувствительного и комплексного подхода.
Учитывая широкий спектр белков-кандидатов, которые могут быть изучены, мы искали метод, похожий на иммуногистохимию, но с повышенной эффективностью обработки данных. В области биологии рака DSP стала мощной технологией с важными преимуществами по сравнению с альтернативными инструментами для протеомного анализа и количественной оценки. Отличительной чертой DSP является его высокопроизводительная мультиплексирующая способность, позволяющая одновременно изучать несколько различных белков в образце, отмечая важное отличие от стандартных, но низкоплексных технологий, таких как иммуногистохимия (IHC)9,10. Мультиплексная особенность DSP не ставит под угрозу его точность как количественного и аналитического инструмента, как показали исследования, сравнивающие DSP с IHC. При использовании для протеомной количественной оценки образцов немелкоклеточного рака легкого, например, было показано, что DSP имеет результаты, аналогичные IHC11. Кроме того, DSP предлагает настраиваемую региональную спецификацию, в которой пользователи могут вручную определять области, в которых выполняется протеомный анализ. Это представляет собой преимущество перед методами мультиплексирования всего сечения10,12. Таким образом, в одном раунде обработки DSP предлагает несколько уровней анализа, исследуя несколько белковых мишеней в нескольких областях, представляющих интерес.
DSP имеет применение в нескольких различных патологических условиях. DSP особенно выгоден в онкологическом анализе, так как пространственная изменчивость может коррелировать с клеточной трансформацией и дифференциальной экспрессией белка. Например, DSP был использован для сравнения протеомного профиля рака молочной железы с соседним микроокружением опухоли. Это имеет важные последствия для понимания естественной истории этой опухоли и ее прогрессирования, а также потенциального ответа на лечение13. Дополнительные контексты, иллюстрирующие универсальность DSP, включают пространственную количественную оценку разнообразия белков при раке предстательной железы14, связь экспрессии маркера иммунных клеток с прогрессированием заболевания при плоскоклеточном раке головы и шеи15 и демонстрацию эпителиально-мезенхимального градиента экспрессии белка, отличающего метастатический рак яичников от первичного чистоклеточного рака яичников16 . Реализуя DSP, мы характеризуем пространственную топографию белков, которые могут влиять на опухолевыйгенез и инвазию глиом.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BOND Research Detection System</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DS9455</td>
			<td>Open detection system containing open containers in a reagent tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Wash</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>AR950</td>
			<td>10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer W</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 conjugation kit</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>AB188287</td>
			<td>Cy3 fluorescent antibody conjugation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>System for imaging and characterizing protein and RNA targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx DSP Instrument BufferKit</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100471</td>
			<td>Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Hyb Code Pack_Protein</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300401</td>
			<td>Controls for running GeoMX DSP experiemtns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300101</td>
			<td>Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300105</td>
			<td>Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Protein Slide Prep FFPE</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300308</td>
			<td>Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDH1-R132H antibody</td>
			<td>Dianova, Hamburg, Germany</td>
			<td>DIA-H09</td>
			<td>Monoclonal antibody against human IDH1 R132H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Bond RX</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Fully automated IHC stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Kit--12 reactions</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100052</td>
			<td>Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCounter Analysis System</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Master II</td>
			<td>3DHistech Ltd., Budapest, Hungary</td>
			<td></td>
			<td>To create the tissue microarray block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma

Диффузно инфильтрирующие глиомы связаны с высокой заболеваемостью и смертностью из-за инфильтративного характера распространения опухоли. Они представляют собой морфологически сложные опухоли с высокой степенью протеомной изменчивости как в самой опухоли, так и в ее гетерогенном микроокружении. Злокачественный потенциал этих опухолей усиливается дисрегуляцией белков, участвующих в нескольких ключевых путях, включая процессы, которые поддерживают клеточную стабильность и сохраняют структурную целостность микросреды. Хотя было проведено множество объемных и одноклеточных анализов глиомы, существует относительная нехватка пространственной стратификации этих протеомных данных. Понимание различий в пространственном распределении опухолевых факторов и популяций иммунных клеток между внутренней опухолью, инвазивным краем и микроокружением дает ценную информацию о механизмах, лежащих в основе пролиферации и распространения опухоли. Цифровое пространственное профилирование (DSP) представляет собой мощную технологию, которая может стать основой для этих важных многослойных анализов.
DSP - это метод, который эффективно количественно определяет экспрессию белка в заданных пользователем пространственных областях в образце ткани. DSP идеально подходит для изучения дифференциальной экспрессии нескольких белков внутри и между регионами различия, обеспечивая несколько уровней количественного и качественного анализа. Протокол DSP является систематическим и удобным для пользователя, что позволяет проводить индивидуальный пространственный анализ протеомных данных. В этом эксперименте тканевые микрочипы строятся из архивных биопсий ядра глиобластомы. Затем выбирается панель антител, нацеленных на интересующие белки в образце. Антитела, которые предварительно конъюгируются с Олигонуклеотидами УФ-фоторасщепления ДНК, затем инкубируются с образцом ткани в течение ночи. При флуоресцентной микроскопии визуализации антител с образцами определяются области интереса (ROI), в пределах которых можно количественно оценить экспрессию белка. Затем ультрафиолетовый свет направляется на каждый ROI, расщепляя ДНК олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды микроаспирируются и подсчитываются в пределах каждого ROI, количественно оценивая соответствующий белок на пространственной основе.

На рисунке 4 показаны репрезентативные результаты эксперимента DSP, проведенного на образцах глиобластомы. Представлена тепловая карта, иллюстрирующая один из методов визуального сбора данных с помощью программного обеспечения DSP. Строки представляют белковые мишени, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma at JoVE.com

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Протеомная дисрегуляция играет важную роль в распространении диффузно инфильтрирующих глиом, но несколько соответствующих белков остаются неидентифицированными. Цифровая пространственная обработка (DSP) предлагает эффективный, высокопроизводительный подход для характеристики дифференциальной экспрессии белков-кандидатов, которые могут способствовать инвазии и миграции инфильтративных глиом.

Цифровое пространственное профилирование для характеристики микросреды при диффузно проникающей глиоме взрослого типа

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

Цифровое пространственное профилирование, или DSP, предлагает эффективный метод пространственно стратифицированной количественной оценки белка. Его реализация позволяет нам охарактеризовать экспрессию белка в различных областях опухоли и микроокружении. Ключевой особенностью DSP является возможность мультиплексирования, обеспечивающая высокую пропускную способность обработки данных.Возможность определения настраиваемых областей, представляющих интерес, дополнительно обеспечивает пространственное измерение для анализа данных. DSP может быть применен к любому образцу, в котором пространственная количественная оценка белка или экспрессия РНК могут помочь прояснить патологический или физиологический процесс. Это особенно актуально в онкологии, где региональная вариабельность мишеней может коррелировать со злокачественным ростом или инвазией.Продемонстрировать процедуру будут Скотт Палисул, гистотехнолог, и Рэйчел Барни, геномный технолог. Чтобы подготовить слайды, начните с того, что возьмите несколько двухмиллиметровых ядер из каждой биопсии и поместите их в один блок микрочипов ткани. Вырежьте четырехмикронные секции из блока и прикрепите их к стеклянным слайдам.Поместите каждый слайд в прокладку держателя слайда и высиживайте его при температуре 60 градусов Цельсия в течение 30 минут. В полуавтоматической системе IHC заполните контейнер в положении один со 150 микролитрами буфера для стирки на слайд, плюс пять миллилитров мертвого объема и оставьте крышку открытой. Заполните такое же количество блокирующего раствора в контейнере во второй позиции.Загрузите лоток контейнера с реагентами на машину. Выберите Обрабатывать IHC, а затем имя блокирующего решения в раскрывающемся списке поля Маркер. После завершения для всех слайдов нажмите кнопку Закрыть.Затем нажмите «Печать этикеток», установите флажок «Все наклейки на слайдах», которые еще не напечатаны, и нажмите «Печать». Прикрепите метки к верхней части слайдов. Загрузите слайды в лоток для слайдов, убедившись, что образец и этикетка обращены вверх.Нажмите светодиодную кнопку, чтобы опустить лоток, и позвольте инструменту начать сканирование и распознавание слайдов. Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать эксперимент. Когда запуск будет завершен, нажмите светодиодную кнопку, когда она мигает зеленым цветом.Снимите лоток с инструмента и осторожно поднимите крышку плитки с каждого слайда. Поместите слайды в 1X фосфатный буферизованный физиологический раствор. Удалите лишний буфер и очертите каждый участок ткани гидрофобной ручкой, чтобы создать гидрофобный барьер.Сделайте раствор олиго антитела PC, добавив восемь микролитров каждого антитела на слайд и используя Buffer W для достижения конечного объема в 200 микролитров. Затем нанесите раствор олиго антитела PC на слайды и инкубируйте слайды в течение ночи при четырех градусах Цельсия. После инкубации поместите горки в увлажненный лоток и трижды промойте в течение 10 минут в 1X TBST.Постфиксируют в 4% параформальдегиде в течение 30 минут при комнатной температуре с последующей промывкой дважды в течение пяти минут в 1X TBST. Добавьте ядерное пятно SYTO 13 в течение 15 минут при комнатной температуре, затем дважды промывьте 1X TBST. Наведите указатель мыши на Сбор данных в Центре управления и выберите Создать или Продолжить выполнение.Поместите слайд в держатель слайда с меткой к пользователю. Опустите зажим скользящего лотка, следя за тем, чтобы ткань была видна в удлиненном окне. Добавьте шесть миллилитров Buffer S.Следуйте инструкциям в Центре управления.Увеличьте масштаб между различными осями с помощью ползунков x и y, чтобы очертить область для сканирования. Выберите Сканировать и разрешите сканирование продолжаться до тех пор, пока не будет получена визуализирована вся определенная целевая область. Сгенерируйте 20-кратное изображение.Определите рентабельность инвестиций, выбрав три круглых ROI одинакового размера диаметром 250 микрометров для каждого ядра ткани. Подтвердите окупаемость инвестиций, нажав кнопку Выход из рабочей области сканирования. Затем подождите, пока ультрафиолетовый свет расщепляет олиго от антител.После завершения процесса очистки прибора выберите Сбор новых данных, чтобы продолжить работу с текущими слайдами или пластиной. Откройте оконченное окно пластины, дважды щелкнув область значка пластины. Введите номер партии пакета кода гибридизации и нажмите «Обновить».Затем нажмите «Завершить». Отсоедините держатель слайда и пластину сбора, следуя инструкциям. Храните слайды в TBST или накройте их водной средой и накройте крышкой для длительного хранения.Запечатайте пластины с помощью проницаемого уплотнения и высушите аспираты при 65 градусах Цельсия в термоциклере с открытым верхом. Добавьте семь микролитров воды, обработанной диэтилпирокарбонатом, и перемешайте. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем быстро раскрутить.Подготовьте буферную смесь зонда, выбрав соответствующие уравнения R и U зонда, применяя уравнение, как описано в текстовом протоколе. Добавьте 84 микролитра буферной смеси зонда в каждый пакет кода гибридизации. В свежей 96-луночной гибридизационной пластине добавьте восемь микролитров каждой основной смеси кода гибридизации во все 12 скважин указанного ряда.Перенесите семь микролитров с коллекторной пластины DSP в соответствующую скважину в пластине гибридизации. Нагрейте уплотнение, раскрутите пластину и высиживайте ее в течение ночи при температуре 67 градусов по Цельсию. После инкубации охладите пластину на льду, и выполните быстрое вращение.Объедините продукты гибридизации из каждой скважины в ленточную трубу, аккуратно пипетировав каждую скважину пять раз. Открутите вниз и загрузите ленточные трубки в систему анализа. На приборе DSP сохраните CDF-файл на USB-накопитель и передайте данные на цифровой анализатор.На экране нажмите Начать обработку. Выберите Высокая чувствительность, а затем Далее. Нажмите Выбрать все для количества скважин с образцами, затем Готово, а затем Далее в уведомлении по электронной почте.Затем нажмите кнопку Пуск. Как только подготовительная станция будет готова, запечатайте картридж и перенесите его на цифровой анализатор. Нажмите Начать подсчет.Выберите Позиция сцены. Нажмите Загрузить существующий CDF-файл и выберите ранее загруженный файл. Нажмите Готово.Снова выберите Положение рабочей области, нажмите Готово, а затем Пуск, чтобы запустить программу. Сохраните ZIP-файл файлов преобразования счетчика репортеров из системы анализа на USB-накопитель. Вставьте диск в устройство DSP.В Центре управления DSP наведите указатель мыши на пункт Сбор данных и выберите команду Отправить учетные записи. Выберите соответствующий ZIP-файл. Щелкните Записи в Центре управления DSP.Чтобы просмотреть проверки в очереди, выберите Добавить выбранные проверки в очередь, а затем Моя очередь анализа. Выберите Новое исследование из очереди, наведя указатель мыши на параметр Анализ данных в Центре управления. Эксперимент DSP проводился на образцах глиобластомы, и результаты визуализировались в виде тепловой карты.Строки представляют белковые мишени, и каждый столбец соответствует интересующей области. Уровень выражения изображается цветовым диапазоном, варьирующимся от синего, показывающего низкую экспрессию, до красного, который обозначает высокое выражение. Изменчивость цвета в пределах ряда отражает региональную гетерогенность белка и предполагает возможную пространственную связь с дифференциальной экспрессией белка.В этом эксперименте S100 и CD-56 были повсеместно высокими, потому что они являются нейронными маркерами. Маркеры с наибольшей вариабельностью включают B7-H3, KI-67, CD-44 и фибронектин, которые, как известно, связаны с пролиферацией опухоли, миграцией и метастазированием. Из широкого спектра целей-кандидатов DSP может идентифицировать те, которые демонстрируют значительные региональные различия.Это закладывает основу для исследования факторов, связанных с изменчивостью и их отношением к заболеванию.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Протокол для быстрой Посмертное культуре клеток диффузной Характеристическая Понтийской глиомы (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

В естественных условиях ЭПР Оценка рН, pO2, окислительно-восстановительного состояния и концентрации фосфатов и глутатиона в микроокружения опухоли

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Оценка биомаркеров в глиомы, иммуногистохимия на парафин врезанных 3D глиомы нейросферы культур

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Поколение ортотопических опухолей поджелудочной железы и Ex vivo Характеристика опухоли-проникновения T клеточной цитотоксичности

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Анализ боковой популяции в линиях солидных опухолевых клеток

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Трансплантация опухоли для оценки динамики инфильтрирующих опухоль CD8+ Т-клеток у мышей

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Пространственное профилирование экспрессии белка и РНК в тканях: подход к тонкой настройке виртуальной микродиссекции

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Иммуноцитохимический анализ живых 3D-клеток диффузной срединной глиомы у детей

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Индустриализированная лазерная микродиссекция с искусственным интеллектом для микромасштабированного протеомного анализа микроокружения опухоли

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Мультиплексный анализ изображений штрих-кодирования для иммунопрофилирования и пространственного картирования при одноклеточном анализе образцов парафиновой ткани

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...