Name: digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma
Uploaded: 2022-09-13T12:50:00
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Los autores reconocen el apoyo del Laboratorio de Genómica Clínica y Tecnología Avanzada del Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio del Sistema de Salud Dartmouth Hitchcock. Los autores también reconocen el Recurso Compartido de Patología en el Centro Oncológico de Dartmouth con la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico del NCI 5P30 CA023108-37.

El protocolo descrito a continuación sigue las pautas del Comité de Ética de Investigación Humana de Dartmouth-Hitchcock. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes cuyas muestras de tejido fueron incluidas en este estudio. Consulte la sección Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos, equipos y software utilizados en este protocolo.
1. Preparación de la diapositiva17
...

<ol>
	<li>Pedersen, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+patterns+of+lac-z+transfected+human+glioma+cells+in+the+rat+brain.">Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain.</a> International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).</li><li>Iwadate, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+in+glioblastoma+progression.">Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression.</a> Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).</li><li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+and+prognosis+analysis+of+epithelial-mesenchymal+transition+in+glioma.">Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Barthel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+molecular+signature+and+crossroads+with+tumor+microenvironment.">Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).</li><li>Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-apoptosis+mechanisms+in+malignant+gliomas.">Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).</li><li>Berghoff, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death+ligand+1+expression+and+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+glioblastoma.">Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).</li><li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue.">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li><li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling.">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li><li>Garcia-Pardo, M., Calles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-1+NSCLC+therapy+resistance+mechanism.">ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism.</a> Precision Cancer Medicine. , (2021).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+spatial+profiling+of+individual+glomeruli+from+patients+with+anti-neutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+glomerulonephritis.">Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).</li><li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+GeoMx+digital+spatial+profiler.">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456 (2021).</li><li>Brady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-+and+intra-tumor+heterogeneity+of+metastatic+prostate+cancer+determined+by+digital+spatial+gene+expression+profiling.">Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling.</a> Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).</li><li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+digital+spatial+profiling+of+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+patients.">Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients.</a> Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).</li><li>Wang, D. Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study:+Digital+spatial+profiling+of+metastatic+clear+cell+carcinoma+reveals+intra-tumor+heterogeneity+in+epithelial-mesenchymal+gradient.">Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>GeoMx DSP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+slide+preparation+user+manual.">Automated slide preparation user manual.</a> GeoMx DSP. , (2022).</li><li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).</li><li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoadjuvant+versus+adjuvant+ipilimumab+plus+nivolumab+in+macroscopic+stage+III+melanoma.">Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).</li><li>Matthews, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-enriched+hyaluronan+binding+(BEHAB)/brevican+cleavage+in+a+glioma+cell+line+is+mediated+by+a+disintegrin+and+metalloproteinase+with+thrombospondin+motifs+(ADAMTS)+family+member.">Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).</li><li>Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+infiltration+into+central+nervous+system+tissue+in+vitro:+involvement+of+a+metalloprotease.">Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease.</a> Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).</li><li>Beli&#235;n, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-type+1+matrix+metalloprotease+(MT1-MMP)+enables+invasive+migration+of+glioma+cells+in+central+nervous+system+white+matter.">Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter.</a> Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).</li><li>Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+antigens+recognized+by+T+lymphocytes:+At+the+core+of+cancer+immunotherapy.">Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).</li><li>Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+for+cancer+prevention:+a+practical+and+feasible+approach+to+the+cancer+epidemic.">Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Chen, L., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-PD-1/PD-L1+therapy+of+human+cancer:+past,+present,+and+future.">Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-Associated+stromal+cells+stimulate+glioma+malignancy+by+regulating+the+tumor+immune+microenvironment.">Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).</li><li>Ishii, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+characterization+of+the+tumorigenic+&amp;#34;peri-necrotic+niche&amp;#34;+harboring+quiescent+stem-like+tumor+cells+in+glioblastoma.">Histological characterization of the tumorigenic &amp;#34;peri-necrotic niche&amp;#34; harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma.</a> PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).</li><li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments.">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).</li><li>NanoString. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CosMx+Spatial+Molecular+Imager:+True+Single-Cell+In+Situ+Solution.">CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution.</a> NanoString. , (2022).</li></ol>

Dada la diversidad de proteínas que podrían influir potencialmente en la agresividad de los gliomas y la noción de que varias de estas proteínas permanecen sin descubrir, un método de cuantificación de proteínas de alto rendimiento es un enfoque tecnológico ideal. Además, dado que los datos espaciales en muestras oncológicas a menudo se correlacionan con la expresión diferencial18, la incorporación del perfil espacial en el enfoque de cuantificación de proteínas permite un análisis ...

Los gliomas infiltrantes difusamente son el tipo más común de tumor cerebral maligno en adultos y son invariablemente letales. La propensión de las células de glioma a migrar extensamente en el cerebro es un desafío terapéutico importante. El mecanismo por el cual se propagan implica la migración dirigida y la invasión sin control. Se ha demostrado que las células de glioma invasivo exhiben tropismo y migración a lo largo de los tractos de sustancia blanca1, con investigaciones recientes que implican la desmielinización de estos tractos como una característica activa y protumorigénica2. La invasión está mediada por una transición epitelial-mesenquimal, en la que las células gliomas adquieren propiedades mesenquimales al reducir la expresión de genes que codifican proteínas de la matriz extracelular y moléculas de adhesión celular, amplificando la migración y facilitando la propagación a través del microambiente tumoral 3,4,5.
A nivel molecular, se ha demostrado la disrupción de varias proteínas que confieren estabilidad celular e interactúan con componentes inmunogénicos6. Se sabe que los gliomas infiltrativos sufren supresión de proteínas con propiedades antiapoptóticas (por ejemplo, PTEN)7. También sobreexpresan proteínas que promueven la evasión de la respuesta inmune del huésped (por ejemplo, PD1/PDL1)8. La desregulación de estas vías complejas aumenta la tumorigenicidad y aumenta el potencial maligno.
Dentro de muestras de glioma invasivo, el objetivo fue evaluar la expresión diferencial de proteínas clave para el crecimiento, la supervivencia y la proliferación celular, y para la integridad estructural del microambiente entre componentes invasivos y no invasivos. Además, buscamos estudiar la regulación diferencial de proteínas con un papel inmunogénico activo, ofreciendo información sobre el mecanismo por el cual las defensas inmunes comprometidas del huésped pueden mejorar el potencial proliferativo e invasivo de los gliomas. Esto es especialmente relevante dada la reciente amplitud de la investigación que demuestra cómo los marcadores inmunes y los impulsores de la desregulación en la malignidad pueden servir como objetivos de la inmunoterapia. La identificación de dianas terapéuticas viables entre las muchas proteínas implicadas en la inmunovigilancia y la reactividad requiere un enfoque altamente sensible y completo.
Dada la amplia gama de proteínas candidatas que se pueden estudiar, buscamos un método similar a la inmunohistoquímica pero con una mayor eficiencia en el procesamiento de datos. Dentro del campo de la biología del cáncer, DSP se ha convertido en una tecnología poderosa con importantes ventajas sobre herramientas alternativas para el análisis proteómico y la cuantificación. El sello distintivo de DSP es su capacidad de multiplexación de alto rendimiento, que permite el estudio simultáneo de varias proteínas diferentes dentro de una muestra, marcando una distinción importante de las tecnologías estándar pero de plexación inferior como la inmunohistoquímica (IHC)9,10. La característica múltiplex de DSP no compromete su fidelidad como herramienta cuantitativa y analítica, como lo demuestran los estudios que comparan DSP con IHC. Cuando se utiliza para la cuantificación proteómica de muestras de cáncer de pulmón de células no pequeñas, por ejemplo, se ha demostrado que el DSP tiene resultados similares a IHC11. Además, DSP ofrece una especificación regional personalizable, en la que los usuarios pueden definir manualmente las regiones dentro de las cuales realizar el análisis proteómico. Esto presenta una ventaja sobre los métodos multiplexores de sección completa10,12. En una sola ronda de procesamiento, DSP ofrece múltiples capas de análisis mediante el estudio de varios objetivos de proteínas en múltiples regiones de interés.
DSP tiene aplicaciones en varios entornos patológicos diferentes. DSP es especialmente ventajoso en el análisis oncológico, ya que la variación espacial puede correlacionarse con la transformación celular y la expresión diferencial de proteínas. Por ejemplo, DSP se ha utilizado para comparar el perfil proteómico del cáncer de mama con el microambiente tumoral adyacente. Esto conlleva implicaciones importantes para la comprensión de la historia natural de este tumor y su progresión, así como la posible respuesta al tratamiento13. Otros contextos que ilustran la versatilidad del DSP incluyen la cuantificación espacial de la diversidad de proteínas en el cáncer de próstata14, la asociación de la expresión del marcador de células inmunitarias con la progresión de la enfermedad en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello 15 y la demostración de un gradiente epitelial-mesenquimal de la expresión de proteínas que distingue el cáncer de ovario metastásico del primario de células claras16 . Mediante la implementación de DSP, caracterizamos la topografía espacial de las proteínas que podrían afectar la tumorigénesis y la invasión de gliomas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BOND Research Detection System</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DS9455</td>
			<td>Open detection system containing open containers in a reagent tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Wash</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>AR950</td>
			<td>10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer W</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 conjugation kit</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>AB188287</td>
			<td>Cy3 fluorescent antibody conjugation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>System for imaging and characterizing protein and RNA targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx DSP Instrument BufferKit</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100471</td>
			<td>Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Hyb Code Pack_Protein</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300401</td>
			<td>Controls for running GeoMX DSP experiemtns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300101</td>
			<td>Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300105</td>
			<td>Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Protein Slide Prep FFPE</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300308</td>
			<td>Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDH1-R132H antibody</td>
			<td>Dianova, Hamburg, Germany</td>
			<td>DIA-H09</td>
			<td>Monoclonal antibody against human IDH1 R132H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Bond RX</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Fully automated IHC stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Kit--12 reactions</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100052</td>
			<td>Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCounter Analysis System</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Master II</td>
			<td>3DHistech Ltd., Budapest, Hungary</td>
			<td></td>
			<td>To create the tissue microarray block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma

Los gliomas infiltrantes difusos se asocian con una alta morbilidad y mortalidad debido a la naturaleza infiltrativa de la diseminación tumoral. Son tumores morfológicamente complejos, con un alto grado de variabilidad proteómica tanto en el propio tumor como en su microambiente heterogéneo. El potencial maligno de estos tumores se ve reforzado por la desregulación de las proteínas involucradas en varias vías clave, incluidos los procesos que mantienen la estabilidad celular y preservan la integridad estructural del microambiente. Aunque se han realizado numerosos análisis masivos y de glioma unicelular, existe una relativa escasez de estratificación espacial de estos datos proteómicos. Comprender las diferencias en la distribución espacial de los factores tumorígenos y las poblaciones de células inmunitarias entre el tumor intrínseco, el borde invasivo y el microambiente ofrece información valiosa sobre los mecanismos subyacentes a la proliferación y propagación del tumor. El perfil espacial digital (DSP) representa una tecnología poderosa que puede formar la base para estos importantes análisis multicapa.
DSP es un método que cuantifica eficientemente la expresión de proteínas dentro de las regiones espaciales especificadas por el usuario en una muestra de tejido. DSP es ideal para estudiar la expresión diferencial de múltiples proteínas dentro y entre regiones de distinción, lo que permite múltiples niveles de análisis cuantitativo y cualitativo. El protocolo DSP es sistemático y fácil de usar, lo que permite un análisis espacial personalizado de los datos proteómicos. En este experimento, los microarrays de tejido se construyen a partir de biopsias archivadas del núcleo del glioblastoma. A continuación, se selecciona un panel de anticuerpos, dirigidos a proteínas de interés dentro de la muestra. Los anticuerpos, que se conjugan previamente a oligonucleótidos de ADN fotocleavable UV, se incuban con la muestra de tejido durante la noche. Bajo microscopía de fluorescencia visualización de los anticuerpos, las regiones de interés (ROIs) dentro de las cuales cuantificar la expresión de proteínas se definen con las muestras. La luz UV se dirige a cada ROI, dividiendo los oligonucleótidos de ADN. Los oligonucleótidos son microaspirados y contados dentro de cada ROI, cuantificando la proteína correspondiente sobre una base espacial.

La Figura 4 muestra los resultados representativos de un experimento DSP realizado en muestras de glioblastoma. Se presenta un mapa de calor, que ilustra uno de los métodos para capturar datos visualmente utilizando el software DSP. Las filas representan objetivos de proteínas, y cada columna corresponde a una región de interés. Una gama de colores de azul a rojo denota una expresión baja a alta, respectivamente. La variabilidad del color dentro de una fila refleja la heterogeneidad reg...

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Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

La desregulación proteómica juega un papel importante en la propagación de gliomas infiltrantes difusos, pero varias proteínas relevantes permanecen sin identificar. El procesamiento espacial digital (DSP) ofrece un enfoque eficiente y de alto rendimiento para caracterizar la expresión diferencial de proteínas candidatas que pueden contribuir a la invasión y migración de gliomas infiltrativos.

Perfil espacial digital para la caracterización del microambiente en glioma infiltrante difuso de tipo adulto

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

Digital Spatial Profiling, o DSP, ofrece un método eficiente para la cuantificación de proteínas estratificadas espacialmente. Su implementación nos permite caracterizar la expresión de proteínas en distintas regiones de un tumor y el microambiente. Una característica clave de DSP es su capacidad de multiplexación, que permite el procesamiento de datos de alto rendimiento.La capacidad de definir regiones de interés personalizadas también proporciona una dimensión espacial para el análisis de datos. DSP se puede aplicar a cualquier muestra en la que la cuantificación espacial de la proteína o la expresión de ARN pueda ayudar a dilucidar un proceso patológico o fisiológico. Esto es especialmente relevante en oncología, donde la variabilidad del objetivo regional puede correlacionarse con el crecimiento maligno o la invasión.Demostrando el procedimiento estarán Scott Palisoul, un histotecnólogo, y Rachael Barney, una tecnóloga genómica. Para preparar las diapositivas, comience tomando varios núcleos de dos milímetros de cada biopsia y colocándolos en un solo bloque de micromatriz de tejido. Corte secciones de cuatro micras del bloque y móntelas en portaobjetos de vidrio.Coloque cada portaobjetos dentro de la junta del portaportaobjetos e incube a 60 grados centígrados durante 30 minutos. En el sistema IHC semiautomatizado, llene el recipiente en la posición uno con 150 microlitros de tampón de lavado por portaobjetos, más cinco mililitros de volumen muerto, y deje la tapa abierta. Llene la misma cantidad de solución de bloqueo en el recipiente en la posición dos.Cargue la bandeja del contenedor de reactivos en la máquina. Seleccione el IHC de proceso, seguido del nombre de la solución de bloqueo en el cuadro desplegable del campo Marcador. Una vez que haya terminado para todas las diapositivas, haga clic en Cerrar.Luego haga clic en Imprimir etiquetas, y marque Todas las etiquetas de diapositivas aún no impresas, y haga clic en Imprimir. Coloque etiquetas en la parte superior de las diapositivas. Cargue las diapositivas en la bandeja portaobjetos, asegurándose de que la muestra y la etiqueta estén orientadas hacia arriba.Presione el botón LED para bajar la bandeja y permita que el instrumento comience el escaneo y el reconocimiento de diapositivas. Haga clic en el botón Inicio para comenzar el experimento. Cuando finalice la ejecución, presione el botón LED cuando parpadee en verde.Retire la bandeja del instrumento y levante con cuidado las baldosas de la cubierta de cada portaobjetos. Coloque los portaobjetos en la solución salina tamponada con fosfato 1X. Retire el exceso de tampón y delinee cada sección de tejido con una pluma hidrófoba para crear una barrera hidrófoba.Haga una solución oligo de PC de anticuerpos agregando ocho microlitros de cada anticuerpo por portaobjetos y usando Buffer W para alcanzar un volumen final de 200 microlitros. Luego aplique la solución oligo de anticuerpos PC a los portaobjetos e incube los portaobjetos durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, coloque los portaobjetos en una bandeja humidificada y lave tres veces durante 10 minutos en 1X TBST.Pos-fijar en paraformaldehído al 4% durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de lavar dos veces durante cinco minutos en 1X TBST. Agregue la tinción nuclear SYTO 13 durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguida de lavar dos veces con 1X TBST. Desplace el mouse sobre Recopilación de datos en el Centro de control y seleccione Nuevo o Continuar ejecución.Coloque la diapositiva en el portadiapositivas con la etiqueta hacia el usuario. Baje la abrazadera de la bandeja deslizante, asegurándose de que el tejido sea visible en la ventana alargada. Agregue seis mililitros de Buffer S.Siga las indicaciones en el Centro de control.Haga zoom entre diferentes ejes con los controles deslizantes x e y para delinear una región para escanear. Seleccione Escanear y permita que el escaneo continúe hasta que se haya creado una imagen de toda el área de destino definida. Generar una imagen 20 veces.Defina los ROI seleccionando tres ROI circulares de igual tamaño de un diámetro de 250 micrómetros para cada núcleo de tejido. Apruebe los ROI haciendo clic en el botón Salir del espacio de trabajo de escaneo. Luego espere a que la luz UV separe los oligos de los anticuerpos.Después de completar el proceso del instrumento de limpieza, seleccione Nueva recopilación de datos para continuar con las diapositivas o placas actuales. Abra la ventana de la placa finalizada haciendo doble clic en el área del icono de la placa. Introduzca el número de lote del paquete de códigos de hibridación y haga clic en Actualizar.Luego haga clic en Finalizar. Separe el portaportaobjetos y la placa de recolección siguiendo las indicaciones. Guarde los portaobjetos en TBST, o cúbralos con un medio acuoso y cubra el papel para el almacenamiento a largo plazo.Sellar las placas con un sello permeable y secar los aspirados a 65 grados centígrados en un termociclador con la parte superior abierta. Agregue siete microlitros de agua tratada con pirocarbonato de dietilo y mezcle. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego girar hacia abajo rápidamente.Prepare la mezcla de búfer de la sonda eligiendo las ecuaciones R y U de la sonda adecuadas aplicando la ecuación como se describe en el protocolo de texto. Agregue 84 microlitros de mezcla de tampón de sonda a cada paquete de códigos de hibridación. En una placa de hibridación fresca de 96 pocillos, agregue ocho microlitros de cada mezcla maestra de código de hibridación en los 12 pocillos de la fila indicada.Transfiera siete microlitros de la placa de recolección DSP al pocillo correspondiente en la placa de hibridación. Selle con calor, gire la placa e incube durante la noche a 67 grados centígrados. Después de la incubación, enfríe la placa en hielo y realice un giro rápido.Agrupe los productos de hibridación de cada pocillo en un tubo de tira, pipeteando suavemente cada pocillo cinco veces. Gire hacia abajo y cargue los tubos de la tira en el sistema de análisis. En el instrumento DSP, guarde el archivo CDF en una unidad USB y transfiera los datos al analizador digital.En la pantalla, presione Iniciar procesamiento. Seleccione Alta sensibilidad seguido de Siguiente. Pulse Seleccionar todo para el número de pozos con muestras, luego Finalizar, seguido de Siguiente en la notificación por correo electrónico.Luego haga clic en Inicio. Una vez que la estación de preparación haya terminado, selle el cartucho y transfiéralo al analizador digital. Presione Iniciar conteo.Seleccione Posición del escenario. Presione Cargar archivo CDF existente y seleccione el archivo cargado anteriormente. Presione Listo.Seleccione Posición de escenario de nuevo, pulse Listo y, a continuación, Iniciar para ejecutar el programa. Guarde el archivo ZIP de los archivos de conversión de recuento de reporteros del sistema de análisis en una unidad USB. Inserte la unidad en el equipo DSP.En el Centro de control de DSP, coloque el cursor sobre Recopilación de datos y luego haga clic en Cargar cuentas. Seleccione el archivo ZIP correspondiente. Haga clic en Registros en el Centro de control de DSP.Para ver los análisis de la cola, seleccione Agregar análisis seleccionados a la cola y, a continuación, Mi cola de análisis. Seleccione Nuevo estudio en cola colocando el cursor sobre la opción Análisis de datos en el Centro de control. El experimento DSP se realizó en muestras de glioblastoma, y los resultados se visualizaron como un mapa de calor.Las filas representan objetivos de proteínas, y cada columna corresponde a una región de interés. El nivel de expresión se representa mediante una gama de colores que varía desde el azul, que muestra una expresión baja, hasta el rojo, que denota una expresión alta. La variabilidad del color dentro de una fila refleja la heterogeneidad regional de proteínas y sugiere una posible asociación espacial con la expresión diferencial de proteínas.En este experimento, S100 y CD-56 fueron universalmente altos, porque son marcadores neuronales. Los marcadores con mayor variabilidad incluyen B7-H3, KI-67, CD-44 y fibronectina, que se sabe que están asociados con la proliferación, migración y metástasis del tumor. A partir de una amplia gama de objetivos candidatos, DSP puede identificar aquellos que exhiben una variación regional significativa.Esto sienta las bases para investigar los factores asociados con la variabilidad y su relevancia para la enfermedad.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

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Un protocolo para la rápida post-mortem de cultivos celulares de glioma pontino intrínsecos difusos (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

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This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Evaluación de biomarcadores en Glioma por Immunohistochemistry en parafina-encajado 3D Glioma desarrolló culturas

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generación de tumores pancreáticos ortotópicos y caracterización ex vivo de la citotoxicidad de células T infiltrantes en tumores

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Análisis De La Población Lateral En Líneas Celulares De Tumores Sólidos

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

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Trasplante de tumores para evaluar la dinámica de las células T CD8+ infiltrantes de tumores en ratones

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Perfil espacial de la expresión de proteínas y ARN en tejidos: un enfoque para ajustar la microdisección virtual

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Ensayos de inmunocitoquímica de células 3D vivas del glioma difuso de línea media infantil

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Microdisección láser industrializada guiada por inteligencia artificial para el análisis proteómico a microescala del microambiente tumoral

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Análisis de imágenes de código de barras multiplexadas para inmunoperfilado y caracterización de mapeo espacial en el análisis unicelular de muestras de tejido de parafina

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...