Name: digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma
Uploaded: 2022-09-13T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma at JoVE.com

Författarna erkänner stödet från Laboratoriet för klinisk genomik och avancerad teknik vid institutionen för patologi och laboratoriemedicin vid Dartmouth Hitchcock Health System. Författarna erkänner också patologins delade resurs vid Dartmouth Cancer Center med NCI Cancer Center Support Grant 5P30 CA023108-37.

Protokollet som beskrivs nedan följer riktlinjerna från Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Informerat samtycke erhölls från de patienter vars vävnadsprover inkluderades i denna studie. Se avsnittet Materialförteckning för mer information om alla material, reagenser, utrustning och programvara som används i detta protokoll.
1. Förberedelse av rutschkana17
<ol><li>Hämta eller förbered formalinfixerad, paraff...

<ol>
	<li>Pedersen, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+patterns+of+lac-z+transfected+human+glioma+cells+in+the+rat+brain.">Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain.</a> International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).</li><li>Iwadate, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+in+glioblastoma+progression.">Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression.</a> Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).</li><li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+and+prognosis+analysis+of+epithelial-mesenchymal+transition+in+glioma.">Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Barthel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+molecular+signature+and+crossroads+with+tumor+microenvironment.">Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).</li><li>Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-apoptosis+mechanisms+in+malignant+gliomas.">Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).</li><li>Berghoff, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death+ligand+1+expression+and+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+glioblastoma.">Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).</li><li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue.">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li><li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling.">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li><li>Garcia-Pardo, M., Calles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-1+NSCLC+therapy+resistance+mechanism.">ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism.</a> Precision Cancer Medicine. , (2021).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+spatial+profiling+of+individual+glomeruli+from+patients+with+anti-neutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+glomerulonephritis.">Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).</li><li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+GeoMx+digital+spatial+profiler.">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456 (2021).</li><li>Brady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-+and+intra-tumor+heterogeneity+of+metastatic+prostate+cancer+determined+by+digital+spatial+gene+expression+profiling.">Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling.</a> Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).</li><li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+digital+spatial+profiling+of+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+patients.">Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients.</a> Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).</li><li>Wang, D. Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study:+Digital+spatial+profiling+of+metastatic+clear+cell+carcinoma+reveals+intra-tumor+heterogeneity+in+epithelial-mesenchymal+gradient.">Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>GeoMx DSP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+slide+preparation+user+manual.">Automated slide preparation user manual.</a> GeoMx DSP. , (2022).</li><li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).</li><li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoadjuvant+versus+adjuvant+ipilimumab+plus+nivolumab+in+macroscopic+stage+III+melanoma.">Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).</li><li>Matthews, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-enriched+hyaluronan+binding+(BEHAB)/brevican+cleavage+in+a+glioma+cell+line+is+mediated+by+a+disintegrin+and+metalloproteinase+with+thrombospondin+motifs+(ADAMTS)+family+member.">Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).</li><li>Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+infiltration+into+central+nervous+system+tissue+in+vitro:+involvement+of+a+metalloprotease.">Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease.</a> Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).</li><li>Beli&#235;n, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-type+1+matrix+metalloprotease+(MT1-MMP)+enables+invasive+migration+of+glioma+cells+in+central+nervous+system+white+matter.">Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter.</a> Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).</li><li>Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+antigens+recognized+by+T+lymphocytes:+At+the+core+of+cancer+immunotherapy.">Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).</li><li>Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+for+cancer+prevention:+a+practical+and+feasible+approach+to+the+cancer+epidemic.">Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Chen, L., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-PD-1/PD-L1+therapy+of+human+cancer:+past,+present,+and+future.">Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-Associated+stromal+cells+stimulate+glioma+malignancy+by+regulating+the+tumor+immune+microenvironment.">Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).</li><li>Ishii, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+characterization+of+the+tumorigenic+&amp;#34;peri-necrotic+niche&amp;#34;+harboring+quiescent+stem-like+tumor+cells+in+glioblastoma.">Histological characterization of the tumorigenic &amp;#34;peri-necrotic niche&amp;#34; harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma.</a> PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).</li><li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments.">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).</li><li>NanoString. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CosMx+Spatial+Molecular+Imager:+True+Single-Cell+In+Situ+Solution.">CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution.</a> NanoString. , (2022).</li></ol>

Med tanke på mångfalden av proteiner som potentiellt kan påverka gliomens aggressivitet och uppfattningen att flera av dessa proteiner förblir oupptäckta, är en proteinkvantifieringsmetod med hög genomströmning ett idealiskt tekniskt tillvägagångssätt. Dessutom, med tanke på att rumsliga data i onkologiska prover ofta korrelerar med differentiellt uttryck18, möjliggör införlivande av rumslig profilering i proteinkvantifieringsmetoden en effektivare analys.
<p class="jove_content...

Diffust infiltrerande gliom är den vanligaste typen av malign hjärntumör hos vuxna och är alltid dödliga. Benägenheten för gliomceller att migrera i stor utsträckning i hjärnan är en stor terapeutisk utmaning. Mekanismen genom vilken de sprider sig innebär riktad migration och okontrollerad invasion. Invasiva gliomceller har visat sig uppvisa tropism och migration längs vita substanskanaler1, med ny forskning som implicerar demyelinering av dessa kanaler som en aktiv, protumorigenisk egenskap2. Invasion förmedlas av en epitel-till-mesenkymal övergång, där gliomceller förvärvar mesenkymala egenskaper genom att minska uttrycket av gener som kodar för extracellulära matrisproteiner och celladhesionsmolekyler, förstärka migration och underlätta förökning genom tumörmikromiljön 3,4,5.
På molekylär nivå har störningar av flera proteiner som ger cellulär stabilitet och gränssnitt med immunogena komponenter visats6. Infiltrativa gliom är kända för att genomgå undertryckande av proteiner med anti-apoptotiska (t.ex. PTEN) egenskaper7. De överuttrycker också proteiner som främjar undvikande av värdens immunsvar (t.ex. PD1 / PDL1)8. Dysregleringen av dessa komplexa vägar ökar tumorigeniciteten och ökar malign potential.
Inom prover av invasivt gliom var syftet att utvärdera det differentiella uttrycket av proteiner som är nyckeln till celltillväxt, överlevnad och spridning, och till mikromiljöstrukturell integritet mellan invasiva och icke-invasiva komponenter. Dessutom försökte vi studera differentiell reglering av proteiner med en aktiv immunogen roll och erbjuda insikt i mekanismen genom vilken komprometterade värdimmunförsvar kan förbättra gliomens proliferativa och invasiva potential. Detta är särskilt relevant med tanke på den senaste tidens bredd av forskning som visar hur immunmarkörer och drivkrafter för dysreglering vid malignitet kan fungera som mål för immunterapi. Att identifiera livskraftiga terapeutiska mål bland de många proteiner som är involverade i immunövervakning och reaktivitet kräver ett mycket känsligt och omfattande tillvägagångssätt.
Med tanke på det stora utbudet av kandidatproteiner som kan studeras sökte vi en metod som liknar immunhistokemi men med förbättrad databehandlingseffektivitet. Inom cancerbiologi har DSP vuxit fram som en kraftfull teknik med viktiga fördelar jämfört med alternativa verktyg för proteomisk analys och kvantifiering. Kännetecknet för DSP är dess multiplexeringsförmåga med hög genomströmning, vilket möjliggör samtidig studie av flera olika proteiner i ett prov, vilket markerar en viktig skillnad från standard men lägre plexteknologier såsom immunohistokemi (IHC)9,10. Multiplexfunktionen hos DSP äventyrar inte dess trohet som ett kvantitativt och analytiskt verktyg, vilket framgår av studier som jämför DSP med IHC. När DSP används för proteomisk kvantifiering av icke-småcelliga lungcancerprover har DSP till exempel visat sig ha liknande resultat som IHC11. Dessutom erbjuder DSP anpassningsbar regional specifikation, där användare manuellt kan definiera regioner där de ska utföra proteomisk analys. Detta ger en fördel jämfört med multiplexmetoder för hela sektioner10,12. I en enda bearbetningsrunda erbjuder DSP således flera lager av analys genom att kartlägga flera proteinmål över flera regioner av intresse.
DSP har applikationer i flera olika patologiska miljöer. DSP är särskilt fördelaktigt vid onkologisk analys, eftersom rumslig variation kan korrelera med cellulär transformation och differentiellt proteinuttryck. Till exempel har DSP använts för att jämföra den proteomiska profilen för bröstcancer med den intilliggande tumörmikromiljön. Detta har viktiga konsekvenser för att förstå den naturliga historien om denna tumör och dess progression, liksom potentiellt svar på behandling13. Ytterligare sammanhang som illustrerar DSP: s mångsidighet inkluderar rumslig kvantifiering av proteindiversitet i prostatacancer14, associering av immuncellmarköruttryck med sjukdomsprogression i skivepitelcancer i huvud och nacke15 och demonstration av en epitel-mesenkymal gradient av proteinuttryck som skiljer metastatisk från primär klarcellig äggstockscancer16 . Genom att implementera DSP karakteriserar vi den rumsliga topografin hos proteiner som kan påverka tumorigenes och invasion av gliom.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BOND Research Detection System</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DS9455</td>
			<td>Open detection system containing open containers in a reagent tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Wash</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>AR950</td>
			<td>10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer W</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 conjugation kit</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>AB188287</td>
			<td>Cy3 fluorescent antibody conjugation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>System for imaging and characterizing protein and RNA targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx DSP Instrument BufferKit</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100471</td>
			<td>Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Hyb Code Pack_Protein</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300401</td>
			<td>Controls for running GeoMX DSP experiemtns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300101</td>
			<td>Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300105</td>
			<td>Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Protein Slide Prep FFPE</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300308</td>
			<td>Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDH1-R132H antibody</td>
			<td>Dianova, Hamburg, Germany</td>
			<td>DIA-H09</td>
			<td>Monoclonal antibody against human IDH1 R132H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Bond RX</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Fully automated IHC stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Kit--12 reactions</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100052</td>
			<td>Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCounter Analysis System</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Master II</td>
			<td>3DHistech Ltd., Budapest, Hungary</td>
			<td></td>
			<td>To create the tissue microarray block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma

Diffust infiltrerande gliom är förknippade med hög sjuklighet och dödlighet på grund av tumörspridningens infiltrativa natur. De är morfologiskt komplexa tumörer, med en hög grad av proteomisk variabilitet över både själva tumören och dess heterogena mikromiljö. Den maligna potentialen hos dessa tumörer förbättras av dysreglering av proteiner som är involverade i flera viktiga vägar, inklusive processer som upprätthåller cellulär stabilitet och bevarar mikromiljöns strukturella integritet. Även om det har gjorts många bulk- och encelliga gliomanalyser, finns det en relativ brist på rumslig stratifiering av dessa proteomiska data. Att förstå skillnader i rumslig fördelning av tumorigena faktorer och immuncellpopulationer mellan den inneboende tumören, invasiva kanten och mikromiljön ger värdefull insikt i mekanismerna bakom tumörproliferation och förökning. Digital rumslig profilering (DSP) representerar en kraftfull teknik som kan ligga till grund för dessa viktiga flerskiktsanalyser.
DSP är en metod som effektivt kvantifierar proteinuttryck inom användarspecificerade rumsliga regioner i ett vävnadsprov. DSP är idealiskt för att studera differentialuttrycket av flera proteiner inom och mellan regioner med distinktion, vilket möjliggör flera nivåer av kvantitativ och kvalitativ analys. DSP-protokollet är systematiskt och användarvänligt, vilket möjliggör anpassad rumslig analys av proteomiska data. I detta experiment konstrueras vävnadsmikroarrayer från arkiverade glioblastomkärnbiopsier. Därefter väljs en panel av antikroppar som riktar sig mot proteiner av intresse i provet. Antikropparna, som är prekonjugerade till UV-fotokleaverbara DNA-oligonukleotider, inkuberas sedan med vävnadsprovet över natten. Under fluorescensmikroskopivisualisering av antikropparna definieras regioner av intresse (ROI) inom vilka man kvantifierar proteinuttryck med proverna. UV-ljus riktas sedan mot varje ROI och klyver DNA-oligonukleotiderna. Oligonukleotiderna mikroaspirateras och räknas inom varje ROI, vilket kvantifierar motsvarande protein på rumslig basis.

Figur 4 visar de representativa resultaten från ett DSP-experiment utfört på prover av glioblastom. En värmekarta presenteras som illustrerar en av metoderna för att fånga data visuellt med DSP-programvaran. Rader representerar proteinmål, och varje kolumn motsvarar en region av intresse. Ett färgintervall av blått till rött betecknar lågt respektive högt uttryck. Färgvariation inom en rad återspeglar regional protein heterogenitet och föreslår en möjlig rumslig koppling med...

Watch this Scientific Journal Video about Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma at JoVE.com

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Proteomisk dysreglering spelar en viktig roll i spridningen av diffust infiltrerande gliom, men flera relevanta proteiner förblir oidentifierade. Digital rumslig bearbetning (DSP) erbjuder en effektiv metod med hög genomströmning för att karakterisera det differentiella uttrycket av kandidatproteiner som kan bidra till invasion och migration av infiltrativa gliom.

Digital rumslig profilering för karakterisering av mikromiljön i vuxentyp som diffust infiltrerar gliom

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

Digital Spatial Profiling, eller DSP, erbjuder en effektiv metod för rumsligt stratifierad proteinkvantifiering. Dess implementering gör det möjligt för oss att karakterisera proteinuttryck över olika regioner i en tumör och mikromiljön. En viktig egenskap hos DSP är dess multiplexeringskapacitet, vilket möjliggör databehandling med hög genomströmning.Möjligheten att definiera anpassade regioner av intresse ger dessutom en rumslig dimension till dataanalys. DSP kan appliceras på alla prover där rumsligt kvantifierande protein eller RNA-uttryck kan hjälpa till att belysa en patologisk eller fysiologisk process. Detta är särskilt relevant inom onkologi, där regional målvariation kan korrelera med malign tillväxt eller invasion.Demonstrerar proceduren kommer att vara Scott Palisoul, en histoteknolog, och Rachael Barney, en genomisk tekniker. För att förbereda bilder, börja med att ta flera två millimeter kärnor från varje biopsi och sätta dem i ett enda vävnadsmikroarrayblock. Skär fyra mikron sektioner från blocket och montera dem på glasskivor.Placera varje bild inuti glidhållarens packning och inkubera den vid 60 grader Celsius i 30 minuter. I det halvautomatiska IHC-systemet fyller du behållaren i läge ett med 150 mikroliter tvättbuffert per bild, plus fem milliliter dödvolym, och lämnar locket öppet. Fyll samma mängd blockerande lösning i behållaren i position två.Ladda reagensbehållaren på maskinen. Välj Process IHC, följt av blockerande lösningsnamn i listrutan i fältet Markör. När du är klar för alla bilder klickar du på Stäng.Klicka sedan på Skriv ut etiketter och kontrollera Alla bildetiketter som ännu inte skrivits ut och klicka på Skriv ut. Fäst etiketter på bildernas överkanter. Ladda bilderna på glidfacket och se till att provet och etiketten är vända uppåt.Tryck på LED-knappen för att sänka facket och låt instrumentet börja skanna och känna igen bilder. Klicka på Start-knappen för att starta experimentet. När körningen är klar trycker du på LED-knappen när den blinkar grönt.Ta bort brickan från instrumentet och lyft försiktigt täckplattorna från varje bild. Placera objektglasen i 1X fosfatbuffrad saltlösning. Ta bort överflödig buffert och skissera varje vävnadssektion med en hydrofob penna för att skapa en hydrofob barriär.Gör en antikropps-PC-oligolösning genom att tillsätta åtta mikroliter av varje antikropp per bild och använda buffert W för att nå en slutlig volym på 200 mikroliter. Applicera sedan antikroppen PC-oligolösning på bilderna och inkubera glasrutschbanorna över natten vid fyra grader Celsius. Efter inkubation, placera bilderna i en fuktad bricka och tvätta tre gånger i 10 minuter i 1X TBST.Postfixering i 4% paraformaldehyd i 30 minuter vid rumstemperatur, följt av tvätt två gånger i fem minuter i 1X TBST. Tillsätt SYTO 13 kärnfläck i 15 minuter vid rumstemperatur, följt av tvätt två gånger med 1X TBST. Håll muspekaren över datainsamling i Kontrollcenter och välj Ny eller Fortsätt kör.Placera bilden i skjuthållaren med etiketten mot användaren. Sänk ner glidbrickans klämma och se till att vävnaden är synlig i det långsträckta fönstret. Lägg till sex milliliter Buffer S.Följ anvisningarna i Control Center.Zooma mellan olika axlar med skjutreglagen x och y för att avgränsa ett område för skanning. Välj Skanna och låt genomsökningen fortsätta tills hela det definierade målområdet har avbildats. Generera en bild på 20 gånger.Definiera ROI genom att välja tre lika stora cirkulära ROI med en diameter på 250 mikrometer för varje vävnadskärna. Godkänn ROI:erna genom att klicka på knappen Avsluta skanningsarbetsyta. Vänta sedan tills UV-ljuset klyver oligos från antikropparna.När du har slutfört rengöringsinstrumentprocessen väljer du Ny datainsamling för att fortsätta med de aktuella bilderna eller plattan. Öppna det färdiga skyltfönstret genom att dubbelklicka på plattans ikonområde. Ange partinumret för hybridiseringskodpaketet och klicka på Uppdatera.Klicka sedan på Slutför. Lossa glidhållaren och uppsamlingsplattan genom att följa anvisningarna. Förvara bilderna i TBST, eller täck dem med ett vattenhaltigt medium och täckglid för långvarig lagring.Försegla plattorna med en permeabel tätning och torka aspiraterna vid 65 grader Celsius i en termisk cykler med toppen öppen. Tillsätt sju mikroliter dietylpyrokarbonatbehandlat vatten och blanda. Inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter och snurra sedan ner snabbt.Förbered sondbuffertblandningen genom att välja lämpliga sond-R- och sond-U-ekvationer med tillämpning av ekvationen enligt beskrivningen i textprotokollet. Tillsätt 84 mikroliter sondbuffertblandning till varje hybridiseringskodpaket. I en ny 96-brunns hybridiseringsplatta, tillsätt åtta mikroliter av varje hybridiseringskodhuvudblandning i alla de 12 brunnarna i den angivna raden.Överför sju mikroliter från DSP-uppsamlingsplattan till motsvarande brunn i hybridiseringsplattan. Värmeförsegla, snurra plattan och inkubera den över natten vid 67 grader Celsius. Efter inkubation, kyla plattan på is och utför en snabb snurrning.Slå samman hybridiseringsprodukterna från varje brunn i ett remsrör och pipettera försiktigt varje brunn fem gånger. Snurra ner och ladda remsrören i analyssystemet. På DSP-instrumentet sparar du CDF-filen på en USB-enhet och överför data till den digitala analysatorn.På skärmen trycker du på Starta bearbetning. Välj Hög känslighet följt av Nästa. Tryck på Välj alla för antalet brunnar med prover och sedan på Slutför, följt av Nästa i e-postmeddelandet.Klicka sedan på Start. När förberedelsestationen är klar, försegla patronen och överför den till den digitala analysatorn. Tryck på Börja räkna.Välj Scenposition. Tryck på Ladda befintlig CDF-fil och välj tidigare uppladdad fil. Tryck på Klar.Välj Scenposition igen, tryck på Klar och sedan på Start för att köra programmet. Spara ZIP-filen för reporterräkningskonverteringsfilerna från analyssystemet till en USB-enhet. Sätt i enheten i DSP-maskinen.I DSP Control Center håller du muspekaren över Datainsamling och klickar sedan på Ladda upp konton. Välj relevant ZIP-fil. Klicka på Poster i DSP Control Center.Om du vill visa genomsökningar i kön väljer du Lägg till valda genomsökningar i kön och sedan Min analyskö. Välj Ny studie från kö genom att hålla muspekaren över alternativet Dataanalys i Kontrollcenter. DSP-experiment utfördes på prover av glioblastom, och resultaten visualiserades som en värmekarta.Rader representerar proteinmål, och varje kolumn motsvarar en region av intresse. Uttrycksnivån avbildas av ett färgområde som varierar från blått, som visar lågt uttryck, till rött, vilket betecknar högt uttryck. Färgvariation inom en rad återspeglar regional protein heterogenitet och föreslår en möjlig rumslig koppling med differentiellt proteinuttryck.I detta experiment var S100 och CD-56 universellt höga, eftersom de är neurala markörer. Markörer med mest variation inkluderar B7-H3, KI-67, CD-44 och fibronektin, som är kända för att vara associerade med tumörproliferation, migration och metastasering. Från ett stort antal kandidatmål kan DSP identifiera de som uppvisar betydande regionala variationer.Detta lägger grunden för att undersöka faktorer som är förknippade med variabilitet och deras relevans för sjukdom.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Ett protokoll för Rapid Post mortem Cell Culture av Diffus Intrinsic Pontine Gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR bedömning av pH, pO2, Redox Status, och koncentrationer av fosfat och glutation i den tumör mikromiljö

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Utvärdering av biomarkörer i gliom av immunohistokemi på Paraffin-inbäddat 3D gliom Neurosphere kulturer

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av ortotopisk Pankreastumörer och ex vivo karakterisering av tumörinfiltrerande T-cell cytotoxicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analys av sidopopulation i solida tumör cellinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumörtransplantation för att bedöma dynamiken hos tumörinfiltrerande CD8 + T-celler hos möss

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Rumslig profilering av protein- och RNA-uttryck i vävnad: Ett tillvägagångssätt för att finjustera virtuell mikrodissektion

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Live-3D-cell immunocytokemi analyser av pediatriskt diffust mittlinjegliom

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Industrialiserad, artificiell intelligensstyrd lasermikrodissektion för mikroskalad proteomisk analys av tumörmikromiljön

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexerad streckkodande bildanalys för immunprofilering och karakterisering av rumslig kartläggning vid encellsanalys av paraffinvävnadsprover

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...