Name: digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma
Uploaded: 2022-09-13T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma at JoVE.com

Yazarlar, Dartmouth Hitchcock Sağlık Sistemi Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü'ndeki Klinik Genomik ve İleri Teknoloji Laboratuvarı'nın desteğini kabul etmektedir. Yazarlar ayrıca NCI Kanser Merkezi Destek Hibe 5P30 CA023108-37 ile Dartmouth Kanser Merkezi'ndeki Patoloji Paylaşılan Kaynağını da kabul etmektedir.

Aşağıda özetlenen protokol, Dartmouth-Hitchcock İnsan Araştırmaları Etik Komitesi'nin yönergelerini takip etmektedir. Bu çalışmaya doku örnekleri alınan hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler, ekipman ve yazılımlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu bölümüne bakın.
1. Slayt hazırlama17
<ol><li>Formalin sabit, parafin gömülü dokuyu insan yetiş...

<ol>
	<li>Pedersen, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+patterns+of+lac-z+transfected+human+glioma+cells+in+the+rat+brain.">Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain.</a> International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop.">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).</li><li>Iwadate, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition+in+glioblastoma+progression.">Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression.</a> Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).</li><li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+and+prognosis+analysis+of+epithelial-mesenchymal+transition+in+glioma.">Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Barthel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma:+molecular+signature+and+crossroads+with+tumor+microenvironment.">Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).</li><li>Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-apoptosis+mechanisms+in+malignant+gliomas.">Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).</li><li>Berghoff, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death+ligand+1+expression+and+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+glioblastoma.">Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).</li><li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue.">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li><li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling.">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li><li>Garcia-Pardo, M., Calles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-1+NSCLC+therapy+resistance+mechanism.">ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism.</a> Precision Cancer Medicine. , (2021).</li><li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+spatial+profiling+of+individual+glomeruli+from+patients+with+anti-neutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+glomerulonephritis.">Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).</li><li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+GeoMx+digital+spatial+profiler.">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456 (2021).</li><li>Brady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-+and+intra-tumor+heterogeneity+of+metastatic+prostate+cancer+determined+by+digital+spatial+gene+expression+profiling.">Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling.</a> Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).</li><li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+digital+spatial+profiling+of+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+patients.">Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients.</a> Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).</li><li>Wang, D. Y. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Case+study:+Digital+spatial+profiling+of+metastatic+clear+cell+carcinoma+reveals+intra-tumor+heterogeneity+in+epithelial-mesenchymal+gradient.">Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>GeoMx DSP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+slide+preparation+user+manual.">Automated slide preparation user manual.</a> GeoMx DSP. , (2022).</li><li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics.">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overall+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).</li><li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoadjuvant+versus+adjuvant+ipilimumab+plus+nivolumab+in+macroscopic+stage+III+melanoma.">Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).</li><li>Matthews, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-enriched+hyaluronan+binding+(BEHAB)/brevican+cleavage+in+a+glioma+cell+line+is+mediated+by+a+disintegrin+and+metalloproteinase+with+thrombospondin+motifs+(ADAMTS)+family+member.">Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).</li><li>Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+infiltration+into+central+nervous+system+tissue+in+vitro:+involvement+of+a+metalloprotease.">Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease.</a> Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).</li><li>Beli&#235;n, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-type+1+matrix+metalloprotease+(MT1-MMP)+enables+invasive+migration+of+glioma+cells+in+central+nervous+system+white+matter.">Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter.</a> Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).</li><li>Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+antigens+recognized+by+T+lymphocytes:+At+the+core+of+cancer+immunotherapy.">Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).</li><li>Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+for+cancer+prevention:+a+practical+and+feasible+approach+to+the+cancer+epidemic.">Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Chen, L., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-PD-1/PD-L1+therapy+of+human+cancer:+past,+present,+and+future.">Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-Associated+stromal+cells+stimulate+glioma+malignancy+by+regulating+the+tumor+immune+microenvironment.">Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).</li><li>Ishii, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+characterization+of+the+tumorigenic+&amp;#34;peri-necrotic+niche&amp;#34;+harboring+quiescent+stem-like+tumor+cells+in+glioblastoma.">Histological characterization of the tumorigenic &amp;#34;peri-necrotic niche&amp;#34; harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma.</a> PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).</li><li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments.">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).</li><li>NanoString. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CosMx+Spatial+Molecular+Imager:+True+Single-Cell+In+Situ+Solution.">CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution.</a> NanoString. , (2022).</li></ol>

Gliomların saldırganlığını potansiyel olarak etkileyebilecek proteinlerin çeşitliliği ve bu proteinlerin birçoğunun keşfedilmemiş olduğu fikri göz önüne alındığında, yüksek verimli bir protein nicelleştirme yöntemi ideal bir teknolojik yaklaşımdır. Ek olarak, onkolojik örneklerdeki uzamsal verilerin genellikle diferansiyel ekspresyon18 ile ilişkili olduğu göz önüne alındığında, mekansal profillemenin protein nicelleştirme yaklaşımına dahil edilmesi daha etk...

Diffüz infiltrasyon yapan gliomlar erişkinlerde en sık görülen malign beyin tümörü tipidir ve her zaman öldürücüdür. Glioma hücrelerinin beyinde yoğun bir şekilde göç etme eğilimi büyük bir terapötik zorluktur. Yayıldıkları mekanizma, yönlendirilmiş göç ve kontrolsüz istilayı içerir. İnvaziv glioma hücrelerinin beyaz cevher yolları boyunca tropizm ve migrasyon sergilediği gösterilmiştir1, son araştırmalar bu yolların aktif, protümörojenik bir özellik olarak demiyelinizasyonunu ima etmektedir2. İnvazyona, glioma hücrelerinin hücre dışı matriks proteinlerini ve hücre adezyon moleküllerini kodlayan genlerin ekspresyonunu azaltarak, göçü artırarak ve tümör mikroçevresi yoluyla yayılımı kolaylaştırarak mezenkimal özellikler kazandığı epitel-mezenkimal bir geçiş aracılık eder 3,4,5.
Moleküler düzeyde, hücresel stabilite sağlayan ve immünojenik bileşenlerle arayüz oluşturan çeşitli proteinlerin bozulması gösterilmiştir6. İnfiltratif gliomların, anti-apoptotik (örneğin, PTEN) özelliklere sahip proteinlerin baskılanmasına maruz kaldığı bilinmektedir7. Ayrıca, konakçı immün yanıtından kaçınmayı teşvik eden proteinleri aşırı eksprese ederler (örneğin, PD1 / PDL1)8. Bu kompleks yolakların düzensizliği tümörojenisiteyi arttırır ve malign potansiyeli arttırır.
İnvaziv glioma örneklerinde amaç, hücre büyümesi, sağkalım ve proliferasyon için anahtar proteinlerin diferansiyel ekspresyonunu ve invaziv ve invaziv olmayan bileşenler arasındaki mikroçevre yapısal bütünlüğünü değerlendirmekti. Ek olarak, aktif immünojenik role sahip proteinlerin diferansiyel regülasyonunu incelemeye çalıştık ve tehlikeye giren konakçı immün savunmasının gliomların proliferatif ve invaziv potansiyelini artırabileceği mekanizmaya dair fikir vermeye çalıştık. Bu, özellikle malignitede immün belirteçlerin ve disregülasyon sürücülerinin immünoterapinin hedefleri olarak nasıl hizmet edebileceğini gösteren son araştırma genişliği göz önüne alındığında önemlidir. İmmünsüveyans ve reaktivitede rol oynayan birçok protein arasında uygulanabilir terapötik hedeflerin belirlenmesi, oldukça hassas ve kapsamlı bir yaklaşım gerektirir.
İncelenebilecek çok çeşitli aday proteinler göz önüne alındığında, immünohistokimyaya benzer, ancak gelişmiş veri işleme verimliliğine sahip bir yöntem aradık. Kanser biyolojisi alanında DSP, proteomik analiz ve niceleme için alternatif araçlara göre önemli avantajlara sahip güçlü bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. DSP'nin ayırt edici özelliği, bir numune içindeki birkaç farklı proteinin aynı anda incelenmesine izin veren ve immünohistokimya (IHC) 9,10 gibi standart ancak daha düşük pleks teknolojilerden önemli bir ayrım yapan yüksek verimli çoklama yeteneğidir. DSP'nin multipleks özelliği, DSP'yi IHC ile karşılaştıran çalışmaların gösterdiği gibi, nicel ve analitik bir araç olarak sadakatinden ödün vermez. Örneğin, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri örneklerinin proteomik nicelleştirilmesi için kullanıldığında, DSP'nin IHC11'e benzer sonuçlara sahip olduğu gösterilmiştir. Ek olarak, DSP, kullanıcıların proteomik analiz gerçekleştirecekleri bölgeleri manuel olarak tanımlayabilecekleri özelleştirilebilir bölgesel spesifikasyonlar sunar. Bu, tüm kesitli çoklama yöntemlerine göre bir avantaj sunar10,12. DSP, tek bir işleme turunda, birden fazla ilgi alanındaki çeşitli protein hedeflerini inceleyerek birden fazla analiz katmanı sunar.
DSP'nin birkaç farklı patolojik ortamda uygulamaları vardır. DSP, onkolojik analizde özellikle avantajlıdır, çünkü uzamsal varyasyon hücresel transformasyon ve diferansiyel protein ekspresyonu ile ilişkili olabilir. Örneğin, DSP, meme kanserinin proteomik profilini bitişik tümör mikro ortamıyla karşılaştırmak için kullanılmıştır. Bu, bu tümörün doğal geçmişini ve progresyonunu ve ayrıca tedaviye potansiyel yanıtı anlamak için önemli sonuçlar doğurur13. DSP'nin çok yönlülüğünü gösteren ek bağlamlar arasında prostat kanserinde protein çeşitliliğinin mekansal nicelleştirilmesi14, baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomda immün hücre belirteci ekspresyonunun hastalık progresyonu ile ilişkisi 15 ve metastazı primer berrak hücreli yumurtalık kanserinden ayıran protein ekspresyonunun epitelyal-mezenkimal gradyanının gösterilmesi16 . DSP'yi uygulayarak, tümörigenezi ve gliomların invazyonunu etkileyebilecek proteinlerin mekansal topografyasını karakterize ediyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BOND Research Detection System</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DS9455</td>
			<td>Open detection system containing open containers in a reagent tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Wash</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>AR950</td>
			<td>10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer W</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 conjugation kit</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>AB188287</td>
			<td>Cy3 fluorescent antibody conjugation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>System for imaging and characterizing protein and RNA targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx DSP Instrument BufferKit</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100471</td>
			<td>Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Hyb Code Pack_Protein</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300401</td>
			<td>Controls for running GeoMX DSP experiemtns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300101</td>
			<td>Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300105</td>
			<td>Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeoMx Protein Slide Prep FFPE</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>121300308</td>
			<td>Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDH1-R132H antibody</td>
			<td>Dianova, Hamburg, Germany</td>
			<td>DIA-H09</td>
			<td>Monoclonal antibody against human IDH1 R132H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA Bond RX</td>
			<td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Fully automated IHC stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Kit--12 reactions</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>100052</td>
			<td>Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCounter Analysis System</td>
			<td>NanoString, Seattle, WA</td>
			<td>contact company</td>
			<td>Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Master II</td>
			<td>3DHistech Ltd., Budapest, Hungary</td>
			<td></td>
			<td>To create the tissue microarray block</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital spatial profiling for characterization of the microenvironment in adult-type diffusely infiltrating glioma

Diffüz infiltrasyon yapan gliomlar, tümör yayılımının infiltratif doğası nedeniyle yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkilidir. Morfolojik olarak kompleks tümörlerdir ve hem tümörün kendisinde hem de heterojen mikro ortamında yüksek derecede proteomik değişkenlik gösterirler. Bu tümörlerin malign potansiyeli, hücresel stabiliteyi koruyan ve mikro çevrenin yapısal bütünlüğünü koruyan süreçler de dahil olmak üzere çeşitli anahtar yollarda yer alan proteinlerin düzensizliği ile arttırılmıştır. Çok sayıda toplu ve tek hücreli glioma analizi yapılmış olmasına rağmen, bu proteomik verilerin uzamsal tabakalaşmasında göreceli bir kıtlık vardır. İntrinsik tümör, invaziv kenar ve mikroçevre arasındaki tümörojenik faktörlerin ve immün hücre popülasyonlarının mekansal dağılımındaki farklılıkları anlamak, tümör proliferasyonu ve yayılımının altında yatan mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sunmaktadır. Dijital uzamsal profil oluşturma (DSP), bu önemli çok katmanlı analizlerin temelini oluşturabilecek güçlü bir teknolojiyi temsil eder.
DSP, bir doku örneğinde kullanıcı tarafından belirlenen uzamsal bölgelerdeki protein ekspresyonunu verimli bir şekilde ölçen bir yöntemdir. DSP, birden fazla proteinin ayırt edici bölgeler içindeki ve arasındaki diferansiyel ekspresyonunu incelemek için idealdir ve çoklu seviyelerde nicel ve nitel analiz sağlar. DSP protokolü sistematik ve kullanıcı dostudur ve proteomik verilerin özelleştirilmiş uzamsal analizine izin verir. Bu deneyde, arşivlenmiş glioblastoma çekirdek biyopsilerinden doku mikrodizileri oluşturulmuştur. Daha sonra, numune içindeki ilgili proteinleri hedefleyen bir antikor paneli seçilir. UV-fotobölünebilir DNA oligonükleotidlerine önceden konjuge edilen antikorlar daha sonra bir gecede doku örneği ile inkübe edilir. Antikorların floresan mikroskopi görselleştirmesi altında, protein ekspresyonunun ölçüleceği ilgi alanları (ROI'ler) örneklerle tanımlanır. UV ışığı daha sonra DNA oligonükleotidlerini parçalayarak her ROI'ye yönlendirilir. Oligonükleotidler mikroaspire edilir ve her ROI içinde sayılır, karşılık gelen proteini mekansal olarak ölçer.

Şekil 4 , glioblastoma örnekleri üzerinde gerçekleştirilen bir DSP deneyinin temsili sonuçlarını göstermektedir. DSP yazılımını kullanarak verileri görsel olarak yakalama yöntemlerinden birini gösteren bir ısı haritası sunulur. Satırlar protein hedeflerini temsil eder ve her sütun bir ilgi alanına karşılık gelir. Maviden kırmızıya kadar olan renk aralığı, sırasıyla düşük ila yüksek ifadeyi gösterir. Bir sıra içindeki renk değişkenliği, bölgesel pro...

Watch this Scientific Journal Video about Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma at JoVE.com

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Proteomik disregülasyon, yaygın olarak infiltre eden gliomların yayılmasında önemli bir rol oynar, ancak birkaç ilgili protein tanımlanmamıştır. Dijital mekansal işleme (DSP), infiltratif gliomların invazyonu ve göçüne katkıda bulunabilecek aday proteinlerin diferansiyel ekspresyonunu karakterize etmek için verimli, yüksek verimli bir yaklaşım sunar.

Yetişkin Tipi Yaygın Olarak Sızan Gliomada Mikroçevrenin Karakterizasyonu için Dijital Uzamsal Profilleme

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

Dijital Uzamsal Profil Oluşturma veya DSP, uzamsal olarak katmanlaştırılmış protein niceliği için etkili bir yöntem sunar. Uygulanması, bir tümörün ve mikro çevrenin farklı bölgelerinde protein ekspresyonunu karakterize etmemizi sağlar. DSP'nin önemli bir özelliği, yüksek verimli veri işlemeyi mümkün kılan çoklama yeteneğidir.Özelleştirilmiş ilgi alanlarını tanımlama yeteneği ayrıca veri analizine uzamsal bir boyut sağlar. DSP, mekansal olarak ölçülen proteinin veya RNA ekspresyonunun patolojik veya fizyolojik bir süreci aydınlatmaya yardımcı olabileceği herhangi bir numuneye uygulanabilir. Bu, özellikle bölgesel hedef değişkenliğinin malign büyüme veya istila ile ilişkili olabileceği onkolojide geçerlidir.Prosedürü gösteren, bir histoteknoloji uzmanı olan Scott Palisoul ve genomik bir teknoloji uzmanı olan Rachael Barney olacak. Slaytları hazırlamak için, her biyopsiden birkaç iki milimetrelik çekirdek alarak ve bunları tek bir doku mikroarray bloğuna koyarak başlayın. Bloktan dört mikronluk kesitler kesin ve bunları cam slaytlara monte edin.Her slaytı slayt tutucu contanın içine yerleştirin ve 30 dakika boyunca 60 santigrat derecede inkübe edin. Yarı otomatik IHC sisteminde, kabı birinci konumda slayt başına 150 mikrolitre yıkama tamponu ve beş mililitre ölü hacimle doldurun ve kapağı açık bırakın. Aynı miktarda blokaj çözeltisini ikinci pozisyondaki kaba doldurun.Reaktif kabı tepsisini makineye yükleyin. IHC'yi İşle'yi ve ardından İşaretçi alanının açılır kutusunda çözüm adını engelleyerek seçin. Tüm slaytlar için bittiğinde, Kapat'a tıklayın.Ardından Etiketleri Yazdır'a tıklayın ve Tüm slayt etiketleri henüz yazdırılmadı seçeneğini işaretleyin ve ardından Yazdır'a tıklayın. Slaytların üst kısımlarına etiketler yapıştırın. Slaytları slayt tepsisine yükleyerek numunenin ve etiketin yukarı bakmasını sağlayın.Tepsiyi indirmek için LED düğmesine basın ve cihazın slaytları taramaya ve tanımaya başlamasına izin verin. Denemeye başlamak için Başlat düğmesine tıklayın. Çalıştırma tamamlandığında, yeşil renkte yanıp söndüğünde LED düğmesine basın.Tepsiyi cihazdan çıkarın ve kapak karolarını her slayttan dikkatlice kaldırın. Slaytları 1X fosfat tamponlu salin içine yerleştirin. Fazla tamponu çıkarın ve hidrofobik bir bariyer oluşturmak için her doku bölümünü hidrofobik bir kalemle ana hatlarıyla belirtin.Slayt başına her antikorun sekiz mikrolitresini ekleyerek ve 200 mikrolitrelik son hacme ulaşmak için Tampon W kullanarak bir antikor PC oligo çözeltisi yapın. Daha sonra antikor PC oligo solüsyonunu slaytlara uygulayın ve slaytları gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, slaytları nemlendirilmiş bir tepsiye yerleştirin ve 1X TBST'de 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleme sonrası, ardından 1X TBST'de beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca SYTO 13 nükleer lekesi ekleyin, ardından 1X TBST ile iki kez yıkayın. Fareyi Denetim Merkezi'ndeki Veri Toplama'nın üzerine getirin ve Yeni'yi veya Çalışmaya Devam Et'i seçin.Slaytı, etiketi kullanıcıya doğru olacak şekilde slayt tutucuya yerleştirin. Kızak tepsisi kelepçesini indirerek dokunun uzun pencerede görülebilmesini sağlayın. Altı mililitre Buffer S.Kontrol Merkezi'ndeki istemleri izleyin.Tarama için bir bölgeyi tanımlamak üzere x ve y kaydırıcılarıyla farklı eksenler arasında yakınlaştırma yapın. Tara'yı seçin ve tanımlanan hedef alanın tamamı görüntülenene kadar taramanın devam etmesine izin verin. 20 kez görüntü oluşturun.Her doku çekirdeği için 250 mikrometre çapında eşit büyüklükte üç dairesel YG seçerek yatırım getirilerini tanımlayın. Tarama Çalışma Alanından Çık düğmesine tıklayarak YG'leri onaylayın. Daha sonra UV ışığının oligoları antikorlardan ayırmasını bekleyin.Temizleme cihazı işlemini tamamladıktan sonra, geçerli slaytlara veya plakaya devam etmek için Yeni Veri toplama'yı seçin. Plaka simgesi alanına çift tıklayarak son halini alan plaka penceresini açın. Hibridizasyon kodu paketi lot numarasını girin ve Güncelle'ye tıklayın.Ardından Sonlandır'a tıklayın. İstemleri izleyerek slayt tutucuyu ve toplama plakasını çıkarın. Slaytları TBST'de saklayın veya uzun süreli depolama için sulu bir ortamla örtün ve fişi örtün.Plakaları geçirgen bir conta kullanarak kapatın ve aspiratları 65 santigrat derecede termal bisikletçide üstleri açık olacak şekilde kurutun. Yedi mikrolitre dietil pirokarbonatla işlenmiş su ekleyin ve karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin ve ardından hızla aşağı doğru dönün.Metin protokolünde açıklandığı gibi denklemi uygulayarak uygun prob R ve prob U denklemlerini seçerek prob tampon karışımını hazırlayın. Her hibridizasyon kod paketine 84 mikrolitre prob tampon karışımı ekleyin. 96 delikli yeni bir hibridizasyon plakasında, belirtilen sıranın 12 kuyucuğunun tümüne her bir hibridizasyon kodu ana karışımından sekiz mikrolitre ekleyin.DSP toplama plakasından yedi mikrolitreyi hibridizasyon plakasındaki ilgili kuyuya aktarın. Isıl yapışma, plakayı döndürün ve gece boyunca 67 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, plakayı buz üzerinde soğutun ve hızlı bir dönüş yapın.Her bir kuyucuktan hibridizasyon ürünlerini bir şerit tüpte toplayın ve her bir kuyuyu beş kez hafifçe pipetleyin. Aşağı doğru çevirin ve şerit tüplerini analiz sistemine yükleyin. DSP cihazında, CDF dosyasını bir USB sürücüsüne kaydedin ve verileri dijital analizöre aktarın.Ekranda, İşlemi Başlat'a basın. Yüksek Duyarlılık'ı ve ardından İleri'yi seçin. Örnekli kuyu sayısı için Tümünü Seç'e, ardından Son'a ve ardından e-posta bildiriminde İleri'ye basın.Ardından Başlat'a tıklayın. Hazırlık istasyonu tamamlandıktan sonra, kartuşu kapatın ve dijital analizöre aktarın. Saymaya başla'ya basın.Sahne Alanı Konumu'nu seçin. Mevcut CDF dosyasını yükle'ye basın ve önceden yüklenmiş dosyayı seçin. Bitti'ye basın.Sahne Alanı Konumu'nu tekrar seçin, programı çalıştırmak için Bitti'ye ve ardından Başlat'a basın. Muhabir sayısı dönüştürme dosyalarının ZIP dosyasını analiz sisteminden bir USB sürücüsüne kaydedin. Sürücüyü DSP makinesine takın.DSP Denetim Merkezi'nde, fareyle Veri Toplama'nın üzerine gelin ve ardından Hesapları Yükle'ye tıklayın. İlgili ZIP dosyasını seçin. DSP Kontrol Merkezi'ndeki Kayıtlar'a tıklayın.Kuyruktaki taramaları görüntülemek için Seçili Tadımları Kuyruğa Ekle'yi ve ardından Analiz Kuyruğum'u seçin. Kontrol Merkezi'ndeki Veri Analizi seçeneğinin üzerine gelerek Kuyruktan Yeni Etüt'ü seçin. DSP deneyi glioblastoma örnekleri üzerinde gerçekleştirildi ve sonuçlar bir ısı haritası olarak görselleştirildi.Satırlar protein hedeflerini temsil eder ve her sütun bir ilgi alanına karşılık gelir. İfade düzeyi, düşük ifade gösteren maviden yüksek ifadeyi gösteren kırmızıya kadar değişen bir renk aralığıyla gösterilir. Üst üste rengin değişkenliği, bölgesel protein heterojenliğini yansıtır ve diferansiyel protein ekspresyonu ile olası bir mekansal ilişki olduğunu gösterir.Bu deneyde, S100 ve CD-56 evrensel olarak yüksekti, çünkü bunlar nöral belirteçlerdi. En fazla değişkenliğe sahip belirteçler, tümör proliferasyonu, migrasyon ve metastaz ile ilişkili olduğu bilinen B7-H3, KI-67, CD-44 ve fibronektini içerir. DSP, çok çeşitli aday hedeflerden, önemli bölgesel farklılıklar sergileyenleri belirleyebilir.Bu, değişkenlikle ilişkili faktörleri ve bunların hastalıkla olan ilgilerini araştırmak için temel oluşturur.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Diffüz İçsel Pontine Glioma Hızlı post-mortem Hücre Kültürü için Protokol (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Vivo EPR pH, pO2, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Biyolojik gliyom immünhistokimya parafin gömülü 3D tümörü Neurosphere kültürü üzerinde tarafından değerlendirilmesi

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Solid Tümör Hücre Hatlarında Yan Popülasyon analizi

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Farelerde Tümör Sızan CD8 + T Hücrelerinin Dinamiğini Değerlendirmek için Tümör Transplantasyonu

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Dokuda Protein ve RNA Ekspresyonunun Uzamsal Profillemesi: Sanal Mikrodiseksiyona İnce Ayar Yapmaya Bir Yaklaşım

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Pediatrik Diffüz Orta Hat Gliomunun Canlı 3D Hücre İmmünositokimya Testleri

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Tümör Mikroçevresinin Mikro Ölçekli Proteomik Analizi için Endüstriyelleşmiş, Yapay Zeka Rehberliğinde Lazer Mikrodiseksiyonu

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Parafin doku örneklerinin tek hücreli analizinde immünoprofilleme ve mekansal haritalama karakterizasyonu için çoklanmış barkodlama görüntü analizi

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...