Name: analysis of fecal microbiota dynamics in lupus-prone mice using a simple, cost-effective dna isolation method
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method at JoVE.com

Nous apprécions l’aide du laboratoire national d’Argonne et de nos bioinformaticiens collaborateurs. Ce travail est soutenu par diverses subventions internes et NIH.

Le locus gfp/gfp Cx3cr1 des souris B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J a été rétrocroisé avec MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) pendant 10 générations pour générer des souris MRL/lpr-CX 3 CR1 gfp/gfp. Le criblage du génome à l’aide de panels de polymorphisme mononucléotidique (SNP) a confirmé que le fond génétique des souris nouvellement générées était identique à plus de 97% à celui de MRL / lpr. Après cela, les souris ont été élevées...

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	<li>Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Has+the+microbiota+played+a+critical+role+in+the+evolution+of+the+adaptive+immune+system.">Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system.</a> Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).</li><li>Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+T-cell+responses+to+gut+microbiota+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4615-4622 (2011).</li><li>Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+microbiome+in+rheumatic+diseases.">The role of the microbiome in rheumatic diseases.</a> Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314 (2013).</li><li>Larsen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota+in+human+adults+with+type+2+diabetes+differs+from+non-diabetic+adults.">Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults.</a> PLoS One. 5 (2), 9085 (2010).</li><li>Alam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+imbalance+in+inflammatory+bowel+disease+patients+at+different+taxonomic+levels.">Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels.</a> Gut Pathogens. 12 (1), (2020).</li><li>Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet,+microbiota+and+autoimmune+diseases.">Diet, microbiota and autoimmune diseases.</a> Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).</li><li>Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLE:+another+autoimmune+disorder+influenced+by+microbes+and+diet.">SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet.</a> Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).</li><li>Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+serious+infections+in+adults+with+systemic+lupus+erythematosus:+a+national+population-based+study.">Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study.</a> Arthritis Care &amp; Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).</li><li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota.">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73 (2017).</li><li>Panek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+challenges+in+studying+human+gut+microbiota+-+effects+of+collection,+storage,+DNA+extraction+and+next+generation+sequencing+technologies.">Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).</li><li>Fiedorov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+dna+extraction+methods+on+stool+bacterial+and+fungal+microbiota+community+recovery.">The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).</li><li>Gerasimidis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+DNA+extraction+methodology+on+gut+microbiota+research+applications.">The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications.</a> BMC Research Notes. 9, 365 (2016).</li><li>Bukin, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results.">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).</li><li>Galloway-Pe&#241;a, J., Hanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+analysis+of+the+microbiome.">Tools for analysis of the microbiome.</a> Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).</li><li>Sharpton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+analysis+of+shotgun+metagenomic+data.">An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).</li></ol>

Un microbiote intestinal équilibré peut protéger le corps humain contre les maladies. Une fois que cet équilibre est perturbé par des déclencheurs externes ou internes, les conséquences peuvent être dévastatrices. Cette méthode présente un moyen d’analyser la dynamique du microbiote intestinal dans des modèles murins. La méthode convient non seulement aux comparaisons entre groupes, mais aussi au suivi du microbiote intestinal au fil du temps afin de mieux identifier les facteurs dépendants du temps qui p...

Les humains et les bactéries coexistent depuis longtemps. Ils ont établi une relation de codépendance avec des effets bénéfiques mutuels qui influencent les réponses immunitaires de l’hôte de manière quantitative et qualitative1. Des études récentes suggèrent une association entre la composition du microbiote intestinal et la pathogenèse des maladies auto-immunes qui comprennent la sclérose en plaques 2, la polyarthrite rhumatoïde3, le diabète de type2 4, la maladie inflammatoire de l’intestin5 et le lupus érythémateux disséminé (LED)6. Cependant, on ne sait toujours pas si le microbiote intestinal est la cause principale ou un effet secondaire de ces maladies auto-immunes7. Potentiellement, le microbiote intestinal pourrait exacerber la maladie pendant la phase effectrice des maladies auto-immunes ou jouer un rôle dans la régulation de l’induction de ces maladies8.
Une dysbiose intestinale a été rapportée chez des souris femelles MRL/Mp-Faslpr (LMR/lpr) sujettes au lupus, et des modifications du microbiote intestinal avec une déplétion significative des lactobacilles ont été observées9. Lorsqu’un mélange de cinq souches de Lactobacillus a été administré par voie orale, les symptômes de type lupus ont été largement atténués chez ces souris, suggérant un rôle essentiel du microbiote dans la régulation de la pathogenèse du LED.
La technique suivante d’extraction d’ADN permet de suivre les fluctuations du microbiote et de les analyser qualitativement et quantitativement au cours de l’évolution de la maladie de type LED murin chez les souris sujettes au lupus. Qu’il s’agisse d’examiner le microbiote intestinal sain ou de définir la dysbiose, il est important d’examiner de manière critique comment les données sont collectées et si elles sont exactes et reproductibles10. Chaque étape est essentielle dans ce processus. Une méthodologie appropriée doit être utilisée pour extraire l’ADN microbien, car tout problème éventuel introduisant des biais pendant le processus d’extraction de l’ADN pourrait entraîner une représentation microbienne inexacte. Bien que la méthode phénol-chloroforme soit décrite ici, il existe des kits disponibles dans le commerce pour extraire l’ADN de bactéries qui fonctionnent bien dans des cas particuliers11. Cependant, leur facilité d’utilisation est limitée par le coût et la quantité d’échantillon requise.
Le protocole présenté ici est rentable et ne nécessite qu’une petite quantité d’échantillon. Il fonctionne bien avec n’importe quel type d’échantillon de selles et est utile pour étudier la dynamique du microbiote intestinal au fil du temps ainsi que les comparaisons entre les groupes. L’ADN est isolé avec une méthode de purification de l’alcool, qui utilise du phénol, du chloroforme et de l’alcool isoamylique. L’extraction à base d’alcool aide à nettoyer et à éliminer l’échantillon de protéines et de lipides, où l’ADN est précipité à l’étape finale. La méthode proposée a une efficacité et une qualité significativement élevées et s’est avérée précise dans l’identification des populations bactériennes. Une remarque critique au cours de la procédure est que la contamination de l’ADN peut se produire, et donc une manipulation appropriée des échantillons est nécessaire12.
L’ADN est ensuite analysé par les plateformes de séquençage de nouvelle génération pour le gène de l’ARNr 16S, tel que l’Illumina MiSeq. En particulier, la région hyper-variable V4 est analysée pour fournir une meilleure quantification pour les taxons de rangélevé 13. L’analyse bioinformatique ultérieure est externalisée, suivie d’une analyse interne utilisant des méthodes statistiques standard. Il existe de nombreux logiciels bioinformatiques open source disponibles pour le séquençage en aval, et le type d’analyses effectuées dépend fortement de la question biologique spécifique d’intérêt14. Ce protocole se concentre spécifiquement sur les étapes expérimentales précédant le séquençage et fournit une méthode plus polyvalente, rentable, comparable et efficace pour obtenir de l’ADN à partir d’échantillons fécaux.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% SDS</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td>SDS 20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T032021000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate (5 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9071</td>
			<td>NH4AC 5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>005582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender storm 24</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>4116-BBY24M</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil plate seal</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>NC0302491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes-Kimtech 34256</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>06-666C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 spectrophotomer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1752I-400</td>
			<td>PCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale with 4 decimals</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MS205DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skirted 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>15528154</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fecal microbiota dynamics in lupus-prone mice using a simple, cost-effective dna isolation method

Le microbiote intestinal joue un rôle important dans l’éducation du système immunitaire. Cette relation est extrêmement importante pour comprendre les maladies auto-immunes qui ne sont pas seulement motivées par des facteurs génétiques, mais aussi par des facteurs environnementaux qui peuvent déclencher l’apparition et / ou aggraver l’évolution de la maladie. Une étude publiée précédemment sur la dynamique du microbiote intestinal chez les souris femelles LMR/LPR sujettes au lupus a montré comment les changements du microbiote intestinal peuvent modifier la progression de la maladie. Ici, un protocole est décrit pour extraire des échantillons représentatifs du microbiote intestinal pour des études d’auto-immunité. Des échantillons de microbiote sont prélevés dans l’anus et traités, à partir desquels l’ADN est extrait selon une méthode phénol-chloroforme et purifié par précipitation alcoolique. Une fois la PCR effectuée, les amplicons purifiés sont séquencés à l’aide d’une plate-forme de séquençage de nouvelle génération au laboratoire national d’Argonne. Enfin, les données de séquençage du gène de l’ARN ribosomique 16S sont analysées. À titre d’exemple, les données obtenues à partir de comparaisons du microbiote intestinal de souris LMR/LPR avec ou sans CX3CR1 sont présentées. Les résultats ont montré des différences significatives dans les genres contenant des bactéries pathogènes telles que celles du phylum Proteobacteria, ainsi que du genre Bifidobacterium, qui est considéré comme faisant partie du microbiote commensale sain. En résumé, cette méthode simple et rentable d’isolement de l’ADN est fiable et peut aider à étudier les changements du microbiote intestinal associés aux maladies auto-immunes.

Les résultats de l’Argonne National Laboratory sont analysés par un bioinformaticien qualifié, suivis d’une analyse interne des données à l’aide de méthodes statistiques standard. Les analyses typiques du microbiome impliquent le regroupement de séquences similaires en unités taxonomiques opérationnelles (OTU) ou en variantes de séquence d’amplicon (ASV) comme proxy pour différents micro-organismes dans un échantillon. Les comptages d’OTU ou d’ASV dans les échantillons peuvent ensuite être utili...

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Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method

Ce protocole fournit une méthode d’isolement de l’ADN simple et rentable pour l’analyse des altérations du microbiote intestinal murin au cours du développement de maladies auto-immunes.

Analyse de la dynamique du microbiote fécal chez les souris sujettes au lupus à l’aide d’une méthode simple et rentable d’isolement de l’ADN

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that ...

La méthode d’isolement de l’ADN proposée peut servir à étudier la dynamique du microbiote intestinal dans des modèles murins de maladies auto-immunes. Une méthode plus polyvalente, rentable et efficace est proposée pour obtenir de l’ADN à partir d’échantillons fécaux comparables aux trousses disponibles dans le commerce. Pour commencer, sortez chaque souris individuellement de sa cage, collectez une pastille fécale directement dans l’anus et conservez-la à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit traitée.Traiter les échantillons avec des pinces, des tubes et des gants stériles et propres. Ajoutez une pastille congelée à un tube à vis pré-pesé de deux millilitres et notez le poids fécal en grammes, qui devrait se situer entre 0,02 et 0,05 gramme par granulé fécal. Ajouter à la pastille une fine couche de billes de verre de 0,1 millimètre, 500 microlitres de tampon de lyse et 200 microlitres de dodécylsulfate de sodium à 20%.Bead a battu le tube pendant quatre minutes dans un homogénéisateur, suivi de trois à cinq minutes de vortex. Centrifuger les tubes pendant une courte période pour éliminer les bulles et la mousse. Pour extraire l’ADN des échantillons de microbiote, transférer 350 microlitres de surnageant d’échantillon dans un nouveau tube à pression de 1,5 millilitres, sans aucun débris.Ajouter 500 microlitres de phénol:chloroforme:alcool isoamylique, dans un rapport de 25:24:1, et vortex pendant une minute. Après centrifugation, transférer 180 microlitres de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube à pression de 1,5 millilitre. Ajouter 180 microlitres de chloroforme, retourner et mélanger.À partir de là, transférez 180 microlitres de la phase aqueuse dans un nouveau tube à pression. Dans une armoire de biosécurité, ajoutez 180 microlitres d’isopropanol froid et 36 microlitres d’acétate d’ammonium à cinq molaires. Inversez-le plusieurs fois pour mélanger et placez le tube sur de la glace pendant 20 minutes.Jeter le surnageant, puis laver les granulés plusieurs fois avec 500 microlitres d’éthanol froid à 70%. Jeter le surnageant et sécher le tube à l’air sur du papier de soie à l’envers pendant 20 minutes, jusqu’à ce que la pastille devienne claire. Suspendre la pastille dans 50 microlitres d’eau de qualité moléculaire et chauffer le liquide à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes pour dissoudre complètement les grosses pastilles d’ADN.Après chauffage, centrifuger ces tubes à 3 400 fois G pendant une minute pour récupérer les gouttelettes de condensation du couvercle. Mesurer la concentration et obtenir le rapport 260/280 à l’aide d’un spectrophotomètre. Un rapport pour un ADN de bonne qualité est généralement compris entre 1,8 et deux.Centrifuger les échantillons préparés à 600 fois G pendant une minute à température ambiante, avant de les congeler à moins 80 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, envoyez 20 microlitres d’échantillons avec des concentrations allant de un à 50 nanogrammes par microlitre au laboratoire national d’Argonne pour le séquençage. La souche de souris dépourvue du récepteur CX3CR1 a une composition de microbiote intestinal différente de celle des souris LMR/lpr de type sauvage, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP, montre des différences significatives dans certains genres, pertinentes pour les bactéries potentiellement pathogènes telles que celles du phylum Proteobacteria.Soyez prudent lorsque vous contaminez l’échantillon. Il doit être stérile. En outre, il est important de pipeter avec précision lors du transfert du surnageant dans un nouveau tube.Cette méthode convient à l’analyse moléculaire telle que la PCR, la digestion enzymatique de restriction ou la construction de bibliothèques génomiques. Dans le lupus, nous avons prouvé une forte relation entre le microbiote intestinal et la progression du lupus.

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