Name: analysis of fecal microbiota dynamics in lupus-prone mice using a simple, cost-effective dna isolation method
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method at JoVE.com

Agradecemos a ajuda do Laboratório Nacional Argonne e de nossos bioinformáticos colaboradores. Este trabalho é apoiado por vários subsídios internos e do NIH.

O locus Cx3cr1 gfp/gfp de camundongos B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J foi retrocruzado para camundongos MRL/MpJ-Fas lpr/J (MRL/lpr) por 10 gerações para gerar camundongos MRL/lpr-CX 3 CR1 gfp/gfp. A triagem do genoma usando painéis de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) confirmou que o fundo genético de camundongos recém-gerados era mais de 97% idêntico ao do LMR/lpr. Depois disso, os camundongos foram criados e mantidos em um ambiente espe...

<ol>
	<li>Lee, Y. K., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Has+the+microbiota+played+a+critical+role+in+the+evolution+of+the+adaptive+immune+system.">Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system.</a> Science. 330 (6012), 1768-1773 (2010).</li><li>Lee, Y. K., Menezes, J. S., Umesaki, Y., Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+T-cell+responses+to+gut+microbiota+promote+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Proinflammatory T-cell responses to gut microbiota promote experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 4615-4622 (2011).</li><li>Yeoh, N., Burton, J. P., Suppiah, P., Reid, G., Stebbings, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+microbiome+in+rheumatic+diseases.">The role of the microbiome in rheumatic diseases.</a> Current Rheumatology Reports. 15 (3), 314 (2013).</li><li>Larsen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota+in+human+adults+with+type+2+diabetes+differs+from+non-diabetic+adults.">Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic adults.</a> PLoS One. 5 (2), 9085 (2010).</li><li>Alam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+imbalance+in+inflammatory+bowel+disease+patients+at+different+taxonomic+levels.">Microbial imbalance in inflammatory bowel disease patients at different taxonomic levels.</a> Gut Pathogens. 12 (1), (2020).</li><li>Vieira, S. M., Pagovich, O. E., Kriegel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet,+microbiota+and+autoimmune+diseases.">Diet, microbiota and autoimmune diseases.</a> Lupus. 23 (6), 518-526 (2014).</li><li>Mu, Q., Zhang, H., Luo, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLE:+another+autoimmune+disorder+influenced+by+microbes+and+diet.">SLE: another autoimmune disorder influenced by microbes and diet.</a> Frontiers of Immunology. 6, 608 (2015).</li><li>Tektonidou, M. G., Wang, Z., Dasgupta, A., Ward, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+serious+infections+in+adults+with+systemic+lupus+erythematosus:+a+national+population-based+study.">Burden of serious infections in adults with systemic lupus erythematosus: a national population-based study.</a> Arthritis Care &amp; Research. 67 (8), 1078-1085 (2015).</li><li>Mu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lupus+nephritis+by+changes+of+gut+microbiota.">Control of lupus nephritis by changes of gut microbiota.</a> Microbiome. 5 (1), 73 (2017).</li><li>Panek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+challenges+in+studying+human+gut+microbiota+-+effects+of+collection,+storage,+DNA+extraction+and+next+generation+sequencing+technologies.">Methodology challenges in studying human gut microbiota - effects of collection, storage, DNA extraction and next generation sequencing technologies.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5143 (2018).</li><li>Fiedorov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+dna+extraction+methods+on+stool+bacterial+and+fungal+microbiota+community+recovery.">The impact of dna extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 821 (2019).</li><li>Gerasimidis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+DNA+extraction+methodology+on+gut+microbiota+research+applications.">The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications.</a> BMC Research Notes. 9, 365 (2016).</li><li>Bukin, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+16S+rRNA+region+choice+on+bacterial+community+metabarcoding+results.">The effect of 16S rRNA region choice on bacterial community metabarcoding results.</a> Scientific Data. 6 (1), 190007 (2019).</li><li>Galloway-Pe&#241;a, J., Hanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+analysis+of+the+microbiome.">Tools for analysis of the microbiome.</a> Digestive Diseases and Sciences. 65 (3), 674-685 (2020).</li><li>Sharpton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+analysis+of+shotgun+metagenomic+data.">An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 209 (2014).</li></ol>

A microbiota intestinal equilibrada pode proteger o corpo humano de doenças. Uma vez que esse equilíbrio é interrompido por gatilhos externos ou internos, as consequências podem ser devastadoras. Este método apresenta uma forma de analisar a dinâmica da microbiota intestinal em modelos murinos. O método é adequado não apenas para comparações entre grupos, mas também para rastrear a microbiota intestinal ao longo do tempo para identificar melhor os fatores dependentes do tempo que perturbam a microbiota intest...

Humanos e bactérias coexistem há muito tempo. Eles estabeleceram uma relação codependente com efeitos benéficos mútuos que influencia as respostas imunes do hospedeiro de forma quantitativa e qualitativa1. Estudos recentes sugerem uma associação entre a composição da microbiota intestinal e a patogênese de doenças autoimunes que incluem esclerose múltipla 2, artrite reumatoide3, diabetes tipo2 4, doença inflamatória intestinal5 e lúpus eritematoso sistêmico (LES)6. No entanto, ainda não está claro se a microbiota intestinal é a principal causa ou um efeito secundário dessas doenças autoimunes7. Potencialmente, a microbiota intestinal poderia exacerbar a doença durante a fase efetora de doenças autoimunes ou desempenhar um papel na regulação da indução dessas doenças8.
Disbiose intestinal foi relatada em camundongos fêmeas com LMR/Mp-Faslpr (LMR/lpr) propensos a lúpus, e alterações na microbiota intestinal com uma depleção significativa de Lactobacilos foram observadas9. Quando uma mistura de cinco cepas de Lactobacillus foi administrada por via oral, sintomas semelhantes ao lúpus foram amplamente atenuados nesses camundongos, sugerindo um papel essencial da microbiota na regulação da patogênese do LES.
A seguinte técnica de extração de DNA permite acompanhar as flutuações da microbiota e analisá-las qualitativa e quantitativamente durante o curso da doença murina semelhante ao LES em camundongos propensos ao lúpus. Seja para examinar a microbiota intestinal saudável ou definir disbiose, é importante examinar criticamente como os dados são coletados e se são precisos e reprodutíveis10. Cada passo é fundamental nesse processo. Deve ser utilizada uma metodologia adequada para extrair ADN microbiano, uma vez que qualquer possível problema que introduza vieses durante o processo de extracção de ADN pode resultar numa representação microbiana imprecisa. Embora o método fenol-clorofórmio seja descrito aqui, existem kits comercialmente disponíveis para extrair DNA de bactérias que funcionam bem em casos particulares11. No entanto, sua usabilidade é limitada pelo custo e pela quantidade de amostra necessária.
O protocolo aqui apresentado é custo-efetivo e requer apenas uma pequena quantidade de amostra. Ele funciona bem com qualquer tipo de amostra de fezes e é útil no estudo da dinâmica da microbiota intestinal ao longo do tempo, bem como comparações entre grupos. O DNA é isolado com um método de purificação de álcool, que usa fenol, clorofórmio e álcool isoamílico. A extração à base de álcool ajuda a limpar e remover a amostra de proteínas e lipídios, onde o DNA é precipitado na etapa final. O método proposto tem eficiência e qualidade significativamente altas e provou ser preciso na identificação de populações bacterianas. Uma observação crítica durante o procedimento é que a contaminação do DNA pode ocorrer e, portanto, o manuseio adequado da amostra é necessário12.
O DNA é então analisado pelas plataformas Next Generation Sequencing para o gene 16S rRNA, como o Illumina MiSeq. Em particular, a região hipervariável V4 é analisada para fornecer uma melhor quantificação para táxons de alto nível13. A análise bioinformática subsequente é terceirizada, seguida de análise interna usando métodos estatísticos padrão. Existem inúmeros softwares de bioinformática de código aberto disponíveis para sequenciamento a jusante, e o tipo de análise realizada depende fortemente da questão biológica específica de interesse14. Este protocolo se concentra especificamente nas etapas experimentais anteriores ao sequenciamento e fornece um método mais versátil, econômico, comparável e eficiente para obter DNA de amostras fecais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 mm glass beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% SDS</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1311-1</td>
			<td>SDS 20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% Ethanol, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T032021000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate (5 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9071</td>
			<td>NH4AC 5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>005582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender storm 24</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>4116-BBY24M</td>
			<td>Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-Treated Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil plate seal</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>NC0302491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes-Kimtech 34256</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>06-666C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>000485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 spectrophotomer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: chloroform: isoamylalchohol (25:24:1)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1752I-400</td>
			<td>PCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale with 4 decimals</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MS205DU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skirted 96-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>15528154</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP1757-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fecal microbiota dynamics in lupus-prone mice using a simple, cost-effective dna isolation method

A microbiota intestinal tem um papel importante na educação do sistema imunológico. Essa relação é extremamente importante para a compreensão de doenças autoimunes que não são apenas impulsionadas por fatores genéticos, mas também por fatores ambientais que podem desencadear o início e/ou piorar o curso da doença. Um estudo publicado anteriormente sobre a dinâmica da microbiota intestinal em camundongos fêmeas MRL/lpr propensas ao lúpus mostrou como as mudanças da microbiota intestinal podem alterar a progressão da doença. Aqui, um protocolo é descrito para extrair amostras representativas da microbiota intestinal para estudos de autoimunidade. Amostras de microbiota são coletadas do ânus e processadas, das quais o DNA é extraído usando um método fenol-clorofórmio e purificado por precipitação de álcool. Após a execução da PCR, os amplificadores purificados são sequenciados usando uma plataforma de sequenciamento de próxima geração no Argonne National Laboratory. Finalmente, os dados de sequenciamento do gene do RNA ribossômico 16S são analisados. Como exemplo, são mostrados dados obtidos a partir de comparações da microbiota intestinal de camundongos MRL/lpr com ou sem CX3CR1. Os resultados mostraram diferenças significativas em gêneros contendo bactérias patogênicas, como as do filo Proteobacteria, bem como do gênero Bifidobacterium, que é considerado parte da microbiota comensal saudável. Em resumo, este método de isolamento de DNA simples e econômico é confiável e pode ajudar na investigação de alterações da microbiota intestinal associadas a doenças autoimunes.

Os resultados do Argonne National Laboratory são analisados por um bioinformático qualificado, seguido por uma análise interna dos dados usando métodos estatísticos padrão. As análises típicas do microbioma envolvem o agrupamento de sequências semelhantes em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) ou variantes de sequência amplicon (ASVs) como proxy para diferentes microrganismos em uma amostra. As contagens de OTUs ou ASVs entre amostras podem então ser usadas para testar mudanças na diversidade dentro da ...

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Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method

Este protocolo fornece um método de isolamento de DNA simples e econômico para a análise de alterações da microbiota intestinal murina durante o desenvolvimento de doenças autoimunes.

Análise da dinâmica da microbiota fecal em camundongos propensos a lúpus usando um método de isolamento de DNA simples e econômico

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that ...

O método de isolamento de DNA proposto pode servir para estudar a dinâmica da microbiota intestinal em modelos de camundongos com doenças autoimunes. Um método mais versátil, econômico e eficiente é proposto para obter DNA de amostras fecais que são comparáveis aos kits comercialmente disponíveis. Para começar, tire cada rato individualmente de sua gaiola, colete uma pelota fecal diretamente do ânus e armazene-a a menos 80 graus Celsius até ser processada.Processe as amostras com pinças, tubos e luvas estéreis e limpos. Adicione um pellet congelado a um tubo de tampa de rosca pré-pesado de dois mililitros e registre o peso fecal em gramas, que deve estar entre 0,02 a 0,05 gramas por pellet fecal. Adicione ao pellet uma fina camada de contas de vidro de 0,1 milímetro, 500 microlitros de tampão de lise e 200 microlitros de dodecil sulfato de sódio a 20%.Bead bateu o tubo por quatro minutos em um homogeneizador, seguido por três a cinco minutos de vórtice. Centrifugar os tubos por um curto período de tempo para eliminar as bolhas e espuma. Para extrair DNA das amostras de microbiota, transfira 350 microlitros de sobrenadante de amostra para um novo tubo de tampa de encaixe de 1,5 mililitros, sem detritos.Adicione 500 microlitros de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico, na proporção de 25:24:1, e o vórtice durante um minuto. Após a centrifugação, transfira 180 microlitros da fase aquosa superior para um novo tubo de tampa de encaixe de 1,5 mililitro. Adicione 180 microlitros de clorofórmio, inverta e misture.A partir disso, transfira 180 microlitros da fase aquosa para um novo tubo de encaixe. Em um armário de biossegurança, adicione 180 microlitros de isopropanol frio e 36 microlitros de acetato de amônio cinco molares. Inverta-o algumas vezes para misturar e coloque o tubo no gelo por 20 minutos.Descarte o sobrenadante, seguido de lavar os pellets várias vezes com 500 microlitros de etanol a 70% frio. Descarte o sobrenadante e seque o tubo de cabeça para baixo em papel de seda por 20 minutos, até que o pellet fique claro. Suspenda o pellet em 50 microlitros de água de grau molecular e aqueça o líquido a 37 graus Celsius por 10 minutos para dissolver completamente grandes pellets de DNA.Após o aquecimento, centrifugar esses tubos a 3, 400 vezes G por um minuto para recuperar as gotículas de condensação da tampa. Meça a concentração e obtenha a relação 260/280 usando um espectrofotômetro. Uma proporção para DNA de boa qualidade é geralmente entre 1,8 e dois.Centrifugar as amostras preparadas a 600 vezes G durante um minuto à temperatura ambiente, antes de congelar a menos 80 graus Celsius durante 24 horas. Em seguida, envie 20 microlitros de amostras com concentrações que variam de um a 50 nanogramas por microlitro para o Argonne National Laboratory para sequenciamento. A estirpe de ratinho sem o recetor CX3CR1 tem uma composição de microbiota intestinal diferente em comparação com ratinhos do tipo selvagem MRL/lpr, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP, apresenta diferenças significativas em certos géneros, relevantes para bactérias potencialmente patogénicas, como as do filo Proteobacteria.Tenha cuidado com a contaminação da amostra. Precisa ser estéril. Além disso, é importante pipetar com precisão ao transferir o sobrenadante em um novo tubo.Este método é adequado para análises moleculares, como PCR, digestão de enzimas de restrição ou construção de bibliotecas genômicas. No lúpus, provamos uma forte relação entre a microbiota intestinal e a progressão do lúpus.

Research

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