Name: identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays
Uploaded: 2022-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) med et tilskudsnummer IT200819. Forfatterne anerkender Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC, for at kontrollere den engelske grammatik i dette manuskript; og teknisk bistand fra Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada) og Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). Vi takker også Dr. Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) for at have fået fåreblod. Vi takker især Dr. José Saniger Blesa, ICAT-UNAM, for faciliteterne i hans laboratorium til videooptagelsen.

Søanemonerne blev indsamlet i henhold til retningslinjer fra National Commission for Aquaculture, Fisheries and Food fra Mexicos føderale regering (tilladelsesnummer PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Bioetikudvalget ved Institut for Bioteknologi, National Autonomous University of Mexico godkendte alle eksperimenter med havanemoner. Fåreblodprøven blev købt på Center for Praktisk Undervisning og Forskning i Animalsk Produktion og Sundhed (CEPIPSA, National Autonomous University of Mexico).
<...

<ol>
	<li>Fraz&#227;o, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+anemone+(Cnidaria,+Anthozoa,+Actiniaria)+toxins:+an+overview.">Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview.</a> Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).</li><li>Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnidarian+toxins:+recent+evidences+for+potential+therapeutic+uses.">Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses.</a> The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodr&#237;guez-Almaz&#225;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actinoporins:+From+the+structure+and+function+to+the+generation+of+biotechnological+and+therapeutic+tools.">Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools.</a> Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).</li><li>Fautin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+diversity,+systematics,+and+evolution+of+cnidae.+Toxicon.">Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon.</a> Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).</li><li>Moran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+soluble+protein+contents+from+the+nematocysts+of+a+model+sea+anemone+sheds+light+on+venom+evolution.">Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution.</a> Marine Biotechnology. 15 (3), 329-339 (2013).</li><li>Moran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxin+localization+to+ectodermal+gland+cells+uncovers+an+alternative+mechanism+of+venom+delivery+in+sea+anemones.">Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).</li><li>Grabski, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+preparation+of+biological+extracts+for+protein+purification.">Advances in preparation of biological extracts for protein purification.</a> Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).</li><li>Bulati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partially+purified+extracts+of+sea+anemone+Anemonia+viridis+affect+the+growth+and+viability+of+selected+tumour+cell+lines.">Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines.</a> BioMed Research International. 2016, 3849897 (2016).</li><li>Orts, D. J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+electrophysiological+characterization+of+two+sea+anemone+type+1+potassium+toxins+from+a+geographically+distant+population+of+Bunodosoma+caissarum.">Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum.</a> Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).</li><li>Hader, D., Erzinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioassays: Advanced Methods and Applications. , (2017).</li><li>Anderluh, G., Macek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytolytic+peptide+and+protein+toxins+from+sea+anemones+(Anthozoa:+Actiniaria).">Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria).</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).</li><li>Nevalainen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+A2+in+cnidaria.">Phospholipase A2 in cnidaria.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry &amp; Molecular Biology. 139 (4), 731-735 (2004).</li><li>Razpotnik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+phospholipase+A2+isolated+from+the+sea+anemone+Urticina+crassicornis+-+its+primary+structure+and+phylogenetic+classification.">A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis - its primary structure and phylogenetic classification.</a> The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).</li><li>Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -. H., Magrioti, V., Kokotos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+A2+enzymes:+Physical+structure,+biological+function,+disease+implication,+chemical+inhibition,+and+therapeutic+intervention.">Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention.</a> Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+a+venom+extract+from+the+sea+anemone,+Bunodosoma+cavernata.">Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).</li><li>Morales-Landa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial,+antiprotozoal,+and+toxic+activities+of+Cnidarian+extracts+from+the+Mexican+Caribbean+Sea.">Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea.</a> Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).</li><li>S&#225;nchez-Rodr&#237;guez, J., Cruz-Vazquez, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+biological+characterization+of+neurotoxic+compounds+from+the+sea+anemone+Lebrunia+danae+(Duchassaing+and+Michelotti,+1860).">Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860).</a> Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).</li><li>de Oliveira, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caissarolysin+I+(Bcs+I),+a+new+hemolytic+toxin+from+the+Brazilian+sea+anemone+Bunodosoma+caissarum:+purification+and+biological+characterization.">Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).</li><li>Norton, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterisation+of+proteins+with+cardiac+stimulatory+and+haemolytic+activity+from+the+anemone+Actinia+tenebrosa.">Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).</li><li>Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crude+extract+from+the+sea+anemone,+Bunodosoma+caissarum+elicits+convulsions+in+mice:+possible+involvement+of+the+glutamatergic+system.">The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).</li><li>Dion, A. S., Pomenti, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammoniacal+silver+staining+of+proteins:+mechanism+of+glutaraldehyde+enhancement.">Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement.</a> Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pore-forming+protein+from+sea+anemone+Anthopleura+dowii+Verrill+(1869)+venom+by+mass+spectrometry.">Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry.</a> The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).</li><li>Nelson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+lipids+of+sheep+red+blood+cells.+I.+Lipid+composition+in+low+and+high+potassium+red+cells.">Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells.</a> Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+and+proteomic+analysis+of+the+tentacles+and+mucus+of+Anthopleura+dowii+Verrill,+1869.">Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869.</a> Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).</li></ol>

Den store efterspørgsel efter nye forbindelser med anvendelser inden for forskellige områder af videnskab og industri har ført til undersøgelsen af gift. Gift repræsenterer en rig kilde til molekyler, der tjener som en skabelon til generering af nye molekylære værktøjer. Kompleksiteten af disse gifte kræver imidlertid implementering og kombination af forskellige metoder til at opnå og studere dem.
Her viser vi en metode til at opnå og analysere giften fra havanemonen Anthopleura...

Havdyr er en rig kilde til biologisk aktive forbindelser. I de seneste årtier har sammensætningen af havanemongift tiltrukket sig videnskabelig opmærksomhed, da den omfatter en mangfoldighed af polypeptider med hæmolytisk, cytotoksisk, enzymatisk (phospholipase, protease, chitinase) og neurotoksisk aktivitet og hæmmende virkninger på proteolytisk aktivitet1. Derudover er disse polypeptider potentielle kilder til udvikling af molekylære værktøjer i bioteknologisk og terapeutisk anvendelse 2,3.
Der er få rapporter om havanemonegift og dets molekylære komponenter på grund af kompleksiteten ved at opnå giften, endda isolering og karakterisering af toksiner. De ekstraktionsmetoder, der blev anvendt i rapporterne, involverede lysis og tømning af indholdet af celler, der er relateret til og ikke relateret til giftproduktionen1.
Et særligt kendetegn hos alle cnidarians er fraværet af et system til produktion og frigivelse af giften centraliseret i en enkelt anatomisk region. I stedet er nematocysterne strukturer, der holder giften 4,5. Andre typer celler, kaldet epidermale kirtelceller, udskiller også toksiner og fordeles også i hele kroppen af havanemoner6.
Den første og mest afgørende udfordring ved at opnå giften er dannelsen af et ekstrakt med tilstrækkelig manipulation i efterfølgende processer uden inaktivering eller nedbrydning af labile proteiner. Dernæst skal cellerne lyseres, og komponenterne - i dette tilfælde polypeptider skal ekstraheres effektivt og hurtigt, idet proteolyse og hydrolyse undgås, samtidig med at andre cellulære komponenter elimineres7.
Forskellige metoder anvendes til at opnå det rå ekstrakt af en søanemone; nogle involverer at ofre organismen, mens andre tillader den at blive holdt i live. Metoder, der indebærer anvendelse af organismens hele krop, giver mulighed for frigivelse af de fleste toksiner fra giften8 sammenlignet med metoder, der holder organismer i live, som kun ekstraherer nogle komponenter i giften9. Fremstillingen af et ekstrakt kræver evaluering af tilstedeværelsen og styrken af et stof af interesse gennem et specifikt bioassay, som omfatter strategier til at observere de farmakologiske virkninger ved in vivo- eller in vitro-metoder 10.
Havanemongift indeholder cytolytiske polypeptider, poredannende toksiner (PFT'er)11 og phospholipaser12; disse molekyler er modeller i studiet af protein-lipidinteraktion, molekylære værktøjer i kræftterapi og biosensorer baseret på nanopore3. Klassificeringen af havanemon pft'er udføres i henhold til deres størrelse eller molekylvægt, fra 5 kDa til 80 kDa. 20 kDa PFT, den mest undersøgte og kendt som actinoporiner11, er af særlig interesse for sit biomedicinske potentiale i udviklingen af molekylære værktøjer til mulige anvendelser som anticancer-, antimikrobielle og nanoporebaserede biosensorer. Et andet cytolysin, herunder phospholipaser, specifikt phospholipase A2 (PLA2)13, frigiver en fedtsyre på grund af og hydrolyserer phospholipider, destabiliserer cellemembranen. På grund af denne virkningsmekanisme lover PLA2 at være en væsentlig model for undersøgelse og anvendelser i inflammatoriske sygdomme. Det kunne tjene som en model for undersøgelser af lipidadfærd i cellemembranen14.
Her beskriver vi en effektiv protokol til opnåelse af råekstraktet fra havanemonen Anthopleura dowii Verrill, 1869, og påvisning af hæmolysiner og phospholipaser. Begge er relevante toksiner, der kan bruges som skabelon til at designe nye molekylære værktøjer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B75808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoetanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9515-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assays</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 96 well, V-bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear flat.bottom 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1916-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ductless Enclosure</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Vertical</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ</td>
			<td>Bio Rad.</td>
			<td></td>
			<td>Gel Documentation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Software)</td>
			<td>NIH, USA</td>
			<td>Version 1.53c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 211</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5211 DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9049-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN tetra cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3824-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3818-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td></td>
			<td>version 9</td>
			<td>To design the plot with sigmoidal adjustments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman kit</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast mini gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3646-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>G10S UV-VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt Power Supply</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PS300B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays

Havanemongiftsammensætning indbefatter polypeptid- og ikke-proteinmolekyler. Cytolytiske komponenter har et højt bioteknologisk og biomedicinsk potentiale til at designe nye molekylære værktøjer. Havanemongift lokaliserer i kirtelceller fra ektoderm og subcellulære strukturer kaldet nematocysts, som begge er fordelt over hele havanemonens krop. Denne egenskab indebærer udfordringer, fordi cellerne og nematocystet skal lyseres for at frigive giftkomponenterne med andre ikke-toksiske molekyler. Derfor er giften for det første afledt af et råekstrakt (blanding af forskellige og forskellige molekyler og vævsaffald). Det næste skridt er at detektere polypeptider med specifikke bioaktiviteter. Her beskriver vi en effektiv strategi for at opnå havanemonens råekstrakt og bioassay for at identificere tilstedeværelsen af cytolysiner. Det første skridt involverer billige og ligetil teknikker (omrørt og fryse-optøningscyklus) til frigivelse af cytolysiner. Vi opnåede den højeste cytolytiske aktivitet og protein (~ 500 mg protein fra 20 g tørvægt). Dernæst blev ekstraktets polypeptidkompleksitet analyseret ved SDS-PAGE gel, der detekterede proteiner med molekylvægte mellem 10 kDa og 250 kDa. I det hæmolytiske assay brugte vi fårerøde blodlegemer og bestemte HU50 (11,1 ± 0,3 μg / ml). I modsætning hertil blev tilstedeværelsen af phospholipaser i råekstraktet bestemt under anvendelse af æggeblomme som substrat i et fast medium med agarose. Samlet set bruger denne undersøgelse en effektiv og billig protokol til at forberede råekstraktet og anvender replikerbare bioassays til at identificere cytolysiner, molekyler med bioteknologiske og biomedicinske interesser.

De repræsentative resultater af den protokol, der blev anvendt til at opnå det rå ekstrakt af søanemon, viste, at kombinationen af to teknikker (omrøring og cyklusser med frysning og optøning) frembragte en effektiv udledning af nematocyster, og den samlede mængde protein var 500 mg (8 mg/ml) (figur 3).
Råekstraktets proteinkompleksitet kunne observeres fra 10 kDa og større end 250 kDa gennem SDS-PAGE elektroforese. Derudover blev cytolysiner påvist i mo...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays at JoVE.com

Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Her beskriver vi en protokol til opnåelse af rågiftekstrakt fra havanemonen og detekterer dens hæmolytiske og phospholipaseaktivitet.

Identifikation af hæmolytisk og fosfolipaseaktivitet i råekstrakter fra søanemoner ved hjælp af enkle bioassays

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

Interaktion mellem havanemontoksin skal anvende det mindste antal organismer og effektive protokoller for at opnå stor mangfoldighed og overflod af toksinerne og hurtig identifikation af et specifikt toksin. Vi kombinerede to effektive teknikker til at forberede råekstraktet med en høj mængde protein og beskrive reproducerbare, specifikke, hurtige og billige assays for at identificere hæmolyse og fosfolbaser i havanemongiften. Metoden kan anvendes i næsten ethvert eksempel, der besluttes at identificere en eller begge typer cytolysiner.Metodens effektivitet opnås ved at tage sig af tiderne i hvert trin, mens råekstraktet forberedes. Nøglen til hæmolyse er omhyggelig håndtering af erytrocytten for at undgå mekanisk lysis og i phospholyseassay at tage sig af temperaturen i fremstillingen af pladen. Demonstration af proceduren vil være Dr. Santos Ramirez-Carreto, biolog Sandra Salazar Garcia og biolog Giovanni Macias Martinez fra mit laboratorium.Begynd med at rense den opsamlede havanemonE A.doi med destilleret vand i hånden for at fjerne de store substratpartikler, der klæber til kroppen. Frys straks organismerne ved minus 80 grader Celsius i en ultrafreezer i 72 timer. Anbring derefter organismerne i specielle briller til frysetørring med lyofiliseringsbetingelser i 48 timer.Til vævshydrering rekonstitueres 20 gram tørvægt af lyofiliserede organismer med 60 ml 50 millimolær natriumphosphatbuffer og en inhibitorcocktailtablet. I en magnetisk omrører omrøres prøven kontinuerligt ved omkring 800 rpm og fire grader Celsius i 12 timer. Efter frysning af prøven ved minus 20 grader Celsius i 12 timer for at fremkalde cellelyse og nematocystudledning, anbringes beholderen i vand ved stuetemperatur, indtil den optøes op til 90%Gentag denne procedure tre gange.For at klarlægge ekstraktet centrifugeres prøven ved 25.400 gange G i 40 minutter ved fire grader Celsius. Gendan supernatanten og centrifuger den igen. Gentag trinnet tre til fire gange og gendan supernatanten til sidst.Det genvundne supernatant eller råekstrakt indeholder giftkomponenterne og andre cellemolekyler såsom lipider, kulhydrater og nukleinsyrer. Bestem proteinkoncentrationen af råekstraktet ved hjælp af et kommercielt Bradford-kolorimetrisk analysesæt. Inkuber prøverne i fem minutter ved stuetemperatur uden at ryste.Mål derefter absorbansen ved 595 nanometer. Plot gennemsnittet af prøven BSA-absorbanser og bestem ligningen af grafen, hvor y er absorbansen, m er linjens hældning, x er proteinkoncentrationen, og b er ordinatet til oprindelsen. For at analysere råekstraktet tilsættes 30 mikrogram af råekstraktet til fem mikroliter af proteinbelastningsbufferen for at denaturere proteinerne.Det endelige volumen skal være mindre end 50 mikroliter. Kør elektroforese ved 25 milliampere konstant i en time og 30 minutter. For at undgå diffusion af gelproteinerne tilsættes fikseringsopløsningen til proteinerne og inkuberes ved stuetemperatur i 40 minutter med omrystning ved 80 o / min.Dekanter derefter opløsningen og tilsæt proteintværbindingsopløsningen. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur med omrystning ved 80 o / min. Fjern opløsningen og vask gelen med 100 ml destilleret vand i fem minutter.Fjern derefter vandet og gentag denne procedure fire gange. Udfør proteinfarvning med 50 ml Coomassie Brilliant Blue R-250 filtreret opløsning omrøring ved 60 o / min i en laboratorieroterende oscillator ved stuetemperatur i 15 minutter. Uddrag en milliliter blod fra et fårs jugular vene og fjern nålen fra sprøjten.Tøm straks blod i et rør med 50 ml Alsever-opløsning og centrifuge ved 804 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Kassér supernatanten, og tilsæt 30 ml Alsever-opløsning ved at skubbe den langs rørets indre vægge. Sæt langsomt pillen igen ved hjælp af en Pasteur-plastpipette, og centrifuger opløsningen igen ved 804 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius.Gentag denne procedure, indtil supernatanten er afklaret. Oprethold det endelige volumen af Alsever-opløsningen for at opnå en koncentration på ca. 2 millioner celler pr. Milliliter. Brug derefter et Neubauer-kammer eller hæmocytometer til at tælle cellerne.Inkuber opløsningsblandingerne i en time ved 37 grader Celsius uden at ryste og centrifuger derefter pladen ved 804 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Gendan supernatanten i en anden 96-brønds plade med en flad bund. Hvis råekstraktet indeholder cytolysiner, vil erytrocytter lyse og frigive hæmoglobin.Læs absorbansen ved 415 nanometer og beregn mængden af ekstrakt, der producerer hæmolyse i 50% af erytrocytterne. Forøg mængden af havanemon råekstrakt og design plottet med sigmoidale justeringer ved hjælp af passende software. Vask et kyllingæg med 1% SDS i destilleret vand og adskil æggeblommen fra æggehviden under sterile forhold.Forbered opløsning A, B, C og D.Tilsæt 500 mikroliter opløsning A og C til opløsning B og 100 mikroliter opløsning D.Bland dem og hæld 25 ml i hver petriskål. Vent til opløsningen størkner under sterile forhold, og lav brønde på cirka to til tre millimeter i diameter med et tyndt rør. Tilsæt i alt 20 mikroliter fosfatbuffer som en negativ kontrol i en brønd og 20 mikroliter af en bestemt phospholipase som en positiv kontrol i en anden brønd.Anbring forskellige mængder af råekstraktproteinet 5, 15, 25, 35 og 45 mikrogram i de resterende brønde, hver i et endeligt volumen på 20 mikroliter. Inkuber ved 37 grader Celsius i 20 timer. De repræsentative resultater af protokollen, der blev brugt til at opnå det rå ekstrakt af havanemon, viste, at kombinationen af to teknikker, omrøring og cyklusser med frysning og optøning, frembragte en effektiv udledning af nematocysts.Nematocytterne før og efter stimuli er vist her. Nematocysttubuli er eksponeret på dette billede, hvilket indikerer toksinfrigivelsen. Den elektroforetiske profil af havanemon rå ekstrakt er vist her.Havanemonens råekstrakt blev analyseret af SDS-PAGE 15%polyacrylamidgel og viste protein fra 10 kilodaltoner til 250 kilodalton molekylvægt. Her er bane 1 proteinstigen og bane 2 er søanemongift. Cytolysiner blev påvist i molekylvægtszonen på 15 kilodalton og 20 kilodaltoner.Vist her er hæmolyseassayet i erytrocytter fra får. Den hæmolytiske aktivitet af ekstraktet før og under fryse- og optøningscyklusserne steg, indtil 100% hæmolyse blev nået med 50 mikrogram af det samlede råekstraktprotein i de sidste to cyklusser. Den mængde, der er nødvendig for at lyse 50% får erytrocytter, er 11,1 0,3 mikrogram pr. Milliliter.Fosfolipaseaktivitet blev påvist ved dannelsen af klare glorier i de områder af agarpladen, hvor råekstraktprøven blev påført. Resultaterne viser tilstedeværelsen af phospholipaseaktivitet fra 15 mikrogram totalt protein. Haloens diameter steg på en dosisafhængig måde; det vil sige, hvis mængden af råekstrakt steg, steg haloens diameter.Mens du forsøger proceduren, skal du sørge for at inducere nematocystudledning, kvantificere det samlede protein, analysere råekstrakt ved SDS-PAGE elektroforese, beregne mængden af råekstraktprotein for at producere 50% hæmolyse og bruge forskellige mængder protein i phospholipase-assay. Vi kan analysere råekstraktet ved hjælp af proteomisk teknik til at identificere polypeptider med stor relevans inden for bioteknologi og biomedicin, endda profilere og karakterisere et unikt molekyle og derefter producere det i laboratoriet til en applikation. Vi opnåede en del af sekvensen af et udførende protein med antitumoraktivitet i de humane obdurate lungekarcinomepitelceller.Ligeledes identificerer vi sekvensen af phospholipaser af bioteknologisk interesse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifikation af små molekyler-bindende proteiner i en Native Cellular Environment af live-cell fotoaffinitetsmærkning

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Definition substratspecificiteter for lipase og phospholipase Kandidater

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Forberedelse af Keratin hydrolysat fra kylling fjer og dens anvendelse i kosmetik

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation og respiratoriske målinger af mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Bestemmelse af Protease specificitet i mus væv ekstrakter af MALDI-TOF-massespektrometri: manipulere PH for at forårsage specificitet ændringer

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikation af Cyclin-afhængig Kinase 1 specifikke fosforylering websteder ved en In Vitro -Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Identifikation af Havlampretten feromoner ved hjælp af Bioassay-styrede fraktionering

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Påvisning af fosfolipase C aktivitet i hjernen homogenatet fra honningbien

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...