Name: identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays
Uploaded: 2022-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), met een subsidienummer IT200819. De auteurs erkennen aan Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC, voor het controleren van de Engelse grammatica van dit manuscript; en de technische bijstand van Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada) en Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). We danken ook dr. Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) voor het verkrijgen van schapenbloed. We bedanken in het bijzonder Dr. José Saniger Blesa, ICAT-UNAM, voor de faciliteiten in zijn laboratorium voor de video-opname.

De zeeanemonen werden verzameld volgens de richtlijnen van de Nationale Commissie voor Aquacultuur, Visserij en Voedsel van de Federale Overheid van Mexico (vergunningsnummer PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Bio-ethische commissie van het Instituut voor Biotechnologie, Nationale Autonome Universiteit van Mexico keurde alle experimenten met zeeanemonen goed. Het schapenbloedmonster werd gekocht bij het Center for Practical Teaching and Research in Animal Production and Health (CEPIPSA, National Autonomous University of Me...

<ol>
	<li>Fraz&#227;o, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+anemone+(Cnidaria,+Anthozoa,+Actiniaria)+toxins:+an+overview.">Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview.</a> Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).</li><li>Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnidarian+toxins:+recent+evidences+for+potential+therapeutic+uses.">Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses.</a> The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodr&#237;guez-Almaz&#225;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actinoporins:+From+the+structure+and+function+to+the+generation+of+biotechnological+and+therapeutic+tools.">Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools.</a> Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).</li><li>Fautin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+diversity,+systematics,+and+evolution+of+cnidae.+Toxicon.">Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon.</a> Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).</li><li>Moran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+soluble+protein+contents+from+the+nematocysts+of+a+model+sea+anemone+sheds+light+on+venom+evolution.">Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution.</a> Marine Biotechnology. 15 (3), 329-339 (2013).</li><li>Moran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxin+localization+to+ectodermal+gland+cells+uncovers+an+alternative+mechanism+of+venom+delivery+in+sea+anemones.">Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).</li><li>Grabski, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+preparation+of+biological+extracts+for+protein+purification.">Advances in preparation of biological extracts for protein purification.</a> Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).</li><li>Bulati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partially+purified+extracts+of+sea+anemone+Anemonia+viridis+affect+the+growth+and+viability+of+selected+tumour+cell+lines.">Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines.</a> BioMed Research International. 2016, 3849897 (2016).</li><li>Orts, D. J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+electrophysiological+characterization+of+two+sea+anemone+type+1+potassium+toxins+from+a+geographically+distant+population+of+Bunodosoma+caissarum.">Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum.</a> Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).</li><li>Hader, D., Erzinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioassays: Advanced Methods and Applications. , (2017).</li><li>Anderluh, G., Macek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytolytic+peptide+and+protein+toxins+from+sea+anemones+(Anthozoa:+Actiniaria).">Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria).</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).</li><li>Nevalainen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+A2+in+cnidaria.">Phospholipase A2 in cnidaria.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry &amp; Molecular Biology. 139 (4), 731-735 (2004).</li><li>Razpotnik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+phospholipase+A2+isolated+from+the+sea+anemone+Urticina+crassicornis+-+its+primary+structure+and+phylogenetic+classification.">A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis - its primary structure and phylogenetic classification.</a> The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).</li><li>Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -. H., Magrioti, V., Kokotos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+A2+enzymes:+Physical+structure,+biological+function,+disease+implication,+chemical+inhibition,+and+therapeutic+intervention.">Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention.</a> Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+a+venom+extract+from+the+sea+anemone,+Bunodosoma+cavernata.">Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).</li><li>Morales-Landa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial,+antiprotozoal,+and+toxic+activities+of+Cnidarian+extracts+from+the+Mexican+Caribbean+Sea.">Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea.</a> Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).</li><li>S&#225;nchez-Rodr&#237;guez, J., Cruz-Vazquez, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+biological+characterization+of+neurotoxic+compounds+from+the+sea+anemone+Lebrunia+danae+(Duchassaing+and+Michelotti,+1860).">Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860).</a> Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).</li><li>de Oliveira, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caissarolysin+I+(Bcs+I),+a+new+hemolytic+toxin+from+the+Brazilian+sea+anemone+Bunodosoma+caissarum:+purification+and+biological+characterization.">Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).</li><li>Norton, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterisation+of+proteins+with+cardiac+stimulatory+and+haemolytic+activity+from+the+anemone+Actinia+tenebrosa.">Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).</li><li>Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crude+extract+from+the+sea+anemone,+Bunodosoma+caissarum+elicits+convulsions+in+mice:+possible+involvement+of+the+glutamatergic+system.">The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).</li><li>Dion, A. S., Pomenti, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammoniacal+silver+staining+of+proteins:+mechanism+of+glutaraldehyde+enhancement.">Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement.</a> Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pore-forming+protein+from+sea+anemone+Anthopleura+dowii+Verrill+(1869)+venom+by+mass+spectrometry.">Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry.</a> The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).</li><li>Nelson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+lipids+of+sheep+red+blood+cells.+I.+Lipid+composition+in+low+and+high+potassium+red+cells.">Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells.</a> Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+and+proteomic+analysis+of+the+tentacles+and+mucus+of+Anthopleura+dowii+Verrill,+1869.">Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869.</a> Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).</li></ol>

De grote vraag naar nieuwe verbindingen met toepassingen op verschillende gebieden van wetenschap en industrie heeft geleid tot de studie van gif. Gif vertegenwoordigt een rijke bron van moleculen die dient als een sjabloon voor het genereren van nieuwe moleculaire hulpmiddelen. De complexiteit van deze gifstoffen vereist echter de implementatie en combinatie van verschillende methoden om ze te verkrijgen en te bestuderen.
Hier tonen we een methode voor het verkrijgen en analyseren van het gif...

Zeedieren zijn een rijke bron van biologisch actieve verbindingen. In de afgelopen decennia heeft de samenstelling van zeeanemoongif wetenschappelijke aandacht getrokken, omdat het een diversiteit aan polypeptiden omvat met hemolytische, cytotoxische, enzymatische (fosfolipase, protease, chitinase) en neurotoxische activiteit en remmende effecten op proteolytische activiteit1. Bovendien zijn deze polypeptiden potentiële bronnen voor de ontwikkeling van moleculaire hulpmiddelen in biotechnologisch en therapeutisch gebruik 2,3.
Er zijn weinig rapporten over zeeanemoongif en zijn moleculaire componenten vanwege de complexiteit van het verkrijgen van het gif, zelfs isolatie en karakterisering van toxines. De extractiemethoden die in de rapporten werden gebruikt, betroffen lysis en het legen van de inhoud van cellen die gerelateerd en niet gerelateerd zijn aan de gifproductie1.
Een bijzonder kenmerk in alle cnidarians is de afwezigheid van een systeem voor productie en afgifte van het gif gecentraliseerd in een enkel anatomisch gebied. In plaats daarvan zijn de nematocysten structuren die het gif 4,5 houden. Andere soorten cellen, epidermale kliercellen genaamd, scheiden ook toxines af en zijn ook verdeeld over het lichaam van zeeanemonen6.
De eerste en meest cruciale uitdaging bij het verkrijgen van het gif is het genereren van een extract met voldoende manipulatie in daaropvolgende processen, zonder de inactivatie of afbraak van labiele eiwitten. Vervolgens moeten de cellen worden gelyseerd en moeten de componenten - in dit geval polypeptiden - efficiënt en snel worden geëxtraheerd, waarbij proteolyse en hydrolyse worden vermeden terwijl andere cellulaire componenten wordengeëlimineerd 7.
Verschillende methoden worden gebruikt om het ruwe extract van een zeeanemoon te verkrijgen; sommige omvatten het opofferen van het organisme, terwijl anderen toestaan dat het in leven wordt gehouden. Methoden die het gebruik van het hele lichaam van het organisme impliceren, zorgen voor de afgifte van de meeste toxines uit het gif8, vergeleken met methoden die organismen in leven houden, die slechts enkele componenten van het gif9 extraheren. De bereiding van een extract vereist een evaluatie van de aanwezigheid en potentie van een stof van belang door middel van een specifieke bioassay, die strategieën omvat om de farmacologische effecten te observeren met behulp van in vivo of in vitro methoden10.
Zeeanemoongif bevat cytolytische polypeptiden, porievormende toxines (PFT's)11 en fosfolipase12; deze moleculen zijn modellen in de studie van eiwit-lipide interactie, moleculaire hulpmiddelen in kankertherapie en biosensoren op basis van nanopore3. De classificatie van zeeanemoon PFT's wordt uitgevoerd op basis van hun grootte of molecuulgewicht, van 5 kDa tot 80 kDa. De 20 kDa PFT, de meest bestudeerde en bekend als actinoporinen11, is van bijzonder belang vanwege zijn biomedische potentieel bij de ontwikkeling van moleculaire hulpmiddelen voor mogelijke toepassingen als antikanker, antimicrobiële en op nanoporiën gebaseerde biosensoren. Een ander cytolysine, waaronder fosfolipase, met name fosfolipase A2 (PLA2)13, geeft een vetzuur af en hydrolyseert fosfolipiden, waardoor het celmembraan wordt gedestabiliseerd. Door dit werkingsmechanisme belooft PLA2 een essentieel model te zijn voor de studie en toepassingen bij ontstekingsziekten. Het zou kunnen dienen als een model voor studies van lipidengedrag in het celmembraan14.
Hier beschrijven we een efficiënt protocol voor het verkrijgen van het ruwe extract van zeeanemoon Anthopleura dowii Verrill, 1869, en het detecteren van hemolysines en fosfolipases. Beide zijn relevante toxines die kunnen worden gebruikt als een sjabloon om nieuwe moleculaire hulpmiddelen te ontwerpen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B75808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoetanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9515-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assays</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 96 well, V-bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear flat.bottom 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1916-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ductless Enclosure</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Vertical</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ</td>
			<td>Bio Rad.</td>
			<td></td>
			<td>Gel Documentation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Software)</td>
			<td>NIH, USA</td>
			<td>Version 1.53c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 211</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5211 DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9049-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN tetra cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3824-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3818-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td></td>
			<td>version 9</td>
			<td>To design the plot with sigmoidal adjustments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman kit</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast mini gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3646-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>G10S UV-VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt Power Supply</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PS300B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays

De samenstelling van zeeanemoongif omvat polypeptide- en niet-eiwitmoleculen. Cytolytische componenten hebben een hoog biotechnologisch en biomedisch potentieel voor het ontwerpen van nieuwe moleculaire hulpmiddelen. Zeeanemoongif lokaliseert zich in glandulaire cellen van ectoderm en subcellulaire structuren die nematocysten worden genoemd, die beide verspreid zijn over het zeeanemoonlichaam. Deze eigenschap impliceert uitdagingen omdat de cellen en nematocysten moeten worden gelyseerd om de gifcomponenten vrij te geven met andere niet-toxische moleculen. Daarom is het gif eerst afgeleid van een ruw extract (mengsel van verschillende en diverse moleculen en weefselresten). De volgende stap is het detecteren van polypeptiden met specifieke bioactiviteiten. Hier beschrijven we een efficiënte strategie om het ruwe extract van zeeanemonen te verkrijgen en bioassay om de aanwezigheid van cytolysinen te identificeren. De eerste stap omvat goedkope en eenvoudige technieken (geroerde en vries-dooicyclus) om cytolysines vrij te geven. We verkregen de hoogste cytolytische activiteit en eiwit (~ 500 mg eiwit uit 20 g droog gewicht). Vervolgens werd de polypeptidecomplexiteit van het extract geanalyseerd door SDS-PAGE-gel die eiwitten detecteerde met molecuulgewichten tussen 10 kDa en 250 kDa. In de hemolytische test gebruikten we schapenrode bloedcellen en bepaalden HU50 (11,1 ± 0,3 μg / ml). Daarentegen werd de aanwezigheid van fosfolipase in het ruwe extract bepaald met behulp van eigeel als substraat in een vast medium met agarose. Over het algemeen gebruikt deze studie een efficiënt en goedkoop protocol om het ruwe extract te bereiden en past repliceerbare bioassays toe om cytolysinen, moleculen met biotechnologische en biomedische belangen te identificeren.

De representatieve resultaten van het protocol dat werd gebruikt om het ruwe extract van zeeanemonen te verkrijgen, toonden aan dat het combineren van twee technieken (agitatie en cycli van invriezen en ontdooien) een efficiënte afvoer van nematocysten opleverde, en de totale hoeveelheid eiwit was 500 mg (8 mg / ml) (figuur 3).
De eiwitcomplexiteit van het ruwe extract kon worden waargenomen vanaf 10 kDa en meer dan 250 kDa via SDS-PAGE-elektroforese. Daarnaast w...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays at JoVE.com

Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Hier beschrijven we een protocol om ruw gifextract uit zeeanemoon te verkrijgen en de hemolytische en fosfolipase-activiteit ervan te detecteren.

Identificatie van hemolytische en fosfolipase-activiteit in ruwe extracten van zeeanemonen door Eenvoudige Bioassays

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

Zeeanemoon toxine interactie moet het minste aantal organismen en efficiënte protocollen gebruiken om een grote diversiteit en overvloed van de toxines en snelle identificatie van een specifiek toxine te verkrijgen. We combineerden twee efficiënte technieken om het ruwe extract te bereiden met een grote hoeveelheid eiwit en beschrijven reproduceerbare, specifieke, snelle en goedkope testen om hemolyse en fosfolic basen in het zeeanemoongif te identificeren. De methode kan worden gebruikt in bijna elk voorbeeld dat wordt besloten om een of beide soorten cytolysinen te identificeren.De efficiëntie van de methode wordt bereikt door te zorgen voor de tijden in elke stap tijdens het bereiden van het ruwe extract. De sleutel tot hemolyse is zorgvuldige behandeling van de erytrocyt om mechanische lysis te voorkomen, en bij fosfolyse-assay, zorgen voor de temperatuur bij de bereiding van de plaat. De procedure wordt gedemonstreerd door Dr.Santos Ramirez-Carreto, bioloog Sandra Salazar Garcia en bioloog Giovanni Macias Martinez vanuit mijn laboratorium.Begin met het reinigen van de verzamelde zeeanemoon A.doi met gedestilleerd water met de hand om de grote substraatdeeltjes te verwijderen die zich aan het lichaam hechten. Vries de organismen onmiddellijk in bij min 80 graden Celsius in een ultravriezer gedurende 72 uur. Plaats de organismen vervolgens in speciale glazen voor vriesdrogen met lyofilisatieomstandigheden gedurende 48 uur.Voor weefselhydratatie reconstitueer 20 gram drooggewicht van gelyofiliseerde organismen met 60 milliliter 50-millimolaire natriumfosfaatbuffer en één remmende cocktailtablet. Roer het monster in een magneetroerder gedurende 12 uur continu bij ongeveer 800 RPM en vier graden Celsius. Nadat u het monster gedurende 12 uur bij min 20 graden Celsius hebt ingevroren om cellyse en nematocystafscheiding te induceren, plaatst u de container in water bij kamertemperatuur totdat deze tot 90% ontdooit Herhaal deze procedure drie keer.Om het extract te verduidelijken, centrifugeer het monster op 25, 400 keer G gedurende 40 minuten bij vier graden Celsius. Herstel het supernatant en centrifugeer het opnieuw. Herhaal de stap drie tot vier keer en herstel het supernatant eindelijk.Het teruggewonnen supernatant of ruw extract bevat de gifcomponenten en andere celmoleculen zoals lipiden, koolhydraten en nucleïnezuren. Bepaal de eiwitconcentratie van het ruwe extract met behulp van een commerciële Bradford colorimetrische testkit. Incubeer de monsters gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur zonder te schudden.Meet vervolgens de absorptie op 595 nanometer. Zet de gemiddelden van de BSA-absorpties van het monster uit en bepaal de vergelijking van de grafiek waarbij y de absorptie is, m de helling van de lijn, x de eiwitconcentratie en b de ordinaat van de oorsprong. Om het ruwe extract te analyseren, voegt u 30 microgram van het ruwe extract toe aan vijf microliter van de eiwitbelastingsbuffer om de eiwitten te denatureren.Het uiteindelijke volume moet kleiner zijn dan 50 microliter. Voer de elektroforese uit op een constante van 25 milliamperes gedurende één uur en 30 minuten. Om de diffusie van de geleiwitten te voorkomen, voegt u de fixatieoplossing toe aan de eiwitten en incubeert u gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur met schudden bij 80 RPM.Decanteer vervolgens de oplossing en voeg de eiwitverknopingsoplossing toe. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met schudden bij 80 RPM. Verwijder de oplossing en was de gel gedurende vijf minuten met 100 milliliter gedestilleerd water.Verwijder daarna het water en herhaal deze procedure vier keer. Voer eiwitkleuring uit met 50 milliliter Coomassie Brilliant Blue R-250 gefilterde oplossing, roerend bij 60 RPM in een laboratorium roterende oscillator bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Haal een milliliter bloed uit de halsader van een schaap en verwijder de naald uit de spuit.Giet onmiddellijk bloed af in een buis met 50 milliliter Alsever-oplossing en centrifugeer gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius bij 804 maal G. Gooi het supernatant weg en voeg 30 milliliter Alsever-oplossing toe door het langs de binnenwanden van de buis te schuiven. Resuspend de pellet langzaam met behulp van een pasteur plastic pipet en centrifugeer de oplossing opnieuw op 804 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Herhaal deze procedure totdat het supernatant is opgehelderd. Handhaaf het uiteindelijke volume van de Alsever-oplossing om een concentratie van ongeveer 2 miljoen cellen per milliliter te bereiken. Gebruik vervolgens een Neubauer-kamer of hemocytometer om de cellen te tellen.Incubeer de oplossingsmengsels gedurende één uur bij 37 graden Celsius zonder te schudden en centrifugeer de plaat vervolgens gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius op 804 maal G. Recupereer het supernatant in een andere 96-putplaat met een vlakke bodem. Als het ruwe extract cytolysinen bevat, zullen erytrocyten lyseren en hemoglobine afgeven.Lees de absorptie op 415 nanometer en bereken de hoeveelheid extract die hemolyse produceert in 50% van de erytrocyten. Verhoog de hoeveelheid zeeanemoon ruw extract en ontwerp het perceel met sigmoïdale aanpassingen met behulp van geschikte software. Was één kippenei met 1%SDS in gedestilleerd water en scheid het eigeel onder steriele omstandigheden van het eiwit.Bereid oplossingen A, B, C en D.Voeg 500 microliter oplossingen A en C toe aan oplossing B en 100 microliter oplossing D.Meng ze en giet 25 milliliter in elke petrischaal. Wacht tot de oplossing stolt onder steriele omstandigheden en maak putten van ongeveer twee tot drie millimeter in diameter met een dunne buis. Voeg in totaal 20 microliter fosfaatbuffer toe als negatieve controle in de ene put en 20 microliter van een bepaalde fosfolipase als positieve controle in een andere put.Plaats verschillende hoeveelheden van het ruwe extract eiwit 5, 15, 25, 35 en 45 microgram in de resterende putten, elk in een eindvolume van 20 microliter. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 20 uur. De representatieve resultaten van het protocol dat werd gebruikt om het ruwe extract van zeeanemonen te verkrijgen, toonden aan dat het combineren van twee technieken, agitatie en cycli van invriezen en ontdooien, een efficiënte afvoer van nematocysten opleverde.De nematocyten voor en na prikkels worden hier getoond. De nematocyste tubulus wordt in deze afbeelding blootgesteld, wat de afgifte van toxine aangeeft. Het elektroforetische profiel van zeeanemoon ruw extract wordt hier getoond.Het ruwe extract van zeeanemonen werd geanalyseerd door SDS-PAGE 15% polyacrylamide-gel en toonde eiwit van 10 kilodalton tot 250 kilodalton molecuulgewicht. Hier is baan 1 de eiwitladder en baan 2 zeeanemoongif. Cytolysinen werden gedetecteerd in de molecuulgewichtszone van 15 kilodalton en 20 kilodalton.Hier afgebeeld is de hemolysetest in erytrocyten van schapen. De hemolytische activiteit van het extract voor en tijdens de vries- en ontdooicycli nam toe totdat 100% hemolyse werd bereikt met 50 microgram van het totale ruwe extracteiwit in de laatste twee cycli. De hoeveelheid die nodig is om 50% schapen erytrocyten te lyseren is 11,1 0,3 microgram per milliliter.Fosfolipase-activiteit werd gedetecteerd door de vorming van heldere halo's in de gebieden van de agarplaat waar het ruwe extractmonster werd aangebracht. De resultaten tonen de aanwezigheid van fosfolipase-activiteit van 15 microgram totaal eiwit. De diameter van de halo nam toe op een dosisafhankelijke manier; dat wil zeggen, als de hoeveelheid ruw extract toenam, nam de diameter van de halo toe.Zorg er tijdens het proberen van de procedure voor dat u nematocystafscheiding induceert, het totale eiwit kwantificeert, ruw extract analyseert door SDS-PAGE-elektroforese, de hoeveelheid ruw extracteiwit berekent om 50% van de hemolyse te produceren en verschillende hoeveelheden eiwit gebruikt in fosfolipase-assay. We kunnen het ruwe extract analyseren door proteomische techniek om polypeptiden met grote relevantie in de biotechnologie en biogeneeskunde te identificeren, zelfs een uniek molecuul te profileren en te karakteriseren en het vervolgens in het laboratorium te produceren voor een toepassing. We verkregen een deel van de sequentie van een presterend eiwit met antitumoractiviteit in de menselijke obdurate longcarcinoom epitheelcellen.Evenzo identificeren we de sequentie van fosfolipases van biotechnologisch belang.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Het definiëren van de ondergrond hebben voor lipase en fosfolipase Kandidaten

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Voorbereiding van keratine hydrolysaat van kippenveren en haar toepassing in cosmetica

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolatie en respiratoire metingen van Mitochondria van Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

De identificatie van de Zeeprik feromonen met behulp van de Bioassay-geleide fractionering

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Detectie van Phospholipase C activiteit in de hersenen homogenaat van de honingbij

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...