Name: identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays
Uploaded: 2022-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), avec le numéro de subvention IT200819. Les auteurs remercient Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC, d’avoir vérifié la grammaire anglaise de ce manuscrit; et l’assistance technique de Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada) et Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). Nous remercions également le Dr Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) pour l’obtention de sang de mouton. Nous remercions tout particulièrement le Dr José Saniger Blesa, ICAT-UNAM, pour les installations de son laboratoire pour l’enregistrement vidéo.

Les anémones de mer ont été collectées conformément aux directives de la Commission nationale de l’aquaculture, de la pêche et de l’alimentation du gouvernement fédéral du Mexique (numéro de permis PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Le Comité de bioéthique de l’Institut de biotechnologie de l’Université nationale autonome du Mexique a approuvé toutes les expériences avec des anémones de mer. L’échantillon de sang de mouton a été acheté au Centre d’enseignement pratique et de recherche en prod...

<ol>
	<li>Fraz&#227;o, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+anemone+(Cnidaria,+Anthozoa,+Actiniaria)+toxins:+an+overview.">Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview.</a> Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).</li><li>Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterisation+of+proteins+with+cardiac+stimulatory+and+haemolytic+activity+from+the+anemone+Actinia+tenebrosa.">Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).</li><li>Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammoniacal+silver+staining+of+proteins:+mechanism+of+glutaraldehyde+enhancement.">Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement.</a> Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pore-forming+protein+from+sea+anemone+Anthopleura+dowii+Verrill+(1869)+venom+by+mass+spectrometry.">Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry.</a> The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).</li><li>Nelson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+lipids+of+sheep+red+blood+cells.+I.+Lipid+composition+in+low+and+high+potassium+red+cells.">Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells.</a> Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+and+proteomic+analysis+of+the+tentacles+and+mucus+of+Anthopleura+dowii+Verrill,+1869.">Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869.</a> Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).</li></ol>

La forte demande de nouveaux composés ayant des applications dans différents domaines de la science et de l’industrie a conduit à l’étude du venin. Venom représente une riche source de molécules qui sert de modèle pour générer de nouveaux outils moléculaires. Cependant, la complexité de ces venins nécessite la mise en œuvre et la combinaison de diverses méthodes pour les obtenir et les étudier.
Ici, nous montrons une méthode pour obtenir et analyser le venin de l’anémone...

Les animaux marins sont une riche source de composés biologiquement actifs. Au cours des dernières décennies, la composition du venin d’anémone de mer a attiré l’attention scientifique car elle comprend une diversité de polypeptides ayant une activité hémolytique, cytotoxique, enzymatique (phospholipase, protéase, chitinase), une activité neurotoxique et des effets inhibiteurs sur l’activité protéolytique1. De plus, ces polypeptides sont des sources potentielles pour le développement d’outils moléculaires à usage biotechnologique et thérapeutique 2,3.
Il existe peu de rapports sur le venin d’anémone de mer et ses composants moléculaires en raison de la complexité de l’obtention du venin, même de l’isolement et de la caractérisation des toxines. Les méthodes d’extraction utilisées dans les rapports impliquaient la lyse et la vidange du contenu des cellules qui sont liées et non liées à la production de venin1.
Une caractéristique particulière chez tous les cnidaires est l’absence d’un système de production et de libération du venin centralisé dans une seule région anatomique. Au lieu de cela, les nématocystes sont des structures qui gardent le venin 4,5. D’autres types de cellules, appelées cellules de la glande épidermique, sécrètent également des toxines et sont également distribuées dans tout le corps des anémones de mer6.
Le premier et le plus crucial défi dans l’obtention du venin est la génération d’un extrait avec une manipulation suffisante dans les processus ultérieurs, sans l’inactivation ou la dégradation des protéines labiles. Ensuite, les cellules doivent être lysées, et les composants - dans ce cas, les polypeptides doivent être extraits efficacement et rapidement, en évitant la protéolyse et l’hydrolyse tout en éliminant les autres composants cellulaires7.
Différentes méthodes sont utilisées pour obtenir l’extrait brut d’une anémone de mer; certains impliquent de sacrifier l’organisme tandis que d’autres permettent de le maintenir en vie. Les méthodes qui impliquent l’utilisation de tout le corps de l’organisme permettent la libération de la plupart des toxines du venin8, par rapport aux méthodes qui maintiennent les organismes en vie, qui n’extraient que certains composants du venin9. La préparation d’un extrait nécessite d’évaluer la présence et la puissance d’une substance d’intérêt par le biais d’un essai biologique spécifique, qui comprend des stratégies pour observer les effets pharmacologiques par des méthodes in vivo ou in vitro 10.
Le venin d’anémone de mer contient des polypeptides cytolytiques, des toxines formant des pores (PFT)11 et des phospholipases12; ces molécules sont des modèles dans l’étude de l’interaction protéine-lipide, des outils moléculaires dans le traitement du cancer et des biocapteurs basés sur le nanopore3. La classification des PFT d’anémone de mer est effectuée en fonction de leur taille ou de leur poids moléculaire, de 5 kDa à 80 kDa. Le PFT de 20 kDa, le plus étudié et le plus connu sous le nom d’actinoporines11, présente un intérêt particulier pour son potentiel biomédical dans le développement d’outils moléculaires pour des applications possibles comme biocapteurs anticancéreux, antimicrobiens et à base de nanopores. Une autre cytolysine, y compris les phospholipases, en particulier la phospholipase A2 (PLA2)13, libère un acide gras dû et hydrolyse les phospholipides, déstabilisant la membrane cellulaire. En raison de ce mécanisme d’action, PLA2 promet d’être un modèle essentiel pour l’étude et les applications dans les maladies inflammatoires. Il pourrait servir de modèle pour les études du comportement lipidique dans la membrane cellulaire14.
Ici, nous décrivons un protocole efficace pour obtenir l’extrait brut de l’anémone de mer Anthopleura dowii Verrill, 1869, et détecter les hémolysines et les phospholipases. Les deux sont des toxines pertinentes qui pourraient être utilisées comme modèle pour concevoir de nouveaux outils moléculaires.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B75808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoetanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9515-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assays</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 96 well, V-bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear flat.bottom 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1916-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ductless Enclosure</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Vertical</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ</td>
			<td>Bio Rad.</td>
			<td></td>
			<td>Gel Documentation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Software)</td>
			<td>NIH, USA</td>
			<td>Version 1.53c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 211</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5211 DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9049-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN tetra cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3824-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3818-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td></td>
			<td>version 9</td>
			<td>To design the plot with sigmoidal adjustments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman kit</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast mini gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3646-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>G10S UV-VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt Power Supply</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PS300B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays

La composition du venin d’anémone de mer comprend des molécules de polypeptides et de non-protéines. Les composants cytolytiques ont un potentiel biotechnologique et biomédical élevé pour la conception de nouveaux outils moléculaires. Le venin d’anémone de mer se trouve dans les cellules glandulaires des structures ectodermiques et subcellulaires appelées nématocystes, qui sont toutes deux réparties dans tout le corps de l’anémone de mer. Cette caractéristique implique des défis car les cellules et le nématocyste doivent être lysés pour libérer les composants du venin avec d’autres molécules non toxiques. Par conséquent, tout d’abord, le venin est dérivé d’un extrait brut (mélange de molécules différentes et diverses et de débris tissulaires). L’étape suivante consiste à détecter les polypeptides avec des bioactivités spécifiques. Ici, nous décrivons une stratégie efficace pour obtenir l’extrait brut d’anémone de mer et un essai biologique pour identifier la présence de cytolysines. La première étape implique des techniques simples et peu coûteuses (cycle agité et congélation-décongélation) pour libérer des cytolysines. Nous avons obtenu l’activité cytolytique et les protéines les plus élevées (~ 500 mg de protéines à partir de 20 g de poids sec). Ensuite, la complexité polypeptidique de l’extrait a été analysée par le gel SDS-PAGE détectant des protéines de poids moléculaire compris entre 10 kDa et 250 kDa. Dans le test hémolytique, nous avons utilisé des globules rouges de mouton et déterminé HU50 (11,1 ± 0,3 μg / mL). En revanche, la présence de phospholipases dans l’extrait brut a été déterminée en utilisant du jaune d’œuf comme substrat dans un milieu solide avec de l’agarose. Dans l’ensemble, cette étude utilise un protocole efficace et peu coûteux pour préparer l’extrait brut et applique des essais biologiques reproductibles pour identifier les cytolysines, des molécules ayant des intérêts biotechnologiques et biomédicaux.

Les résultats représentatifs du protocole utilisé pour obtenir l’extrait brut d’anémone de mer ont montré que la combinaison de deux techniques (agitation et cycles de congélation et de décongélation) produisait un rejet efficace de nématocystes, et la quantité totale de protéines était de 500 mg (8 mg/mL) (figure 3).
La complexité protéique de l’extrait brut a pu être observée à partir de 10 kDa et de plus de 250 kDa par électrophorèse SD...

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Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Ici, nous décrivons un protocole pour obtenir un extrait de venin brut de l’anémone de mer et détecter son activité hémolytique et phospholipase.

Identification de l’activité hémolytique et phospholipase dans les extraits bruts d’anémones de mer par des essais biologiques simples

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

L’interaction de la toxine anémone marine doit utiliser le moins d’organismes et des protocoles efficaces pour obtenir une grande diversité et abondance des toxines et une identification rapide d’une toxine spécifique. Nous avons combiné deux techniques efficaces pour préparer l’extrait brut avec une grande quantité de protéines et décrire des tests reproductibles, spécifiques, rapides et peu coûteux pour identifier l’hémolyse et les bases phospholiques dans le venin d’anémone de mer. La méthode peut être utilisée dans presque tous les exemples qui sont décidés pour identifier un ou les deux types de cytolysines.L’efficacité de la méthode est obtenue en prenant soin des temps à chaque étape lors de la préparation de l’extrait brut. La clé de l’hémolyse est une manipulation prudente de l’érythrocyte pour éviter la lyse mécanique, et dans le test de phospholyse, en prenant soin de la température dans la préparation de la plaque. Le Dr Santos Ramirez-Carreto, la biologiste Sandra Salazar Garcia et le biologiste Giovanni Macias Martinez de mon laboratoire feront la démonstration de la procédure.Commencez par nettoyer l’anémone de mer A.doi collectée avec de l’eau distillée à la main pour éliminer les grosses particules de substrat adhérant au corps. Congelez immédiatement les organismes à moins 80 degrés Celsius dans un ultrageleur pendant 72 heures. Ensuite, placez les organismes dans des verres spéciaux pour la lyophilisation dans des conditions de lyophilisation pendant 48 heures.Pour l’hydratation des tissus, reconstituer 20 grammes de poids sec d’organismes lyophilisés avec 60 millilitres de tampon de phosphate de sodium de 50 millimolaires et un comprimé cocktail inhibiteur. Dans un agitateur magnétique, remuer continuellement l’échantillon à environ 800 tr / min et quatre degrés Celsius pendant 12 heures. Après avoir congelé l’échantillon à moins 20 degrés Celsius pendant 12 heures pour induire la lyse cellulaire et la décharge de nématocystes, placez le récipient dans de l’eau à température ambiante jusqu’à ce qu’il dégèle jusqu’à 90% Répétez cette procédure trois fois.Pour clarifier l’extrait, centrifuger l’échantillon à 25 400 fois G pendant 40 minutes à quatre degrés Celsius. Récupérez le surnageant et centrifugez-le à nouveau. Répétez l’étape trois à quatre fois et récupérez enfin le surnageant.Le surnageant récupéré ou l’extrait brut contient les composants du venin et d’autres molécules cellulaires telles que les lipides, les glucides et les acides nucléiques. Déterminez la concentration en protéines de l’extrait brut à l’aide d’un kit de dosage colorimétrique commercial Bradford. Incuber les échantillons pendant cinq minutes à température ambiante sans les secouer.Ensuite, mesurez l’absorbance à 595 nanomètres. Tracer les moyennes des absorbances BSA de l’échantillon et déterminer l’équation du graphique où y est l’absorbance, m est la pente de la ligne, x est la concentration en protéines et b est l’ordonnée à l’origine. Pour analyser l’extrait brut, ajoutez 30 microgrammes de l’extrait brut à cinq microlitres du tampon de charge protéique pour dénaturer les protéines.Le volume final doit être inférieur à 50 microlitres. Exécutez l’électrophorèse à 25 milliampères constants pendant une heure et 30 minutes. Pour éviter la diffusion des protéines du gel, ajoutez la solution de fixation aux protéines et incubez à température ambiante pendant 40 minutes en agitant à 80 RPM.Ensuite, décantez la solution et ajoutez la solution de réticulation des protéines. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante en agitant à 80 rpm. Retirez la solution et lavez le gel avec 100 millilitres d’eau distillée pendant cinq minutes.Après cela, retirez l’eau et répétez cette procédure quatre fois. Effectuer la coloration protéique avec 50 millilitres de solution filtrée Coomassie Brilliant Blue R-250 en remuant à 60 tr / min dans un oscillateur rotatif de laboratoire à température ambiante pendant 15 minutes. Extraire un millilitre de sang de la veine jugulaire d’un mouton et retirer l’aiguille de la seringue.Drainez immédiatement le sang dans un tube avec 50 millilitres de solution d’Alsever et centrifugez à 804 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et ajoutez 30 millilitres de solution Alsever en le faisant glisser le long des parois internes du tube. Remettez lentement la pastille à l’aide d’une pipette en plastique Pasteur et centrifugez à nouveau la solution à 804 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Répétez cette procédure jusqu’à ce que le surnageant soit clarifié. Maintenir le volume final de la solution d’Alsever pour atteindre une concentration d’environ 2 millions de cellules par millilitre. Ensuite, utilisez une chambre Neubauer ou un hémocytomètre pour compter les cellules.Incuber les mélanges de solution pendant une heure à 37 degrés Celsius sans agiter, puis centrifuger la plaque à 804 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Récupérez le surnageant dans une autre plaque de 96 puits avec un fond plat. Si l’extrait brut contient des cytolysines, les érythrocytes vont lyser et libérer de l’hémoglobine.Lisez l’absorbance à 415 nanomètres et calculez la quantité d’extrait qui produit l’hémolyse dans 50% des érythrocytes. Augmentez la quantité d’extrait brut d’anémone de mer et concevez la parcelle avec des ajustements sigmoïdaux à l’aide d’un logiciel approprié. Lavez un œuf de poule avec 1% de FDS dans de l’eau distillée et séparez le jaune d’œuf du blanc d’œuf dans des conditions stériles.Préparer les solutions A, B, C et D.Ajouter 500 microlitres de solutions A et C à la solution B et 100 microlitres de solution D.Mélangez-les et versez 25 millilitres dans chaque boîte de Pétri. Attendez que la solution se solidifie dans des conditions stériles et faites des puits d’environ deux à trois millimètres de diamètre avec un tube mince. Ajouter un total de 20 microlitres de tampon phosphate comme témoin négatif dans un puits et 20 microlitres d’une phospholipase déterminée comme témoin positif dans un autre puits.Placez différentes quantités de protéines d’extrait brut 5, 15, 25, 35 et 45 microgrammes dans les puits restants, chacun dans un volume final de 20 microlitres. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 heures. Les résultats représentatifs du protocole utilisé pour obtenir l’extrait brut d’anémone de mer ont montré que la combinaison de deux techniques, l’agitation et les cycles de congélation et de décongélation, produisait un rejet efficace de nématocystes.Les nématocytes avant et après les stimuli sont montrés ici. Le tubule de nématocyste est exposé dans cette image, indiquant la libération de toxine. Le profil électrophorétique de l’extrait brut d’anémone de mer est montré ici.L’extrait brut d’anémone de mer a été analysé par SDS-PAGE 15% gel de polyacrylamide et a montré des protéines de 10 kilodaltons à 250 kilodaltons de poids moléculaire. Ici, la voie 1 est l’échelle des protéines et la voie 2 est le venin d’anémone de mer. Des cytolysines ont été détectées dans la zone de poids moléculaire de 15 kilodaltons et 20 kilodaltons.On voit ici le test d’hémolyse dans les érythrocytes de moutons. L’activité hémolytique de l’extrait avant et pendant les cycles de congélation et de décongélation a augmenté jusqu’à ce que 100% d’hémolyse soit atteinte avec 50 microgrammes de protéine d’extrait brut total au cours des deux derniers cycles. La quantité nécessaire pour lyser 50% d’érythrocytes de mouton est de 11,1 à 0,3 microgrammes par millilitre.L’activité de la phospholipase a été détectée par la formation de halos clairs dans les zones de la plaque de gélose où l’échantillon d’extrait brut a été appliqué. Les résultats montrent la présence d’une activité de phospholipase à partir de 15 microgrammes de protéines totales. Le diamètre du halo augmentait en fonction de la dose, c’est-à-dire que si la quantité d’extrait brut augmentait, le diamètre du halo augmentait.Tout en essayant la procédure, assurez-vous d’induire la décharge de nématocyste, de quantifier la protéine totale, d’analyser l’extrait brut par électrophorèse SDS-PAGE, de calculer la quantité de protéine d’extrait brut pour produire 50% de l’hémolyse et d’utiliser différentes quantités de protéines dans le test de phospholipase. Nous pouvons analyser l’extrait brut par technique protéomique pour identifier les polypeptides d’une grande pertinence en biotechnologie et en biomédecine, même profiler et caractériser une molécule unique et ensuite la produire en laboratoire pour une application. Nous avons obtenu une partie de la séquence d’une protéine performante avec une activité antitumorale dans les cellules épithéliales du carcinome pulmonaire obdurique humain.De même, nous identifions la séquence des phospholipases d’intérêt biotechnologique.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Recherche

Biochimie

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