Name: identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays
Uploaded: 2022-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) mit der Fördernummer IT200819 unterstützt. Die Autoren danken Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC, für die Überprüfung der englischen Grammatik dieses Manuskripts; und die technische Hilfe von Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada) und Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). Wir danken auch Dr. Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) für die Gewinnung von Schafblut. Wir danken insbesondere Dr. José Saniger Blesa, ICAT-UNAM, für die Einrichtungen in seinem Labor für die Videoaufzeichnung.

Die Seeanemonen wurden nach Richtlinien der Nationalen Kommission für Aquakultur, Fischerei und Ernährung der mexikanischen Bundesregierung (Genehmigungsnummer PPF / DGOPTA 07332.250810.4060) gesammelt. Die Bioethikkommission des Instituts für Biotechnologie der Nationalen Autonomen Universität von Mexiko genehmigte alle Experimente mit Seeanemonen. Die Schafblutprobe wurde am Zentrum für praktische Lehre und Forschung in der Tierproduktion und -gesundheit (CEPIPSA, Nationale Autonome Universität von Mexiko) gekauf...

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterisation+of+proteins+with+cardiac+stimulatory+and+haemolytic+activity+from+the+anemone+Actinia+tenebrosa.">Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).</li><li>Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. 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Die hohe Nachfrage nach neuen Verbindungen mit Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Wissenschaft und Industrie hat zur Erforschung von Gift geführt. Venom stellt eine reiche Quelle von Molekülen dar, die als Vorlage für die Generierung neuer molekularer Werkzeuge dient. Die Komplexität dieser Gifte erfordert jedoch die Implementierung und Kombination verschiedener Methoden, um sie zu erhalten und zu untersuchen.
Hier zeigen wir eine Methode zur Gewinnung und Analyse des Giftes der <e...

Meerestiere sind eine reiche Quelle biologisch aktiver Verbindungen. In den letzten Jahrzehnten hat die Zusammensetzung des Seeanemonengifts wissenschaftliche Aufmerksamkeit erregt, da es eine Vielzahl von Polypeptiden mit hämolytischer, zytotoxischer, enzymatischer (Phospholipase, Protease, Chitinase) und neurotoxischer Aktivität und hemmenden Wirkungen auf die proteolytische Aktivitätumfasst 1. Darüber hinaus sind diese Polypeptide potenzielle Quellen für die Entwicklung molekularer Werkzeuge im biotechnologischen und therapeutischen Einsatz 2,3.
Es gibt nur wenige Berichte über Seeanemonengift und seine molekularen Komponenten aufgrund der Komplexität der Gewinnung des Giftes, sogar der Isolierung und Charakterisierung von Toxinen. Die in den Berichten verwendeten Extraktionsmethoden beinhalteten die Lyse und Entleerung des Inhalts von Zellen, die mit der Giftproduktion zusammenhängen und nicht damit zusammenhängen1.
Ein besonderes Merkmal bei allen Nesseltieren ist das Fehlen eines Systems zur Produktion und Freisetzung des Giftes, das in einer einzigen anatomischen Region zentralisiert ist. Stattdessen sind die Nematozysten Strukturen, die das Gift 4,5 halten. Andere Arten von Zellen, sogenannte epidermale Drüsenzellen, sezernieren ebenfalls Toxine und sind auch im ganzen Körper der Seeanemonenverteilt 6.
Die erste und wichtigste Herausforderung bei der Gewinnung des Giftes ist die Erzeugung eines Extrakts mit ausreichender Manipulation in nachfolgenden Prozessen, ohne die Inaktivierung oder den Abbau von labilen Proteinen. Als nächstes müssen die Zellen lysiert werden, und die Komponenten - in diesem Fall Polypeptide - müssen effizient und schnell extrahiert werden, wobei Proteolyse und Hydrolyse vermieden werden, während andere zelluläre Komponenten eliminiertwerden 7.
Verschiedene Methoden werden verwendet, um den Rohextrakt einer Seeanemone zu erhalten; Einige beinhalten das Opfern des Organismus, während andere es erlauben, ihn am Leben zu erhalten. Methoden, die die Verwendung des gesamten Körpers des Organismus implizieren, ermöglichen die Freisetzung der meisten Toxine aus dem Gift8, verglichen mit Methoden, die Organismen am Leben erhalten, die nur einige Bestandteile des Giftesextrahieren 9. Die Herstellung eines Extrakts erfordert die Bewertung des Vorhandenseins und der Wirksamkeit einer Substanz von Interesse durch einen spezifischen Bioassay, der Strategien zur Beobachtung der pharmakologischen Wirkungen durch In-vivo- oder In-vitro-Methoden 10 umfasst.
Seeanemonengift enthält zytolytische Polypeptide, porenbildende Toxine (PFTs)11 und Phospholipasen12; Diese Moleküle sind Modelle bei der Untersuchung der Protein-Lipid-Interaktion, molekulare Werkzeuge in der Krebstherapie und Biosensoren auf der Grundlage von Nanopore3. Die Klassifizierung von Seeanemonen-PFTs erfolgt nach ihrer Größe oder ihrem Molekulargewicht, von 5 kDa bis 80 kDa. Das 20 kDa PFT, das am meisten untersuchte und als Actinoporine11 bekannte PFT, ist von besonderem Interesse wegen seines biomedizinischen Potenzials bei der Entwicklung molekularer Werkzeuge für mögliche Anwendungen wie krebshemmende, antimikrobielle und nanoporenbasierte Biosensoren. Ein anderes Cytolysin, einschließlich Phospholipasen, insbesondere Phospholipase A2 (PLA2)13, setzt eine Fettsäure frei und hydrolysiert Phospholipide, wodurch die Zellmembran destabilisiert wird. Aufgrund dieses Wirkmechanismus verspricht PLA2 ein wesentliches Modell für die Erforschung und Anwendung bei entzündlichen Erkrankungen zu sein. Es könnte als Modell für Untersuchungen des Lipidverhaltens in der Zellmembrandienen 14.
Hier beschreiben wir ein effizientes Protokoll zur Gewinnung des Rohölextrakts aus der Seeanemone Anthopleura dowii Verrill, 1869, und zum Nachweis von Hämolysinen und Phospholipasen. Beide sind relevante Toxine, die als Vorlage für die Entwicklung neuer molekularer Werkzeuge verwendet werden könnten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B75808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoetanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9515-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assays</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 96 well, V-bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear flat.bottom 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1916-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ductless Enclosure</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Vertical</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ</td>
			<td>Bio Rad.</td>
			<td></td>
			<td>Gel Documentation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Software)</td>
			<td>NIH, USA</td>
			<td>Version 1.53c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 211</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5211 DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9049-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN tetra cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3824-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3818-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td></td>
			<td>version 9</td>
			<td>To design the plot with sigmoidal adjustments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman kit</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast mini gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3646-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>G10S UV-VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt Power Supply</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PS300B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays

Die Zusammensetzung des Seeanemonengifts umfasst Polypeptid- und Nichtproteinmoleküle. Zytolytische Komponenten haben ein hohes biotechnologisches und biomedizinisches Potenzial für die Entwicklung neuer molekularer Werkzeuge. Seeanemonengift lokalisiert sich in Drüsenzellen aus Ektoderm und subzellulären Strukturen, die Nematozysten genannt werden, die beide im gesamten Meeresanemonenkörper verteilt sind. Diese Eigenschaft bringt Herausforderungen mit sich, da die Zellen und die Nematozyste lysiert werden müssen, um die Giftkomponenten mit anderen ungiftigen Molekülen freizusetzen. Daher wird das Gift zunächst aus einem Rohextrakt (Mischung aus verschiedenen und vielfältigen Molekülen und Gewebeablagerungen) gewonnen. Der nächste Schritt besteht darin, Polypeptide mit spezifischen Bioaktivitäten nachzuweisen. Hier beschreiben wir eine effiziente Strategie zur Gewinnung des Ozeananemonen-Rohölextrakts und des Bioassays, um das Vorhandensein von Cytolysinen zu identifizieren. Der erste Schritt beinhaltet kostengünstige und unkomplizierte Techniken (Rühr- und Frost-Tau-Zyklus) zur Freisetzung von Cytolysinen. Wir erhielten die höchste zytolytische Aktivität und das höchste Protein (~ 500 mg Protein aus 20 g Trockengewicht). Als nächstes wurde die Polypeptidkomplexität des Extrakts durch SDS-PAGE-Gel analysiert, das Proteine mit Molekulargewichten zwischen 10 kDa und 250 kDa nachweist. Im hämolytischen Assay verwendeten wir rote Blutkörperchen von Schafen und bestimmten HU50 (11,1 ± 0,3 μg/ml). Im Gegensatz dazu wurde das Vorhandensein von Phospholipasen im Rohextrakt unter Verwendung von Eigelb als Substrat in einem festen Medium mit Agarose bestimmt. Insgesamt verwendet diese Studie ein effizientes und kostengünstiges Protokoll zur Herstellung des Rohextrakts und wendet replizierbare Bioassays an, um Cytolysine, Moleküle mit biotechnologischen und biomedizinischen Interessen, zu identifizieren.

Die repräsentativen Ergebnisse des Protokolls, das zur Gewinnung des Rohölextrakts aus Seeanemone verwendet wurde, zeigten, dass die Kombination von zwei Techniken (Rühren und Zyklen des Einfrierens und Auftauens) zu einer effizienten Entladung von Nematozysten führte und die Gesamtmenge an Protein 500 mg (8 mg / ml) betrug (Abbildung 3).
Die Proteinkomplexität des Rohextrakts konnte von 10 kDa und größer als 250 kDa durch SDS-PAGE-Elektrophorese beobachtet...

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Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Gewinnung von Rohgiftextrakt aus Seeanemone und zum Nachweis seiner hämolytischen und Phospholipase-Aktivität.

Identifizierung der hämolytischen und Phospholipase-Aktivität in Rohextrakten aus Seeanemonen durch einfache Bioassays

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

Die Interaktion mit Seeanemonentoxin muss die geringste Anzahl von Organismen und effiziente Protokolle verwenden, um eine große Vielfalt und Fülle der Toxine und eine schnelle Identifizierung eines bestimmten Toxins zu erhalten. Wir kombinierten zwei effiziente Techniken, um den Rohextrakt mit einer hohen Menge an Protein herzustellen und reproduzierbare, spezifische, schnelle und kostengünstige Assays zu beschreiben, um Hämolyse und phospholische Basen im Seeanemonengift zu identifizieren. Die Methode kann in fast jedem Beispiel verwendet werden, das entschieden wird, um eine oder beide Arten von Cytolysinen zu identifizieren.Die Effizienz der Methode wird erreicht, indem bei der Zubereitung des Rohextrakts auf die Zeiten in jedem Schritt geachtet wird. Der Schlüssel zur Hämolyse ist die sorgfältige Handhabung des Erythrozyten, um eine mechanische Lyse zu vermeiden, und bei der Phospholyseuntersuchung die Pflege der Temperatur bei der Vorbereitung der Platte. Das Verfahren wird von Dr. Santos Ramirez-Carreto, der Biologin Sandra Salazar Garcia und dem Biologen Giovanni Macias Martinez aus meinem Labor demonstriert.Beginnen Sie mit der Reinigung der gesammelten Seeanemone A.doi mit destilliertem Wasser von Hand, um die großen Substratpartikel zu entfernen, die am Körper haften. Sofort die Organismen bei minus 80 Grad Celsius in einem Ultrafreezer für 72 Stunden einfrieren. Dann legen Sie die Organismen in spezielle Gläser zur Gefriertrocknung unter Lyophilisationsbedingungen für 48 Stunden.Für die Gewebehydratation rekonstituieren Sie 20 Gramm Trockengewicht lyophilisierter Organismen mit 60 Millilitern 50-Millimolar-Natriumphosphatpuffer und einer Inhibitor-Cocktailtablette. Rühren Sie die Probe in einem Magnetrührer 12 Stunden lang kontinuierlich bei etwa 800 U / min und vier Grad Celsius um. Nachdem Sie die Probe 12 Stunden lang bei minus 20 Grad Celsius eingefroren haben, um Zelllyse und Nematokzystenausfluss zu induzieren, stellen Sie den Behälter bei Raumtemperatur in Wasser, bis er bis zu 90% auftautWiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.Um den Extrakt zu klären, zentrifugieren Sie die Probe bei 25, 400 mal G für 40 Minuten bei vier Grad Celsius. Gewinnen Sie den Überstand zurück und zentrifugieren Sie ihn erneut. Wiederholen Sie den Schritt drei- bis viermal und stellen Sie den Überstand schließlich wieder her.Der gewonnene Überstand oder Rohextrakt enthält die Giftbestandteile und andere Zellmoleküle wie Lipide, Kohlenhydrate und Nukleinsäuren. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration des Rohextrakts mit einem handelsüblichen kolorimetrischen Assay-Kit von Bradford. Inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur ohne zu schütteln.Messen Sie dann die Absorption bei 595 Nanometern. Zeichnen Sie die Mittelwerte der BSA-Absorptionen der Probe auf und bestimmen Sie die Gleichung des Diagramms, wobei y die Absorption, m die Steigung der Linie, x die Proteinkonzentration und b die Ordinate des Ursprungs ist. Um den Rohextrakt zu analysieren, fügen Sie 30 Mikrogramm des Rohextrakts zu fünf Mikrolitern des Proteinladepuffers hinzu, um die Proteine zu denaturieren.Das endgültige Volumen muss weniger als 50 Mikroliter betragen. Führen Sie die Elektrophorese mit einer Konstante von 25 Milliampere für eine Stunde und 30 Minuten durch. Um die Diffusion der Gelproteine zu vermeiden, fügen Sie die Fixationslösung zu den Proteinen hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 40 Minuten mit Schütteln bei 80 U / min.Dekantieren Sie dann die Lösung und fügen Sie die Proteinvernetzungslösung hinzu. Inkubieren Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Schütteln bei 80 U / min. Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie das Gel mit 100 Millilitern destilliertem Wasser für fünf Minuten.Danach entfernen Sie das Wasser und wiederholen Sie diesen Vorgang viermal. Führen Sie die Proteinfärbung mit 50 Millilitern Coomassie Brilliant Blue R-250 gefilterter Lösung durch, die bei 60 U / min in einem Labor-Rotationsoszillator bei Raumtemperatur für 15 Minuten gerührt wird. Extrahieren Sie einen Milliliter Blut aus der Halsvene eines Schafes und entfernen Sie die Nadel aus der Spritze.Blut sofort in ein Röhrchen mit 50 Millilitern Alver-Lösung ablassen und bei 804 mal G fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 30 Milliliter Alver-Lösung hinzu, indem Sie ihn entlang der Innenwände des Schlauches schieben. Suspendieren Sie das Pellet langsam mit einer Pasteur-Kunststoffpipette und zentrifugieren Sie die Lösung erneut bei 804 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der Überstand geklärt ist. Halten Sie das Endvolumen der Alver-Lösung aufrecht, um eine Konzentration von etwa 2 Millionen Zellen pro Milliliter zu erreichen. Verwenden Sie dann eine Neubauer-Kammer oder ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen.Inkubieren Sie die Lösungsgemische für eine Stunde bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln und zentrifugieren Sie dann die Platte bei 804 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Stellen Sie den Überstand in einer weiteren 96-Well-Platte mit einem flachen Boden wieder her. Wenn der Rohextrakt Cytolysine enthält, werden Erythrozyten lysieren und Hämoglobin freisetzen.Lesen Sie die Absorption bei 415 Nanometern und berechnen Sie die Menge an Extrakt, die Hämolyse in 50% der Erythrozyten produziert. Erhöhen Sie die Menge an Meeranemonen-Rohölextrakt und entwerfen Sie das Diagramm mit sigmoidalen Anpassungen mit entsprechender Software. Waschen Sie ein Hühnerei mit 1% SDS in destilliertem Wasser und trennen Sie das Eigelb unter sterilen Bedingungen vom Eiweiß.Bereiten Sie die Lösungen A, B, C und D vor.Fügen Sie 500 Mikroliter Lösungen A und C zu Lösung B und 100 Mikroliter Lösung D hinzu.Mischen Sie sie und gießen Sie 25 Milliliter in jede Petrischale. Warten Sie, bis die Lösung unter sterilen Bedingungen erstarrt ist, und machen Sie mit einem dünnen Rohr Vertiefungen von etwa zwei bis drei Millimetern Durchmesser. Insgesamt 20 Mikroliter Phosphatpuffer als Negativkontrolle in eine Vertiefung und 20 Mikroliter einer bestimmten Phospholipase als Positivkontrolle in eine andere Vertiefung geben.Geben Sie verschiedene Mengen des Rohextraktproteins 5, 15, 25, 35 und 45 Mikrogramm in die verbleibenden Vertiefungen, jeweils in einem Endvolumen von 20 Mikrolitern. 20 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die repräsentativen Ergebnisse des Protokolls, das zur Gewinnung des Rohölextrakts aus Seeanemone verwendet wurde, zeigten, dass die Kombination von zwei Techniken, Bewegung und Zyklen des Einfrierens und Auftauens, zu einer effizienten Entladung von Nematozysten führte.Die Nematozyten vor und nach Reizen sind hier dargestellt. Der Nematozystentubuli ist in diesem Bild belichtet, was auf die Toxinfreisetzung hinweist. Das elektrophoretische Profil von Meeranemone-Rohextrakt ist hier dargestellt.Der Meeranemonen-Rohölextrakt wurde mit SDS-PAGE 15% Polyacrylamid-Gel analysiert und zeigte Protein von 10 Kilodalton bis 250 Kilodalton Molekulargewicht. Hier ist Spur 1 die Proteinleiter und Bahn 2 ist Seeanemonengift. Cytolysine wurden in der Molekulargewichtszone von 15 Kilodalton und 20 Kilodalton nachgewiesen.Hier ist der Hämolyse-Assay in Erythrozyten von Schafen gezeigt. Die hämolytische Aktivität des Extrakts vor und während der Gefrier- und Auftauzyklen nahm zu, bis in den letzten beiden Zyklen eine Hämolyse von 100% mit 50 Mikrogramm des gesamten Rohextraktproteins erreicht wurde. Die Menge, die benötigt wird, um 50% Schaferythrozyten zu lysieren, beträgt 11,1 0,3 Mikrogramm pro Milliliter.Die Phospholipase-Aktivität wurde durch die Bildung klarer Halos in den Bereichen der Agarplatte nachgewiesen, in denen die Rohextraktprobe aufgetragen wurde. Die Ergebnisse zeigen das Vorhandensein von Phospholipase-Aktivität aus 15 Mikrogramm Gesamtprotein. Der Durchmesser des Halos nahm dosisabhängig zu, das heißt, wenn die Menge an Rohextrakt zunahm, nahm der Durchmesser des Halos zu.Stellen Sie beim Ausprobieren des Verfahrens sicher, dass Sie Nematozystenentladung induzieren, das Gesamtprotein quantifizieren, Rohextrakt durch SDS-PAGE-Elektrophorese analysieren, die Menge an Rohextraktprotein berechnen, um 50% der Hämolyse zu produzieren, und verwenden Sie verschiedene Mengen an Protein im Phospholipase-Assay. Wir können den Rohextrakt mittels Proteomtechnik analysieren, um Polypeptide mit großer Relevanz in der Biotechnologie und Biomedizin zu identifizieren, sogar ein einzigartiges Molekül zu profilieren und zu charakterisieren und es dann im Labor für eine Anwendung herzustellen. Wir erhielten einen Teil der Sequenz eines ausführenden Proteins mit Antitumoraktivität in den menschlichen hartnäckigen Lungenkarzinom-Epithelzellen.Ebenso identifizieren wir die Sequenz von Phospholipasen von biotechnologischem Interesse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Forschung

Biochemie

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Definieren von Substratspezifität für Lipase und Phospholipase-Kandidaten

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Vorbereitung der Keratin-Hydrolysat aus Hühnerfedern und ihre Anwendung in der Kosmetik

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

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Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Die Bestimmung der Protease Spezifität im Maus-Gewebe extrahiert durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie: PH um Spezifität Änderungen führen zu manipulieren

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Die Identifizierung von Meerneunauge Pheromone mit Bioassay-geführte Fraktionierung

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Erkennung von Phospholipase C Aktivität im Gehirn Homogenat von der Honigbiene

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...